Выделение фрагментов функциональных белков и количественное определение их содержания в клетках и тканях человека и крысы

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биологические науки
Страниц:
118


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Проблема эндогенности. 8

Подготовка образца. 10Экстракция. 10Преципитационная очистка. 12Улътрафилътрация и диализ. 12Хроматографическая очистка. 13Твердофазная экстракция. 17Оптимизация процесса пробоподготовки. 18Биологические методы. 19иммунохимические методы. 20Методы с использованием антител. 20Радиорецепторный метод. 25хроматографические и смежные методы. 27Пептидомика. 38Заключение. 42РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 44Оценка стабильности пептидного состава ткани. 44Выделение эндогенных внутриэритроцитарных пептидов. 51Методика количественной оценки по площади пика. 61Выделение пептидов из экстрактов тканей крысы. 64Заключение. 91ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 96Анализ состава лизата эритроцитов человека. 96Получение биологического материала. 96Хроматографический анализ лизата. 96Первичная обработка биологического материала. 96Получение пептидной фракции. 97Хроматографический анализ пептидной фракции. 97Выделение пептидов. 98Выделение неокиоторфина. 99Количественная оценка. 99Масс-спектрометрический анализ. 99Установление структуры. 100Анализ состава экстрактов тканей крысы. 100Получение биологического материала. 100Экстракция. 100Первичное фракционирование. 101Хроматографический анализ. 101Количественная оценка. 102Масс-спектрометрический анализ. 102Установление структуры. 102ВЫВОДЫ. 103СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 104СПИСОК СОКРАЩЕНИЙPMSF ФенилметилсульфонилфторидTLCK Na-Тозил-Ь-лизин хлорометилкетонEDTA Этилендиаминтетрауксусная кислотаоф-ВЭЖХ Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматографияVIP Вазоактивный интестинальный пептидсм- КарбоксиметилDEAE- ДиэтиламиноэтилSP- СульфопропилQAE- Диэтил-(2-гидроксипропил)аминоэтилa-ANP Атриальный натриуретический пептид альфаQMA Четвертичный метиламмонийРИА Радиоиммунный анализSP Вещество РРРА Радиорецепторный анализDAGO Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-олDADLE Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Gly-D-LeuАКТГ Адренокортикотропный гормонВЭКЭ Высокоэффективный капиллярный электрофорезLH-RH ЛюлиберинФИТЦ ФлуоресцеинизотиоцианатPBS Изотонический фосфатный буферАсОН Уксусная кислотаTFA Трифторуксусная кислотаTOFNCBInrMW MSMS/MS GuaHClБаза данных белковых структур Национального центра биотехнологической информации, СШАМолекулярная массаМасс-спектрометрияМасс-спектрометрия вторичных ионовГуанидин-гидрохлоридВВЕДЕНИЕИсследования состава низкомолекулярных фракций экстрактов тканей млекопитающих и демонстрация наличия биологической активности у отдельных компонентов привели к формированию концепции пептидного профиля ткани [1], тканеспецифичного пептидного пула [2], или пептидома, как логического расширения понятия протеома [3]. Показано, что основными компонентами пептидома являются фрагменты функциональных белков, некоторые из которых способны проявлять эффекты, аналогичные действию гормонов и нейромедиаторов [4]- для многих из них показана способность влиять на пролиферацию опухолевых клеток [5]. Предполагаемой функцией пептидных комплексов в организме является поддержание тканевого гомеостаза [2, 6]. Количественное исследование пептидного состава тканей, биологических жидкостей и культур клеток актуально, т.к. является первым и основным шагом к пониманию механизмов формирования пептидома, а также к оценке биологической роли эндогенных фрагментов функциональных белков как в индивидуальном плане, так и в составе пептидных комплексов.

Целью данной работы является исследование состава низкомолекулярных фракций лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на наличие в них пептидных компонентов, подтверждение их эндогенпости, оценка уровня их содержания и установление первичной структуры. В рамках данной работы первые было проведено полное исследование пептидного состава лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы с практическим подтверждением эндогенности идентифицированных компонентов. Полученные результаты позволили сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома и изменения его состава в ответ на изменение состояния ткани. Кроме того, на основании полученных результатов была разработана методика приблизительной количественной оценки содержания преобладающих пептидных компонентов в сложных смесях, не требующая их глубокой очистки. Методика основана на определении площадей хроматографических пиков и обеспечивает точность, достаточную для оценки возможной биологической роли анализируемых компонентов.

ВЫВОДЫ

1. Исследована стабильность пептидного состава лизата эритроцитов человека и гомогената тканей крысы в различных условиях. Сформулированы принципы пробоподготовки, исключающие появление артефактов.

2. Проведен полный скрининг низкомолекулярной фракции лизата эритроцитов человека на присутствие в нем преобладающих пептидных компонентов, установлена их первичная структура. На основании полученных данных сформулирован предполагаемый механизм эндогенной внутриэритроцитарной деградации гемоглобина.

3. Проведен количественный анализ преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов. На основании полученных данных предложен метод приблизительной количественной оценки содержания преобладающих компонентов в сложной смеси по площади соответствующих хроматографических пиков.

4. Проведен полный скрининг низкомолекулярных фракций экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на присутствие в них преобладающих пептидных компонентов, подтверждена их эндогенность, определена молекулярная масса и оценен уровень содержания в тканях.

5. Установлена первичная структура для части пептидов, выделенных из тканей крысы, как эндогенных, так и артефактов, образующихся в результате протеолитической деградации в гомогенате тканей в кислых условиях. На основании полученных данных сформулированы предполагаемые механизмы формирования пептидома ткани, поддержания постоянства его состава и возникновения изменений.

Заключение

Проблема эндогенноети исследуемых веществ прямо или косвенно касается всех аспектов данной работы. Полученные в работе результаты показывают, что принятые для инактивации протеолиза меры (рН < 3. 5, ингибиторы) достаточны для предотвращения изменений в пептидном профиле ткани в процессе ее гомогенизации и экстракции пептидов. Тем не менее, в отношении проблемы эндогенноети данный подход имеет ряд очевидных ограничений.

Во-первых, невозможно полностью исключить образование наблюдаемых пептидов в процессе гомогенизации ткани под действием неких гипотетических короткоживущих (и потому не обнаруживаемых при сравнительном анализе образцов, приготовленных с разницей во времени инкубации) и нечувствительных к предложенному набору ингибиторов протеаз, активных при рН < 3. Хотя, согласно базе функциональных данных ферментов BRENDA (http: //www. brenda-enzymes. info) существование таких протеаз маловероятно.

Во-вторых, стабильность гомогенатов тканей в присутствии ингибиторов протеолиза строго показана лишь в отношении преобладающих пептидиых компонентов. Эндогенность минорных компонентов в рамках данного подхода гарантирована быть не может, и требует отдельного рассмотрения.

В третих, несмотря на принятые меры для предотвращения изменений пептидного состава тканей ex vivo (минимизация рабочей температуры и длительности процедур в операциях с интактной тканью), соответствие наблюдаемых пептидных профилей составу пептидома тканей in vivo следует считать лишь приблизительным или гипотетическим. Тем не менее, основываясь на известных данных о характерных скоростях посмертной генерации или деградации пептидов в тканях, присутствие преобладающих (по меньшей мере, наиболее представленных) пептидных компонентов в экстрактах тканей, процедура приготовления которых предусматривает инактивацию протеолитических ферментов, можно надежно экстраполировать к их присутствию в тканях in vivo в сопоставимых концентрациях.

Вообще говоря, проблема эндогенноети распадается на два аспекта, общий и частный. Если под общей эндогенностью понимать присутствие исследуемого вещества в организме в состоянии физиологической нормы при отсутствии внешних воздействий, то проблема не имеет строгого решения в силу недостаточной определенности этих понятий. В любом исследовании речь всегда идет о конкретном объекте (или наборе сходных объектов), находящихся в определенных условиях, то есть о частном случае физиологической нормы для данной группы организмов и данного набора внешних факторов. Проблема же частной эндогенности, если под эндогенностью понимать точное количественное соответствие между наблюдением исследуемого вещества в ходе анализа и его реальным присутствием в организме на момент анализа, также не имеет строгого решения: сам процесс анализа неизбежно влияет на состояние анализируемого объекта. Особенно это касается традиционно используемых инвазивных методов анализа, нарушающих связность объекта. Поскольку живой организм является гетерогенной и не равновесной, но квазиравновесной системой (т.е. локальный уровень содержания любого компонента определяется локальным равенством скоростей его образования из предшественников и распада на продукты), изоляция любой его части (или же прекращение жизнедеятельности организма) немедленно запускает процесс изменения уровней содержания компонентов.

Таким образом, эндогенность, как общая, так и частная, является абстрактным понятием, для которого возможна лишь та или иная степени приближения со стороны реальных результатов, последовательно от & laquo-менее эндогенных& raquo- к & laquo-более эндогенным& raquo- веществам. В случае общей эндогенности это достигается — в широком смысле -накоплением статистического материала. В случае частной — последовательным выявлением и компенсацией возможных путей изменения концентрации анализируемых веществ в ходе анализа. В обоих случаях важное значение имеет применение различных методических подходов: сопоставление результатов, полученных разными путями, делает более обоснованной экстраполяцию полученных реальных результатов к идеальному состоянию.

Следует, однако, учитывать, что результаты пептидомных исследований критически зависят от процедур, применяемых в ходе пробоподготовки и анализа, что затрудняет корректное накопление статистических данных и прямое сопоставление результатов, полученных в разных исследованиях. Сколь бы ни были стандартизованы системы подготовки образцов, их неизбежные индивидуальные различия могут сказаться на результатах одновременного анализа большого числа веществ, хотя бы в отношении некоторых из них. Строгая стандартизация аналитических систем также невозможна: сочетание высокой эффективности разделения (совершенно необходимой при одновременном анализе большого числа веществ) и неизбежных индивидуальных различий в селективности (как результата интерференции различий аналитических систем с различиями объектов анализа) приводит к слабой воспроизводимости результатов, получаемых в однотипных аналитических системах для однотипных объектов. Тем не менее, в последнее время уделяется много внимания унификации методических подходов и технических средств в рамках крупных международных пептидомных проектов.

В рамках данной работы описан один из этапов приближения к эндогенности — компенсация изменений пептидного состава биологического образца в процессе кислотной экстракции пептидов. Выявлен механизм уменьшения степени эндогенности (активация кислых протеаз и приведение их в контакт с субстратом в гомогенате), предложен способ его компенсации (ингибиторы), проверена его эффективность (результаты сравнительного анализа), получены новые, & laquo-более эндогенные& raquo- результаты. С опорой на справочные данные (база данных функциональных характеристик протеолитических ферментов), результаты изучения пептидного состава экстрактов тканей крысы экстраполированы к эндогенности на уровне замороженного образца ткани. С опорой на литературные данные [7−13], эти результаты частично экстраполированы далее, к частной эндогенности in vivo в среднем для данной группы животных.

Кроме того, сопоставление & laquo-более эндогенных& raquo- и & laquo-менее эндогенных& raquo- результатов, выявившее определенное сходство между двумя наборами пептидов, как качественное (структурные группы, преобладание гемоглобина), так и количественное (доля пептидного материала ~ 0. 1% от веса сырой ткани, число преобладающих компонентов ~ 100, уровень их содержания ~ 100 пмоль/г — 10 нмоль/г) не противоречит выдвинутой ранее гипотезе о биологической роли пептидома (поддержание тканевого гомеостаза путем буферизации совокупной биологической активностью индивидуальных компонентов пептидома, демпфирующей импульсное действие отдельных биологически активных факторов [2]).

Далее, в настоящей работе показано, что пептидные комплексы различных тканей на уровне преобладающих компонентов проявляют значительную степень сходства. С учетом того, что исследованные органы (мозг, сердце, легкие и селезенка крысы) крайне разнородны по природе образующих их тканей и, следовательно, гетерогенны на уровне клеточных популяций, можно предположить, что составы пептидомов органов, по крайней мере — на уровне преобладающих компонентов, не связан с их специфической функцией, но подчиняется общим для всего организма закономерностям. Данное обстоятельство существенно снижает информативность данных по составу пептндома органов с точки зрения изучения механизмов его формирования и функционирования, специфических для данного органа.

На уровне менее представленных компонентов состав пептидома демонстрирует значительно большую степень тканеспецифичности. Однако, как нам кажется, интерпретация этих данных с функциональной точки зрения была бы преждевременной. Для получения надежных количественных данных о концентрации минорных компонентов необходимы более строгие меры для контроля их эндогенности, исключающие образование артефактных пептидов в результате посмертной деградации пептидов в ткани в процессе пробоподготовки. Очевидно, что такие процессы должны сильнее сказаться на составе минорных, чем преобладающих компонентов. Кроме того, количественный анализ и идентификация огромного числа пептидов на уровне единиц пикомолей на грамм ткани и ниже требует более чувствительных и селективных методик, чем использованные в данной работе.

Результаты настоящего исследования приводят также к выводу, что для изучения механизмов образования и функционирования пептидома сложных объектов (ткань, орган) необходимо исследование пептидных комплексов в модельных системах, таких как культуры клеток и клеточные модели тканей с максимальной степенью гомогенности. Конечно, при таком подходе об эндогенности в вышеописанном смысле речь вообще не идет, и неизбежны определенные трудности при соотнесении полученных структур, равно как и их детектируемых концентраций, с процессами, происходящими в целых тканях (органах), то есть при взаимодействии пептидомов различных клеточных популяций. Тем не менее, регуляторные процессы, проходящие на уровне гомогенной ткани (равно как и внутри единичной клетки), в которые вовлечены компоненты протеомов, представляют самостоятельный интерес для определения роли компонентов пепетидома, а знание количественного и качественного состава пептидомов отдельных гомогенных тканей дает основания для экстраполяции этих данных на уровень пептидома органа в целом.

На основании полученных данных можно сделать следующее предположение: сумма пептидомов отдельных тканей (здесь под тканями понимается гомогенная клеточная популяция) приводит к образованию своеобразного & laquo-надпептидома»-, характерного для целого органа, состоящего из этих тканей, который вовлечен в регуляцию функционирования данного органа. Можно также предположить, что эта сумма не будет являться результатом механического сложения компонентов пептидомов, поскольку протеолитическая активность не может быть идентична в разных тканевых комплексах, составляющих орган, и взаимодействие пептидов, происходящих из одной ткани, с протеолитическими ферментами другой ткани будет приводить к значимым изменениям состава и содержания компонентов & laquo-надпептидома»-. В свою очередь, & laquo-надпептидомы»- органов составляют & laquo-сверхпептидом»- организма в целом, который вовлечен в глобальные регуляторные процессы на уровне организма и подчиняется тем же закономерностям в образовании и содержании своих компонентов по отношению к & laquo-надпептидомам»- органов, как и эти & laquo-надпептидомы»- по отношению к пептидомам составляющих органы тканей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Анализ состава лизата эритроцитов человека

Получение биологического материала

Венозная донорская кровь была получена в Гематологическом научном центре РАМН. Образцы крови (20−25 мл) помещали в пробирки с цитратом (10 г/л безводной лимонной кислоты в буфере PBS, рН 4. 5, конечная концентрация цитрата 0. 25%). Клетки отделяли от плазмы центрифугированием (15 мин, 1000 об/мин, 0−4& deg-С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США). Осадок 4 раза промывали 0. 9% NaCl с последующим центрифугированием в тех же условиях. Лизат эритроцитов получали последовательной заморозкой-разморозкой эритроцитарпой массы согласно [143].

Хроматографический анализ лизата

Для анализа образцов лизата эритроцитов (5 мкл) использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Vydac protein С4 4. 6×250 мм (Vydac, США) в линейном градиенте ацетонитрила (16−56% за 100 мин при скорости элюции 0. 75 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. При разделении (здесь и далее) использовалась ВЭЖХ-система Waters (США), состоящая из двух насосов модели 510, градиентного контроллера модели 680 и оптического детектора модели 481. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению па 226 нм, запись осуществлялась в цифровом формате с помощью аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения МультиХром-Спектр версии 2. 67 (Ampersand, Россия). Интенсивность регистрируемого сигнала в 1 В соответствовала поглощению в 1 оптическую единицу.

Первичная обработка биологического материала

Лизат эритроцитов разбавлялся 4: 100 водой в присутствии 10'6 М пепстатина и 10° М PMSF, и центрифугировался с помощью микроцентрифуги Biofuge В (Heraeus, Германия) при 11 000 об/мин в течение 20 мин. Затем пептидно-белковый материал осаждался добавлением к надосадочной жидкости 10 объемов холодного (-20& deg-С) ацетона с последующим перемешиванием и инкубированием в течение 6 ч при -70& deg-С. Осадок отделялся мягким центрифугированием (10 мин, 600 об/мин, 0−4& deg-С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США) и ресуспендировался в прежнем объеме холодного ацетона. Диссоциация гема и перевод его в раствор вызывалась добавлением 2% 12 N НС1 [154]. Осадок отделялся центрифугированием (10 мин, 2500 об/мин, 0−4& deg-С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США), дважды промывался холодным ацетоном и высушивался с помощью вакуумного концентратора (SpeedVac Plus SC 210А, Savant, США).

Получение пептидной фракции

На этапе выделения основных пептидных компонентов материал, полученный из 120 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 1.2 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10"6 М пепстатина и 10~3 М PMSF, и подвергался препаративному разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 7Cg 20×250 мм (Macherey-Nagel, Германия), ступенчатая элюция (8% ацетонитрила — нанесение и промывка, 40% ацетонитрила — элюция пептидной фракции, 10 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Собранная пептидная фракция лиофилизовалась (лиофильная сушка FreeZone 6, Labconco, США).

На этапе выделения минорных пептидных компонентов материал, полученный из 660 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 6 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10"6 М пепстатина и 10″ М PMSF, и подвергался препаративному разделению (5 нанесений по 1200 мкл раствора образца) с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 7Cs 20×250 мм, градиентная элюция (8% ацетонитрила — 25 мин, 8−40% ацетонитрила — 20 мин, 40% ацетонитрила — 20 мин, 40−80% ацетонитрила — 5 мин- 10 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Детекция по оптическому поглощению при 226 им. Собирались две пептидные фракции в соответствии с профилем элюции: фракция 1 содержала вещества, элюирующиеся раньше преобладающих пептидных компонентов, фракция 2 соответствовала области элюции преобладающих компонентов. Соответствующие фракции по 5 разделениям объединялись и лиофилизовались.

Хроматографический анализ пептидной фракции

Для анализа преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Vydac protein С4 4. 6×250 мм в линейном градиенте ацетонитрила (20−60% за 80 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Для анализа минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся раньше преобладающих компонентов, использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120−5Cg 4. 0×250 мм (Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (8−60% за 105 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Для анализа минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся позже преобладающих компонентов, использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Dionex-Vydac ЗОО-5С4 4. 6×250 мм (Vydac, США) в линейном градиенте ацетонитрила (28−68% за 80 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Выделение пептидов

Для выделения преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Vydac protein С4 (4. 6×250 мм), линейный градиент ацетонитрила (20−52% за 30 мин, 1 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4. 5- (2) колонка Nucleosil 120−5Cg (4. 0×250 мм), линейный градиент ацетонитрила (20−60% за 30 мин, 1 мл/мин), 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, полученные на второй стадии, высушивались с помощью вакуумного концентратора. Высушенные образцы хранились при -70& deg-С.

Для выделения минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся раньше преобладающих компонентов, фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Nucleosil 120−5Cg (4. 0×250 мм), линейный градиент ацетонитрила (8−40% за 30 мин, 1 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4. 5- (2) колонка Nucleosil 100−5Cis 4. 0×250 мм (Macherey-Nagel, Германия), линейный градиент ацетонитрила (8−48% за 30 мин, 1 мл/мин), 0. 1% TFA. Для выделения минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся позже преобладающих компонентов, фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Dionex-Vydac ЗОО-5С4 4. 6×250 мм, линейный градиент ацетонитрила (24−56% за 45 мин, 0.7 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4. 5- (2) колонка Dionex-Vydac 300−5 Diphenyl 4. 6×250 мм (Vydae, США), линейный градиент ацетонитрила (20−60% за 40 мин, 0. 75 мл/мин), 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, полученные на второй стадии, высушивались с помощью вакуумного концентратора. Высушенные образцы хранились при -70& deg-С.

Выделение неокиоторфина

Материал, полученный из 300 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 1 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10″ М пепстатина и

10"J М PMSF, и подвергался препаративному разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120−7Cib 10×250 мм (Macherey-Nagel, Германия), ступенчатая элюция (0% ацетонитрила -нанесение и промывка, 20% ацетонитрила — элюция фракции, содержащей неокиоторфин- скорость элюции 2.5 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Собранная фракция лиофилизовалась.

Материал полученной фракции подвергался разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 300−5C]g 4. 0×250 мм (Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (0−24% за 50 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Область элюции неокиоторфина определялась с помощью синтетического стандарта. Две фракции, перекрывающие область элюции неокиоторфина, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Количественная оценка

Содержание пептидов в биологическом материале оценивалось по площадям соответствующих хроматографических пиков и подтверждалось данными определения аминокислотной последовательности. Площади пиков определялись методом нормализации площадей с помощью программного обеспечения МультиХром-Спектр версии 2. 67 (Ampersand, Россия).

Масс-спектрометрический анализ

Молекулярные массы выделенных пептидов определялись с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Vision 2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания).

Установление структуры

Аминокислотные последовательности выделенных пептидов определялись с помощью газофазного секвенатора Model 447А (Applied Biosystems, США). Поиск белков-предшественников велся по базе данных NCBI nr (Национальный центр биотехнологической информации, США). Структура устанавливалась по сопоставлению аминокислотной последовательности и молекулярной массы.

Анализ состава экстрактов тканей крысы

Получение биологического материала

Крысы (Wistar, взрослые самки, 250−300 г, 10 животных) умерщвлялись декапитацией. Немедленно после умерщвления (в течение 1−2 мин) извлекались мозг (без мозжечка), сердце, легкие и селезенка, и замораживались в жидком азоте. Замороженные органы хранились при -70& deg-С в течение не более чем 1 недели.

Экстракция

Замороженные органы от 5 животных взвешивались (не допуская разморозки), механически измельчались на фрагменты, не превышающие ~5 мм по размеру, и помещались в стеклянный стакан, охлаждаемый на ледяной бане (0−4& deg-С). К измельченной ткани добавлялся заранее охлажденный экстрагирующий буфер, содержащий ингибиторы протеолитических ферментов (10% АсОН, 10'6 М пепстатин А, 10"4 М PMSF, 4 мМ EDTA, 0−4& deg-С, ингибиторы добавляются непосредственно перед экстракцией), в соотношении 10 мл буфера на 1 г ткани. Полученная смесь гомогенизировалась роторным гомогенизатором при 45 000 об/мин (VirTis, США) на ледяной бане (0−4& deg-С) в течение 1 мин. Гомогенат осветлялся центрифугированием (10 мин, 10 000 об/мин, 0−4& deg-С, центрифуга с охлаждением BR4i, ротор АВ 50.1 OA, Jouan, Франция), супернатант замораживался в круглодонной колбе с помощью жидкого азота и лиофилизовался (лиофильная сушка FreeZone б, Labconco, США). Лиофилизованный экстракт извлекался из колбы, растирался до однородности, взвешивался и хранился в герметичной упаковке при -70& deg-С.

Вторая партия образцов (замороженные органы от оставшихся 5 животных) готовилась аналогичным образом, но без использования ингибиторов протеолитических ферментов.

Первичное фракционирование

Навеска сухого экстракта, эквивалентная 3 г исходной ткани, растворялась в 10 мл 0.1 М АсОН в течение 10 мин при интенсивном встряхивании при комнатной температуре, суспензия осветлялась центрифугированием (11 ООО об/мин, 10 мин, Biofuge В, Heraeus, Германия), супернатант отделялся и разбавлялся добавлением 0.1 М АсОН до конечного объема 10 мл. Полученный образец подвергался разделению с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25sf (2.5×87 см), уравновешенной в 0.1 М АсОН, скорость элюции — 60 мл/ч, регистрация профиля элюции по оптическому поглощению на 226 нм. Сбор фракций осуществлялся по объему элюции, в соответствии с условиями, подобранными ранее [116]: 2. 5−4.5 кДа (1), 1. 5−2.5 кДа (2), 0. 2−1.5 кДа (3), менее 0.2 кДа и вещества, адсорбирующиеся на матрице геля (4). Собранные фракции замораживались в круглодонных колбах и лиофилизовались. Лиофилизованный материал фракций перерастворялся в 6 мл 0.1 М АсОН и высушивался в стеклянных пробирках с помощью вакуумного концентратора (SpeedVac Plus SC 210А, Savant, США). Высушенные образцы хранились при -70& deg-С.

Хроматографический анализ

Материал фракций растворялся в 750 мкл стартового хроматографического буфера (0. 1% TFA в воде), центрифугировался (11 000 об/мин, 10 мин, Biofuge В) и подвергался разделению с помощью офВЭЖХ на колонке Nucleosil 120−5Cg (4.0×250 мм, Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (0−60% за 120 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0. 1% TFA. При разделении использовалась ВЭЖХ-система Waters (США), состоящая из двух насосов модели 515, градиентного контроллера модели 680 и двухволнового оптического детектора модели 2487. Профили элюции регистрировались по оптическому поглощению на 226 и 280 нм, запись осуществлялась в цифровом формате с помощью аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения МультиХром для Windows версии 1.5 (Ampersand, Россия). Интенсивность регистрируемого сигнала в 1 В соответствовала поглощению в 1 оптическую единицу. Сбор элюируемого материала осуществлялся непрерывно в процессе анализа, вручную, с разделением на суб-фракции в соответствии с профилем элюции (т.е. так чтобы границы суб-фракций максимально соответствовали границам хроматографических пиков). Собранные образцы высушивались с помощью вакуумного концентратора и хранились при -70& deg-С.

Количественная оценка

Количество пептидного материала в суб-фракциях оценивалось по площади соответствующего хроматографического пика исходя из следующего соотношения: 1000 мВ*с площади пика соответствует 500 пмоль вещества. Площади пиков вычислялись автоматически программой МультиХром.

Масс-спектрометрический анализ

Молекулярные массы веществ, содержащихся в суб-фракциях, определялись с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonik, Германия).

Установление структуры

Аминокислотные последовательности пептидов устанавливались по спектрам вторичных ионов (MALDI-TOF/TOF). Спектры регистрировались с помощью масс-спектрометра Ultraflex, результаты анализировались с помощью программного обеспечения Mascot (Matrix Science, США). Поиск белков-предшественников велся по базе данных NCBI пг (Национальный центр биотехнологической информации, США) с ограничением на организм-источник (Rattus norvegicus).

ПоказатьСвернуть

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

Список литературы

1. Slemmon J.R., Wengenack Т.М., Flood D.G. Profiling of endogenous peptides as a tool for studying development and neurological disease. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 157 170.

2. Karelin A.A., Blishchenko E. Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation. FEBS Lett., 1998, v. 428, p. 7−12.

3. Ivanov, V.T. Peptidomics a logical sequel to proteomics? Int. J. Immunorehabilitation, 2000, v. 2, p. 90.

4. Nyberg F., Sanderson K., Glamsta E.L. The hemorphins: a new class of opioid peptides derived from the blood protein hemoglobin. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 147−156.

5. Ivanov V.T., Blishchenko E. Yu., Sazonova O.V., Karelin A.A. What to synthesize? From Emil Fischer to peptidomics. J. Pept. Sci., 2003, v. 9, p. 553−562.

6. Ivanov V.T., Yatskin O.N. Peptidomics: a logical sequel to proteomics. Expert Rev. Proteomics., 2005, v. 2, p. 463−473.

7. Slemmon J.R., Flood D.G. Profiling of endogenous brain peptides and small proteins: methodology, computer-assisted analysis, and application to aging and lesion models. Neurobiol. Aging, 1992, v. 13, p. 649−660.

8. Lorente J.A., Hernandez-Cueto C., Villanueva E. Postmortem stability of the rat atrial natriuretic peptide in blood and atrial tissue. Rev. Esp. Fisiol., 1989, v. 45, p. 127−130.

9. Beal M.F., Mazurek M.F., Lorenz L.J., Chattha G.K., Ellison D.W., Martin J.B. An examination of neuropeptide Y postmortem stability in an animal model simulating human autopsy conditions. Neurosci. Lett., 1986, v. 64, p. 69−74.

10. Richter W.O., Schwandt P. Postmortal degradation of neuropeptides in the neurohypophysis. Neuropeptides, 1983, v. 3, p. 379−386.

11. Sorensen K.V. Rapid post-mortem decomposition of the somatostatin cells in human brain. An immunohistochemical examination. Biomed. Pharmacother., 1984, v. 38, p. 458−461.

12. Lee C.M., Emson P.C., Iversen L.L. Chromatographic behaviour and post-mortem stability of somatostatin in the rat and mouse brain. Brain Res., 1981, v. 220, p. 159−166.

13. Ratter S.J., Ackland J., Corder R., Emson P., Rossor M., Tomlin S., Rees L.H. Stability of pro-opiocortin-related peptides in post-mortem mouse brain tissue. Neuroendocrinology, 1982, v. 35, p. 336−341.

14. Mathe A.A., Stenfors C., Brodin E., Theodorsson E. Neuropeptides in brain: effects of microwave irradiation and decapitation. Life Sci., 1990, v. 46, p. 287−293.

15. Roncales P., Cena P., Beltran J.A., Jaime I. Ultrasonication of lamb skeletal muscle fibres enhances postmortem proteolysis. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1993, v. 196, p. 339−342.

16. Correa F.M., Saavedra J.M. Radioimmunoassay of met-enkephalin in microdissected areas of paraformaldehyde-fixed rat brain. Life Sci., 1984, v. 34, p. 809−817.

17. Cooper P.E., Rahman Q., Phillips Т., Tu J. Postmortem stability of somatostatin in brain tissue. Neurochem. Res., 1988, v. 13, p. 513−515.

18. Herraiz T. Sample preparation and reversed phase-high performance liquid chromatography analysis of food-derived peptides. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 119−139.

19. Singh J.K., Diemel L.T., Willars G.B., Tomlinson D.R. The extraction and assay of substance P in the rat sciatic nerve. J. Neurosci. Methods, 1993, v. 47, p. 133−137.

20. Yamashita Y., Hoist Pedersen J., Stadil F. Extraction of neurotensin-like immunoreactivities from porcine ileal mucosa. Peptides, 1987, v. 8, p. 639−643.

21. Ryder S., Eng J., Straus E., Yalow R.S. Alkaline extraction and characterization of cholecystokinin-immunoreactivity from rat gut. Gastroenterology, 1981, v. 81, p. 267 275.

22. Marley P.D., Rehfeld J.F. Extraction techniques for gastrins and cholecystokinins in the rat central nervous system. J. Neurochem., 1984, v. 42, p. 1515−1522.

23. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin. Biochemistry, 1991, v. 30, p. 8824−8830.

24. Grigoriants O.O., Desiderio D.M. Beta-endorphinl-31 in the rat pituitary. Int. J. Pept. Protein Res., 1996, v. 47, p. 123−130.

25. Carraway R.E., Cochrane D.E., Ruane S.E. Isolation, structures, and biologic activity of neurotensin-related peptides generated in extracts of avian tissue. J. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 15 886−15 889.

26. Dahl J.L., Epstein M.L., Silva B.L., Lindberg I. Multiple immunoreactive forms of met-and leu-enkephalin in fetal and neonatal rat brain and in rat gut. Life Sci., 1982, v. 31, p. 1853−1856.

27. Carraway R.E. Rapid proteolytic generation of neurotensin-related peptide (s) and biologic activity during extraction of rat and chicken gastric tissues. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, p. 10 328−10 334.

28. Cerpa-Poljak A., Lahnstein J., Mason K.E., Smythe G.A., Duncan M.W. Mass spectrometric identification and quantification of hemorphins extracted from human adrenal and pheochromocytoma tissue. J. Neurochem., 1997, v. 68, p. 1712−1719.

29. Kreymann В., Ghatei M.A., Burnet P., Williams G., Kanse S., Diani A.R., Bloom S.R. Characterization of glucagon-like peptide-1-(7−36)amide in the hypothalamus. Brain Res., 1989, v. 502, p. 325−331.

30. Ueda S., Sudoh Т., Fukuda K., Kangawa K., Minamino N., Matsuo H. Identification of alpha atrial natriuretic peptide 4−28. and [5−28] in porcine brain. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1987, v. 149, p. 1055−1062.

31. Carraway R.E., Ferris C.F. Isolation, biological and chemical characterization, and synthesis of a neurotensin-related hexapeptide from chicken intestine. J. Biol. Chem., 1983, v. 258, p. 2475−2479.

32. Carraway R.E., Cochrane D.E., Mitra S.P. Xenopsin-related peptide generated in avian gastric extracts. Regul. Pept., 1988, v. 22, p. 303−314.

33. Matsumura Y., Kimura M., Kato H., Yamamoto Т., Maeda H. Quantification, isolation and structural determination of bradykinin and hydroxyprolyl-bradykinin in tumor ascites. Adv. Exp. Med. Biol., 1989, v. 247A, p. 587−592.

34. Stegehuis D.S., Tjaden U.R., van der Greef J. Bioanalysis of the peptide des-enkephalin-gamma-endorphin. On-line sample pretreatment using membrane dialysis and solid-phase isolation. J. Chromatogr., 1990, v. 511, p. 137−145.

35. Hubbard M.J. Rapid purification and direct microassay of calbindin9kDa utilizing its solubility in perchloric acid. Biochem. J., 1993, v. 293, p. 223−227.

36. Adelson J.W., Nelbach L., Yates G.B., Ehrlich A., Glaser C.B., Chang R. Purification and characterization of chymodenin, a hormone-like peptide from porcine duodenum. J. Biol. Chem., 1986, v. 261, p. 10 569−10 575.

37. Silberring J., Nyberg F. Rapid analysis of endogenous LVV-hemorphin-7 in cerebrospinal fluid by size-exclusion chromatography and electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1997, v. 777, p. 41−45.

38. Heine G., Raida M., Forssmann W. -G. Mapping of peptides and protein fragments in human urine using liquid chromatography mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1997, v. 776, p. 117−124.

39. Smyth D.G. Chromatography of peptides related to р-endorphin. Anal. Biochem., 1984, v. 136, p. 127−135.

40. Swann R.W., Li C.H. Isolation and characterization of beta-endorphin-like peptides from bovine brains. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, v. 77, p. 230−233.

41. Rosenquist G.L., Maruthainar K., Smyth D.G. р-endorphin is present in active and inactive forms in rat gastric antrum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, v. 134, p. 14−20.

42. James S., Gibbs B.F., Toney K., Bennett H.P. Purification of antimicrobial peptides from an extract of the skin of Xenopus laevis using heparin-affinity HPLC: characterization by ion-spray mass spectrometry. Anal. Biochem., 1994, v. 217, p. 8490.

43. Park C.B., Lee J.H., Park I.Y., Kim M.S., Kim S.C. A novel antimicrobial peptide from the loach, Misgurnus anguillicaudatus. FEBS Lett., 1997, v. 411, p. 173−178.

44. Herraiz Т., Casal V. Evaluation of solid-phase extraction procedures in peptide analysis. J. Chromatogr. A, 1995, v. 708, p. 209−221.

45. Bennett H.P. Use of ion-exchange Sep-Pak cartridges in the batch fractionation of pituitary peptides. J. Chromatogr., 1986, v. 359, p. 383−390.

46. Kai M., Ohkura Y. Liquid chromatography of peptides treated with fluorogenic reagents and its application to analyses of opioid peptides, their precursors and related enzymes in rat brain. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 103−117.

47. Sanderson K., Thornwall M., Nyberg G., Glamsta E. -L., Nyberg F. Reversed-phase high-performance liquid chromatography for the determination of haemorphin-like immunoreactivity in human cerebrospinal fluid. J. Chromatogr. A, 1994, v. 676, p. 155 160.

48. Kohse K.P., Feifel K., Wisser H. Quantitative determination of natriuretic peptides in human biological samples with a bioassay using cultured cells. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1992, v. 30, p. 837−845.

49. Liu В., Burbach J.P. Detection and high performance liquid chromatography identification of the summer rises of vasopressin and oxytocin immunoreactivity in the rat pineal gland. Endocrinology, 1987, v. 121, p. 1716−1720.

50. Pikula D.L., Harris E.F., Desiderio D.M., Fridland G.H., Lovelace J.L. Methionine enkephalin-like, substance P-like, and beta-endorphin-like immunoreactivity in human parotid saliva. Arch. Oral. Biol., 1992, v. 37, p. 705−709.

51. Zhu X., Desiderio D.M. Effects of space flight stress on proopiomelanocortin, proenkephalin A, and tachykinin neuropeptidergic systems in the rat posterior pituitary. Life Sci., 1994, v. 55, p. 347−350.

52. Grigoriants O.O., Pravdenkova S.V., Andersen B.J., Desiderio D.M. Alteration of opioid peptide concentrations in the rat pituitary following survivable closed head injury. Neurochem. Res., 1995, v. 20, p. 827−831.

53. Yamamoto H., Kato T. Enzyme immunoassay for cholecystokinin octapeptide sulfate and its application. J. Neurochem., 1986, v. 46, p. 702−707.

54. Rehfeld J.F., Goltermann N., Larsson L. -I., Emson P.M., Lee C.M. Gastrin and cholecystokinin in central and peripheral neurons. Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 1979, v. 38, p. 2325−2329.

55. Rehfeld J.F., Morley J.S. Residue-specific radioimmunoanalysis: a novel analytical tool. Application to the C-terminus of CCK/gastrin peptides. J. Biochem. Biophys. Methods, 1983, v. 7, p. 161−170.

56. Tinsley P.W., Fridland G.H., Killmar J.T., Desiderio D.M. Purification, characterization, and localization of neuropeptides in the cornea. Peptides, 1988, v. 9, p. 1373−1379.

57. Parris W.G., Tanzer F.S., Fridland G.H., Harris E.F., Killmar J., Desiderio D.M. Effects of orthodontic force on methionine enkephalin and substance P concentrations in human pulpal tissue. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop., 1989, v. 95, p. 479−489.

58. Higa Т., Wood G., Desiderio D.M. Substance P-like immunoreactivity in human cerebrospinal fluid. Int. J. Pept. Protein Res., 1989, v. 33, p. 446−451.

59. Desidero D.M. Analysis of endogenous neuropeptides by reversed-phase high-performance liquid chromatography and mass-spectrometry. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 85−102.

60. Davletov E.G., Kurochkin I.N., Zaitsev S.V. Radioreceptor method of determination of opioid peptides in the rat brain. Vopr. Med. Khim., 1988, v. 34, p. 136−138.

61. Liu D.X., Desiderio D.M. Measurement of dynorphins with 3H-etorphine and canine limbic system receptors. Neuropeptides, 1988, v. 12, p. 35−40.

62. Desiderio D.M., Fridland G.H., Francisco J.T., Sacks H., Robertson J.T., Cezayirli R.C., Killmar J., Lahren C. Opioid peptide profile in human pituitary. Clin. Chem., 1988, v. 34, p. 1104−1107.

63. Desiderio D.M., Cezayirli R.C., Fridland G., Robertson J.T., Sacks H. Metabolic profiling of radioreceptor-assayable opioid peptides in a human pituitary ACTH-secreting tumor. Life Sci., 1985, v. 37, p. 1823−1828.

64. Muhlbauer M., Metcalf J.C. Jr., Robertson J.T., Fridland G., Desiderio D.M. Opioid peptides in the cerebrospinal fluid of Alzheimer patients. Biomed. Chromatogr., 1986, v. l, p. 155−158.

65. Desiderio D.M., Onishi H., Fridland G., Wood G., Pagidipati D. HPLC receptorassay of opioid peptides in the cerebrospinal fluid of lower back pain patients. Biomed. Chromatogr., 1987, v. 2, p. 47−52.

66. Desiderio D.M., Liu D.X., Wood G. Opioid receptoractivity in CSF from an atypical lower back pain patient. Life Sci., 1988, v. 43, p. 577−583.

67. Liu D., Desiderio D.M. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic-radioreceptor assay of human cerebrospinal fluid neuropeptides. Maximizing recovery of picomoles of peptides and minimizing memory. J. Chromatogr., 1987, v. 422, p. 61−71.

68. Takeshita H., Desiderio D.M., Fridland G. Metabolic profiling of opioid peptides in canine pituitary and selected brain regions using HPLC with a radioreceptor assay detector. Biomed. Chromatogr., 1986, v. 1, p. 126−139.

69. Desiderio D.M., Tanzer F.S., Fridland G. Metabolic profiling of opioid peptides in tooth pulp by HPLC and radioreceptor assay. Neuropeptides, 1985, v. 6, p. 463−469.

70. Robinson Q.C., Killmar J.T., Desiderio D.M., Harris E.F., Fridland G. Immunoreactive evidence of beta-endorphin and methionine-enkephalin-Arg-Gly-Leu in human tooth pulp. Life Sci., 1989, v. 45, p. 987−992.

71. Nylander I., Tan-No K., Winter A., Silbcrring J. Processing of prodynorphin-derived peptides in striatal extracts. Identification by electrospray ionization mass spectrometry linked to size-exclusion chromatography. Life Sci., 1995, v. 57, p. 123−129.

72. Zhao Q., Piot J.M. Neokyotorphin formation and quantitative evolution following human hemoglobin hydrolysis with cathepsin D. Peptides, 1998, v. 19, p. 759−766.

73. Dizdaroglu M., Krutzsch H.C. Comparison of reversed-phase and weak anion-exchange high-performance liquid chromatographic methods for peptide separations. J. Chromatogr., 1983, v. 264, p. 223−229.

74. Miller C., Rivier J. Peptide chemistry: development of high performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis. Biopolymers, 1996, v. 40, p. 265 317.

75. Advis J.P., Hernandez L., Guzman N.A. Analysis of brain neuropeptides by capillary electrophoresis: determination of luteinizing hormone-releasing hormone from ovine hypothalamus. Pepet. Res., 1989, v. 2, p. 389−394.

76. Takahashi N., Ishioka N., Takahashi Y., Putnam F.W. Automated tandem high-performance liquid chromatographic system for separation of extremely complex peptide mixtures. J. Chromatogr., 1985, v. 326, p. 407−418.

77. Moore A.W. Jr., Jorgenson J.W. Rapid comprehensive two-dimensional separations of peptides via RPLC-optically gated capillary zone electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3448−3455.

78. Moore A.W. Jr., Jorgenson J.W. Comprehensive three-dimensional separation of peptides using size exclusion chromatography/reversed phase liquid chromatography/optically gated capillary zone electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3456−3463.

79. Dagouassat N., Garreau I., Sannier F., Zhao Q., Piot J.M. Generation of VV-hemorphin-7 from globin by peritoneal macrophages. FEBS Lett., 1996, v. 382, p. 37−42.

80. Fell A.F., Clark B.J., Scott H.P. Analysis and characterisation of aromatic amino acids, metabolites and peptides by rapid-scanning photodiode array detection in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1984, v. 297, p. 203−214.

81. Bennett G.W., Brazell M.P., Marsden C.A. Electrochemistry of neuropeptides: a possible method for assay and in vivo detection. Life Sci., 1981, v. 29, p. 1001−1007.

82. Sauter A., Frick W. Determination of neuropeptides in discrete regions of the rat brain by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr., 1984, v. 297, p. 215−223.

83. Dawson R. Jr., Steves J.P., Lorden J.F., Oparil S. Reverse-phase separation and electrochemical detection of neuropeptides. Peptides, 1985, v. 6, p. 1173−1178.

84. Timperman A.T., Oldenburg K.E., Sweedier J.V. Native fluorescence detection and spectral differentiation of peptides containing tryptophan and tyrosine in capillary electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3421−3426.

85. Ohno M., Kai M., Ohkura Y. On-line post-column fluorescence derivatization of arginine-containing peptides in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1987, v. 392, p. 309−316.

86. Desiderio D.M., Yamada S. Field desorption mass spectrometric measurement of picomole amounts of leucine enkephalin in canine spinal cord tissue. Biomed. Mass Spectrom., 1983, v. 10, p. 358−362.

87. Desiderio D.M., Katakuse I., Kai M. Measurement of leucine enkephalin in caudate nucleus tissue with fast atom bombardment-collision activated dissociation-linked field scanning mass spectrometry. Biomed. Mass Spectrom., 1983, v. 10, p. 426−429.

88. Simpson R.C., Emary W.B., Lys I., Cotter R.J., Fenselau C.C. High-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry and its application to peptide analyses. J. Chromatogr., 1991, v. 536, p. 143−153.

89. Perkins J.R., Tomer K.B. Characterization of the lower-molecular-mass fraction of venoms from Dendroaspis jamesoni kaimosae and Micrurus fulvius using capillary-electrophoresis electrospray mass spectrometry. Eur. J. Biochem., 1995, v. 233, p. 815 827.

90. Kuwahara H., Tanaka-Isoyama J., Kihara Т., Matsubae M., Matsui Y., Такао Т., Isoyama M., Minamino N. Efficient data acquisition system for peptidome database. Peptide Science 2003: M. Ueki (Ed.), The Japanese Peptide Society (2004), p. 465−466.

91. Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry. FEBS Lett., 2004, v. 567, p. 92−95.

92. Jurgens M., Schrader M. Peptidomic approaches in proteomic research. Curr. Opin. Mol. Ther,. 2002, v. 4, p. 236−241.

93. Clynen E., De Loof A., Schoofs L. The use of peptidomics in endocrine research. Gen. Сотр. Endocrinol., 2003, v. 132, p. 1−9.

94. Schulz-Knappe P., Zucht H.D., Heine G., Jurgens M., Hess R., Schrader M. Peptidomics: the comprehensive analysis of peptides in complex biological mixtures. Comb. Chem. High. Throughput Screen., 2001, v. 4, p. 207−217.

95. Kislinger Т., Rahman K., Radulovic D., Сох В., Rossant J., Emili A. PRISM, a Generic Large Scale Proteomic Investigation Strategy for Mammals. Mol. Cell. Proteomics, 2003, v. 2, p. 96−106.

96. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics, 2002, v. 2, p. 3−10.

97. Corthals G.L., Wasinger V.C., Hoehstrasser D.F., Sanchez J.C. The dynamic range of protein expression: a challenge for proteomic research. Electrophoresis, 2000, v. 21, p. 1104−1115.

98. Gygi S.P., Corthals G.L., Zhang Y., Rochon Y., Aebersold R. Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, v. 97, p. 9390−9395.

99. Domon В., Broder S. Implications of new proteomics strategies for biology and medicine. J. Proteome Res., 2004, v. 3, p. 253−260.

100. Mutt V. Recent developments in the chemistry of gastrointestinal peptides. Eur. J. Clin. Invest., 1990, v. 20 Suppl 1, p. S2−9.

101. Karelin A.A., Philippova M.M., Yatskin O.N., Kalinina O.A., Nazimov I.V., Blishchenko E. Yu., Ivanov V.T. Peptides comprising the bulk of rat brain extracts: isolation, amino acid sequences and biological activity. J. Pept. Sci., 2000, v. 6, p. 345 354.

102. Che F.Y., Yan L., Li H., Mzhavia N., Devi L.A., Fricker L.D. Identification of peptides from brain and pituitary of Cpe (fat)/Cpe (fat) mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001, v. 98, p. 9971−9976.

103. Skold K., Svensson M., Kaplan A., Bjorkesten L., Astrom J., Andren P.E. A neuroproteomic approach to targeting neuropeptides in the brain. Proteomics, 2002, v. 2, p. 447−454.

104. Quadroni M., Ducret A., Stocklin R. Quantify this! Report on a round table discussion on quantitative mass spectrometry in proteomics. Proteomics, 2004, v. 4, p. 2211−2215.

105. Russell R.B. Genomics, proteomics and bioinformatics: all in the same boat. Genome Biol., 2002, v. 3, REPORTS 4034.

106. Ivanov V.T., Blishchenko E. Yu., Sazonova O.V., Karelin A.A. What to synthesize? From Emil Fischer to peptidomics. J. Pept. Sci., 2003, v. 9, p. 553−562.

107. Villanueva J., Philip J., Entenberg D., Chaparro C.A., Tanwar M.K., Holland E.C., Tempst P. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem., 2004, v. 76, p. 15 601 570.

108. Bergquist J., Ekman R. Future aspects of psychoneuroimmunology lymphocyte peptides reflecting psychiatric disorders studied by mass spectrometry. Arch. Physiol. Biochem., 2001, v. 109, p. 369−371.

109. Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A., Levine P.J., Fusaro V.A., Steinberg S.M., Mills G.B., Simone C., Fishman D.A., Kohn E.C., Liotta L.A. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 2002, v. 359, p. 572−577.

110. Baggerman G., Verleyen P., Clynen E., Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L., Peptidomics. J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, v. 803, p. 316.

111. Clynen E., Huybrechts J., Baggerman G., Van Doom J., Van Der Horst D., De Loof A., Schoofs L. Identification of a glycogenolysis-inhibiting peptide from the corpora cardiaca of locusts. Endocrinology, 2003, v. 144, p. 3441−3448.

112. Clynen E., Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L. Mass spectrometric analysis of the perisympathetic organs in locusts: identification of novel periviscerokinins. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2003, v. 300, p. 422−428.

113. Huybrechts J., Nusbaum M.P., Bosch L.V., Baggerman G., De Loof A., Schoofs L. Neuropeptidomic analysis of the brain and thoracic ganglion from the Jonah crab, Cancer borealis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, v. 308, p. 535−544.

114. Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L. Diapausing Colorado potato beetles are devoid of short neuropeptide F I and II. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, v. 317, p. 909 916.

115. Chei F.Y., Eipper B.A., Mains R.E., Fricker L.D. Quantitative peptidomics of pituitary glands from mice deficient in copper transport. Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand)., 2003, v. 49, p. 713−722.

116. Verhaert P., Uttenweiler-Joseph S., de Vries M., Loboda A., Ens W., Standing K.G., Matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry: an elegant tool for peptidomics. Proteomics, 2001, v. 1, p. 118−131.

117. Galoyan A.A. Primary structure and biological activity of hemoglobin-related hypothalamic peptides. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 135−137.

118. Petrov R.V., Mikhailova A.A., Fonina L.A. Bone marrow immunoregulatory peptides (myelopeptides): isolation, structure, and functional activity. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 139−146.

119. Ivanov V.T., Karelin A.A., Nazimov I.V., Pletnev V.Z. Hemoglobin as a source of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 171−188.

120. Karelin A.A., Philippova M.M., Karelina E.V., Strizhkov B.N., Grishina G.A., Nazimov I.V., Ivanov V.T. Peptides from bovine brain: structure and biological role. J. Pept. Sci., 1998, v. 4, p. 211−225.

121. Karelin A.A., Philippova M.M., Ivanov V.T. Proteolytic degradation of hemoglobin leads to biologically active peptides. Peptides, 1995, v. 16. p. 693−697.

122. Карелин А. А., Филиппова M.M., Яцкин O.H., Блищенко Е. Ю., Назимов И. В., Иванов В. Т. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов. Биоорганическая химия, 1998, т. 24, с. 271−281.

123. Yamamoto К., Ueno Е., Uemura Н., Kato Y. Biochemical and immunochemical similarity between erythrocyte membrane aspartic proteinase and cathepsin E. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, v. 148, p. 267−272.

124. Yonezawa S., Nakamura K. Species-specific distribution of cathepsin E in mammalian blood cells. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1073, p. 155−160.

125. Ueno E., Sakai H., Kato Y., Yamamoto K. Activation mechanism of erythrocyte cathepsin E. evidence for the occurrence of the membrane-associated active enzyme. J. Biochem. (Tokyo), 1989, v. 105, p. 878−882.

126. Arnold D., Keilholz W., Schild H., Dumrese Т., Stevanovic S., Rammensee H.G. Substrate specificity of cathepsins D and E determined by N-terminal and C-terminal sequencing of peptide pools. Eur. J. Biochem., 1997, v. 249, p. 171−179.

127. Blishchenko E. Yu., Mernenko O.A., Yatskin O.N., Ziganshin R.H., Philippova M.M., Karelin A.A., Ivanov V.T. Neokyotorphin and neokyotorphin (1−4): secretion by erythrocytes and regulation of tumor cell growth. FEBS Lett., 1997, v. 414, p. 125−128.

128. Piszkiewicz D., Landon М., Smith E.L. Anomalous cleavage of aspartyl-proline peptide bonds during amino acid sequence determinations. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, v. 40, p. 1173−1178.

129. Weatherall D.J., Clegg J.B., Naughton M.A. Globin synthesis in thalassaemia: an in vitro study. Nature, 1965, v. 208. p. 1061−1065.

Заполнить форму текущей работой