Влияние интеграций LTR эндогенных ретровирусов на экспрессию соседних генов

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биологические науки
Страниц:
121


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Около половины генома человека состоит из повторяющихся элементов [1], большинство из которых ретроэлементы (РЭ) — мобильные элементы, распространяющиеся в геноме клетки-хозяина с помощью ретротранспозиции, процесса, заключающегося в обратной транскрипции генома РЭ и реинтеграции синтезированной кДНК в геном клетки-хозяина.

Среди ретроэлементов на долю разных семейств HERV и одиночных LTR приходится около 8% генома человека [2], причем преобладают одиночные полноразмерные LTR. Их появление в геноме можно объяснить рекомбинацией между 5' LTR и 3' LTR полноразмерного провируса, вследствие чего на месте его интеграции остается одиночный LTR. Для семейства HTDV/HERV-K предполагаемое число одиночных LTR составляет несколько тысяч копий на геном [3−11].

При интеграции в геном мобильные элементы могут нарушать экспрессию каких-либо генов, способны изменять регуляторные участки генов, участвовать в процессах репарации ДНК и сплайсинге, в перестройке хроматина и т. д. Будучи мобильными переносчиками транскрипционных регуляторных элементов, РЭ могут влиять на экспрессию генов клетки-хозяина, предоставляя им различные регуляторные последовательности, входящие в их состав. Потенциальная возможность влиять на регуляцию генов, особенно генов, вовлеченных в эмбриональное развитие, делает РЭ подходящими кандидатами на участие в процессах видообразования. У молодых в эволюционном отношении генов, например таких, как гены, вовлеченные в иммунитет или гены ответа на внешние раздражители, мРНК значительно обогащены РЭ по сравнению с мРНК высоко консервативных генов, задействованных в развитии или обмене веществ [12]. Внедрение LTR рядом с каким-либо геном может к имеющейся тканеспецифичности экспрессии добавить способность экспрессироваться еще в одной ткани, где продукт гена оказывается выгодным по той или иной причине. Однако, очень сложно доказать, что ген приобретает новую регуляторную особенность именно благодаря интеграции ретроэлемента, а не благодаря сопутствующим событиям, которые находятся вне поля зрения исследователя. Одним из путей, способным решить эту проблему, может быть сравнительный анализ транскрипции членов одного и того же семейства генов, которые были недавно дуплицированы в процессе эволюции. Будучи близкими по структуре, такие гены могут различаться по интеграции ретроэлементов. В этом случае гены, в одних и тех же клетках с одним и тем же набором транскрипционных факторов и других модуляторов их активности, могут различаться своим функциональным поведением в зависимости от присутствия в их составе РЭ.

Настоящая работа посвящена изучению влияния интеграции LTR HERV-K на регуляцию экспрессии генов человека и является частью комплексных исследований, проводимых Лабораторией Структуры и Функций Генов Человека, посвященных влиянию повторяющихся элементов на функционирование геномов человека и других видов приматов.

В процессе проведения данной работы впервые было найдено и описано семейство генов, некоторые члены которого различаются между собой интеграцией LTR HERV-K в один из интронов. Среди данного семейства выделяется подсемейство, представляющее собой уникальную природную модель, поскольку в него входят гены, практически идентичные по структуре, но различные по присутствию LTR HERV-K. Это позволило провести сравнение транскрипционной активности LTR-содержащих и LTR-не содержащих генов в одних и тех же условиях

На этой модели мы показали, что:

— гены данного подсемейства не транскрибируются во взрослых тканях человека, а транскрибируются только в человеческих эмбриональных и опухолевых тканях, а также в культурах клеток человека-

— транскрибируются только LTR-содержащие гены изучаемого подсемейства-

— транскрипционная активность LTR-не содержащих генов не была детектирована-

В экспериментах in vitro была показана тканеспецифичная энхансерная активность LTR, входящего в состав подсемейства, а также его промоторный потенциал.

Достоверность полученных результатов была подтверждена всеми необходимыми контролями.

Таким образом, мы показали, что присутствие LTR играет важную роль в регуляции транскрипционной активности подсемейства генов KIAA1245, причем такое воздействие на транскрипцию генов происходит в одинаковых внутриклеточных условиях.

выводы

1. Обнаружено подсемейство генов KIAA1245, состоящее из пяти близкородственных генов, три из которых содержат в своих интронах LTR HERV-К, тогда как остальные два — нет. Методами биоинформатики проведен сравнительный структурный и эволюционный анализ членов подсемейства, различающихся по интеграции LTR HERV-K.

2. Сравнительным PCR-анализом геномов различных видов показано, что интеграция LTR в гены AL049742 и AL592284 подсемейства KIAA1245 произошла после отделения эволюционной ветви орангутана от остальных гоминоидов, но до отделения ветви гориллы, то есть между 8 и 13 миллионами лет назад. Интеграция LTR в ген AL954711, по данным множественного выравнивания, произошла около 6 миллионов лет назад.

3. Исследована транскрипционная активность данного подсемейства. Показано, что вне зависимости от присутствия LTR гены подсемейства не транскрибируются в нормальных тканях взрослого человека. В опухолевых, эмбриональных тканях и трансформированных культурах клеток человека транскрибируются только LTR-содержащие гены этого подсемейства.

4. Показано, что в опухолевых и эмбриональных тканях человека экспрессируются все три формы LTR-содержащих генов изучаемого подсемейства, тогда как в трансформированных клеточных линиях экспрессируются лишь две более старые формы LTR-содержащих генов, а самая молодая — нет.

5. В экспериментах in vitro показаны необычно высокая тканеспецифическая энхансерная и промоторная активности LTR подсемейства KIAA1245.

6. Полученные данные дают основания для заключения, что именно внедрение LTR и их энхансерная активность послужила основой появления транскрипционной активности членов подсемейства KIAA1245.

ПоказатьСвернуть

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Перемещающиеся элементы генома.

1.1.2. Ретроэлементы.

1.1.1.1. LTR-Ретротранспозоны.

1.1.2. Ретровирусы.

1.1.3. Эндогенные ретровирусы.

1.1.3.1. Строение эндогенных ретровирусов человека.

1.1.3.2. Происхождение эндогенных ретровирусов.

1.1.3.3. Классификация эндогенных ретровирусов.

1.1.3.4. Представленность и распределение ERV в геноме человека.

1.1.3.5. Участие HERV в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке.

1.3.1.6. Участие ERV в эмбриогенезе и развитии плаценты.

1.1.3.7. Различия в структуре LTR, влияющие на их транскрипционную активность.

1.1.3.8. Эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на экспрессию HERV.

1.1.3.9. Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных LTR на функционирование генома человека.

1.1.4. Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека, как возмоэюные факторы его эволюции.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Оборудование.

2.1.2. Расходные материалы.

2.1.3. Реактивы и ферменты.

2.1.4. Буферные и концентрированные растворы.

2.1.5. Препараты геномной ДНК.

2.1.6. Ткани.

2.1.6. Штаммы, культуры, плазмиды.

2.1.7. Праймеры, последовательность нуклеотидов.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение РНК.

2.2.1.1. Подготовка тканей.

2.2.1.2. Подготовка клеток.

2.2.1.3. Выделение РНК.

2.2.1.4. Определение концентрации РНК.

2.2.1.5. Анализ выделенной РНК методом гель-электрофореза.

2.2.1.6. Обработка препарата РНК ДНКазой.

2.2.2. Синтез первых цепей кДНКна матрице суммарной РНК.

2.2.3. Выделение ДНК.

2.2.3.1. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.3.2. Выделение высокомолекулярной ДНК.

2.2.4. Очистка олигонуклеотидных праймеров.

2.2.5. Полимеразпая цепная реакция (PCR).

2.2.5.1. Стандартная пропись PCR-амплификации.

2.2.5.2. RT-PCR-амп лификация.

2.2.5.3. Приготовление матрицы для PCR из суспензии клеток.

2.2.6. Электрофорез в агарозном геле.

2.2.7. Определение концентрации фрагментов ДНК.

2. 2,8. Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов на автоматическом секвенаторе.

2.2.9. Трансформация Е. coli.

2.2. 10. Рестрикция и лигирование.

2.2. 10.1. Аналитическая рестрикция выделенных плазмид.

2.2. 10.2. Препаративная рестрикция, выделение и очистка плазмид и фрагментов ДНК.

2.2. 10.3. Лигирование.

2.2. 11. Культивирование клеток.

2.2. 12. Трансфекция клеток.

2.2. 13. Позитивно-негативная селекция.

2.2. 14. Получение клеточного лизата.

2.2. 15. Определение количества белка.

2.2. 16. Определение флуоресценции EGFP в клеточных лизатах.

2.2. 17. Определение активности люциферазы.

2.2. 18. 5'RACE (RapidAmplification of5'cDNA Ends).

2.2. 19. Программное обеспечение.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Теоретическое обоснование работы и экспериментальные задачи.

3.2. Анализ траискрипта, содержащего в своем составе LTR HERV-K.

3.3. PCR-анализ локусов, различающихся по присутствию LTR HERV-K.

3.4. Филогенетический анализ представителей подсемейства KIAA1245 генома человека.

3.5. Определение возраста интеграции LTR в предковую последовательность LTR-содержащих генов.

3.6. Сравнение последовательностей представителей подсемейства KIAA1245 различных приматов.

3.7. Анализ транскрипции генов подсемейства KIAA1245.

3.7.1. Анализ транскрипции генов подсемейства KIAA1245 в нормальных тканях человека.

3.7.2. Анализ транскрипции генов подсемейства KIAA1245 в опухолевых тканях человека и трансформированных клеточных линиях.

3.7.3. Анализ транскрипции генов подсемейства KIAA1245 в эмбриональных тканях человека.

3.7.4. Анализ транскрипции LTR-содержащих генов подсемейства KIAA1245.

3.7.5. Вклад каждого из LTR-содержащих генов в общую транскрипцию.

3.8. Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого LTR.

3.9. Роль LTR в транскрипции генов подсемейства KIAA1245.

3.9.1. Расположение генов на хромосомах.

3.9.2. Анализ регуляторных последовательностей в промоторных областях генов.

3.9.3. Метилирование промоторных областей генов.

3. 10. Анализ промоторной активности исследуемого LTR HERV-K.

3. 11. Определение промоторной активности исследуемого LTR in vitro.

ВЫВОДЫ.

Список литературы

1. International Human Genome Sequencing Consortium, Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2004. 431(7011): p. 931−45.

2. Lander, E. et al, Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001. 409(6822): p. 860−921.

3. Umovitz, H.B. and Murphy. W. H" Human endogenous retroviruses: nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin Microbiol Rev, 1996. 9: p. 72−99.

4. Lower, R. Lower, J., and Kurth, R. The viruses in all of us- characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Natl Acad Sci USA,. 996, 93: p. 5177−5184.

5. Lower. R" The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantasies. Trends Microbiol. 1999. 7: p. 350−356.

6. Zsiros. J. Jebbink. M. F., Lukashov, V. V., Voute. P. A., and Berkhout, B" Evolutionary relationships within a subgroup of HER V-K-related human endogenous retroviruses. J Gen Virol, 1998. 79(1): p. 61−70.

7. Medstrand, P.a.M., D. L. Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family. J Virol. 1998. 72: p. 9782−9787.

8. Tonjes, R.R., Czauderna, F. t and Kurth, R., Genome-wide screening, cloning, chromosomal assignment, and expression of full-length human endogenous retrovirus type K. J Virol. 1999. 73: p. 9187−9195.

9. Mayer, J., Sauter, M" Racz, A., Scherer, D" Mueller-Lantzseh, N., and Meese, E., An almost-intact human endogenous retrovirus К on human chromosome 7. Nat Genet, 1999, 21: p. 257−258.

10. Гвоздев. В. А. Подвижная дик эукариот. Чисть I. структура, механизмы перемещения и роль подвижных элементов в поддержании целостности хромосом. Соросовский журнал, 1998. 8: р. 8−14.

11. Kidwell, M.G., Lisch, D" Transposable elements as sources of variation in animals and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94(15): p. 7704−11.

12. Wessler, S.R. Transposable elements and the evolution of gene expression. Symp. Soc. Exp. Biol., 1998. 51: p. 115−122.

13. Smit, A.F.A., Jurka, J. Kapitonov, V., Niak, A., Entries in Repbase Update on World Wide Web URL: http: //www. zirinst, ors/~server/repbase, htm.

14. Smit, A.F.A., Origin of interspersed repeats in the human genome. Curr. Opin. Genet. Dev., 1996. 6: p. 743−748. 18

Заполнить форму текущей работой