Влияние петель на G-квадруплексные ДНК

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биофизика
Страниц:
144


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Актуальность проблемы. Способность гуанин-богатых олигонуклеотидов самоорганизовываться в структуры, построенные из G-квартетов, состоящих из четырёх копланарных гуанинов и связанных & laquo-Хугстиновскими»- взаимодействиями между азотистыми основаниями, известна уже почти 50 лет. Гуанин-богатые сегменты, имеющие функциональную роль in vivo, были найдены в биологически важных регионах генома: теломерах и участках переключения синтеза иммуноглобулинов- промоторные области, образующие квадруплексы, были локализованы для ряда онкогенов и генов, ассоциированных с раком. Квадруплексы нуклеиновых кислот (G-ДНК/РНК) являются также перспективными терапевтическими агентами: многие РНК- и ДНК-аптамеры, отобранные к специфичным мишеням с помощью селекции in vitro, образуют квадруплексные структуры. Таким образом, как сама структура, так и конформационная устойчивость квадруплексных ДНК являются важными предметами изучения для современной фундаментальной и прикладной науки.

Образование и конформационная устойчивость G-квадруплексов зависят от ряда факторов: стэкинг-взаимодействий оснований, водородных связей, ' электростатических взаимодействий и гидратной оболочки. Помимо этих стандартных для дуплексной ДНК стабилизирующих факторов, у квадруплексов существуют специфические: координация Об карбонилов гуанина катионами и петли, участвующие в образовании мономерных и димерных G-квадруплексных структур.

Ранее было показано, что длина и первичная структура петель оказывают существенное влияние на эффективность образования и стабильность квадруплекса, однако, до полного понимания правил формирования пространственной структуры квадруплексных структур ещё очень далеко. Необходимо учитывать влияние петель на геометрию G-ДНК/РНК при рациональном дизайне самих G-квадруплексных структур, либо взаимодействующих с ними агентов.

Для второго специфического фактора стабилизации — взаимодействий между квадруплексами и координирующими катионами, с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) было показано, что положение катиона в структуре квадруплекса зависит от размера и заряда иона. К примеру, способен занимать два положения: в плоскости квартета и между двумя О-квартетами. Такие ионы, как К+ и НН/, обладая большим, чем у атомным радиусом, не способны находиться в плоскости квартета- как правило, для структур, разрешённых с помощью РСА, катионы калия располагаются между квартетами, координируя восемь атомов кислорода Об.

Известные данные о влиянии петель и катионов на стабильность квадруплексов предоставляют недостаточно информации об атомных механизмах стабилизации квадруплекса, что затрудняет рациональное улучшение квадруплексных структур.

Объект исследования Для представителя нового класса ингибиторов тромбообразования, ДНК-аптамера к тромбину (15-ТВА) — 15-звенного синтетического олигонуклеотида, структура которого состоит из двух в-квартетов и трех петель латерального типа, неоднократно предпринимали попытки оптимизировать функциональные характеристики путём модификации петель. Любые изменения первичной структуры аптамера приводили к ухудшению функциональных показателей. Более того, оставался открытым вопрос о количестве и локализации стабилизирующих катионов в структуре 15-ТВА. Сведения о пространственной структуре аптамера и его комплекса с тромбином содержали иные противоречивые данные, касающиеся геометрии петель, полярности полинуклеотидной цепи и взаимной ориентации белка и аптамера в комплексе.

Методы исследования В настоящей работе использовали комбинацию методов моделирования молекулярной динамики, гибридного квантово-механического/молекулярно-механического метода и изотермической калориметрии для исследования структуры и свойств 15-звенного ДНК-аптамера к тромбину и его производных, дополненную биоинформатическим исследованием всех известных на данный момент структур G-квадруплексных ДНК из банка данных Protein Data Bank

Цель работы. Целью настоящей работы является решение задачи определения атомных механизмов стабилизации квадруплексной структуры 15-ТВА и подобных ему G-квадруплексных структур, состоящих из небольшого (2−3) числа G-квартетов. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Выбор корректной модели взаимодействия 15-ТВА с тромбином

2) Разрешение неопределённости геометрии петель структуры аптамера

3) Разрешение неопределённости количества и положения стабилизирующих катионов в структуре 15-ТВА

4) Систематизация структурных данных по G-квадруплексам с известной структурой

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. Систематизированы данные о влиянии типа петель на геометрию квадруплексных структур. Предложен новый параметр для исследования и классификации G-ДНК. Разрешены неопределённости, связанные со структурой и свойствами 15-ТВА: устойчивая конформация, стехиометрия комплекса со стабилизирующим катионом, стехиометрия комплекса с тромбином- определена структурная функция каждого нуклеотида аптамера. Детально описан процесс комплексообразования между стабилизирующим катионом и квадруплексом. Охарактеризован последний этап механизма самосборки структуры 15-ТВА и роль катиона в этом процессе. Для корректного моделирования молекулярной динамики (МД) исследуемых структур на архитектуру GROMACS были портированы новейшие данные о двугранных углах сахаро-фосфатного остова нуклеотидов ДНК, описываемые силовым полем parmbscO. Общая продолжительность траекторий моделирования МД, выполненного в рамках настоящей работы, составляет десятки микросекунд, что является максимальным значением из документированных результатов для G-ДНК.

На основе полученных данных были сконструированы принципиально новые структуры на основе 15-ТВА с улучшенными характеристиками сборки пространственной структуры, аффинностью к тромбину и физиологическими параметрами. Поданы заявки на защиту предложенных в работе методов стабилизации квадруплексных структур патентами РСТ 2010/750 и 2 009 146 170/10(65 916). Разработанные антикоагуляционные препараты аптамеров в настоящее время проходят предклинические испытания в ООО «Апто-Фарм». Список публикаций

Reshetnikov R.V., Golovin А.V., Spiridonova V.A., Kopylov А.М., Sponer J. Structural Dynamics of Thrombin-Binding DNA Aptamer d (GGTTGGTGTGGTTGG) Quadruplex DNA Studied by Large-Scale Explicit Solvent Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation, 2010, V. 6, P. 3003−3014

Решетников P.B., Копылов A.M., Головин A. В. Классификация G-квадруплексных ДНК по углу вращения квадруплекса и планарности G-квартетов. ActaNaturae, 2010, Том 2, № 4(7), с. 80−89

Решетников Р.В., Головин А. В., Копылов А. М. Сравнение моделей 15-звенного ДНК-аптамера к тромбину с помощью симуляции молекулярной динамики. Биохимия (Москва), 2010, Том 75, вып. 8, с. 1124−1132 Решетников Р. В., Головин А. В., Копылов А. М. Рациональный дизайн антитромботического агента нового поколения. 2011, XVIII Российский национальный конгресс & laquo-Человек и лекарство& raquo-, г. Москва Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural Studying of Two-module Thrombin

Binding DNA Aptamers. 2010, 2nd International Conference on Drug Discovery & Therapy, Dubai, UAE

Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Sponer, J. Large scale molecular dynamics simulations bring in-depth insights into thrombin DNA aptamer structure and function. 2010, EMBO, Barcelona, Spain

Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov Т., Spiridonova V., Arutyunyan A., Yuminova A. Modular constractions of thrombin binding dna aptamer as molecular recognition nanoelement. 2010, 3rd International Seminar on Nanosciencies and Nanotechnologies, Habana, Cuba

Решетников P.B., Головин A.B., Копылов A.M. Рациональный дизайн антитромботического агента нового поколения. 2010, III Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech», г. Москва

Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov Т., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural Studying of Conformational Interplay within Two-module Thrombin Binding DNA Aptamers. 2009, FEBS, Prague, Chech Republic Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Rassokhina O., Zavyalova E., Turchaninov Т., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural studying of G-quadruplex based thrombin binding DNA aptamers. 2009, Royal Chemical Society, Manchester, Great Britain

Решетников P.B., Головин A. B, Спиридонова B. A, Копылов A.M. Модульное конструирование аптамеров методами суперкомпьютерных вычислений. 2008, Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech», г. Москва Решетников Р. В., Головин А. В., Спиридонова В. А., Копылов A.M. ДНК-аптамеры к тромбину. 2008, XV Российский национальный конгресс & laquo-Человек и лекарство& raquo-, г. Москва

Решетников, Р.В., Головин А. В., Спиридонова В. А., Копылов A.M. Изучение структурного поведения аптамеров к тромбину методом молекулярной динамики. 2007, XIV Российский национальный конгресс & laquo-Человек и лекарство& raquo-, г. Москва

Структура и объём диссертации Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 177 ссылок. Работа изложена на 144 страницах, содержит 25 рисунков и 7 таблиц.

7.1 Выводы

1. Согласно моделированию молекулярной динамикой (МД) структура 15-членного ДНК-аптамера 15-ТВА и его комплекса с тромбином корректно описывается только ЯМР-моделью, но не РСА-моделью

2. Методом моделирования МД описано три потенциальных участка связывания катионов с аптамером. Изотермической калориметрией (ИТК) и гибридным методом КМ/ММ показана эквимольная стехиометрия комплекса с К± ион расположен в центре квадруплекса

3. Нуклеотиды трех петель квадруплекса образуют стэкинг-взаимодействия с верхним и нижним квартетами. Согласно моделированию МД площадь перекрывания оснований определяет конформационную устойчивость

15ТВА- а также удержание катиона внутри квадруплекса, что коррелирует с данными ИТК

4. При взаимодействии катиона с аптамером моделирование МД выявляет противоположную функцию петель квадруплекса: они стерически затрудняют комплексообразование, но этот же фактор препятствует диссоциации уже образованного комплекса

5. Согласно. моделированию МД катион связывается только частично развернутым или полностью сформированным квадруплексом

6. 75 разрешенных структур квадруплексных ДНК из банка РЭВ рассортированы на 8 групп согласно типу петель и количеству олигодезоксирибонуклеотидных цепей. Геометрия квадруплекса зависит от типа петель: латеральные петли наиболее сильно искажают О-ДНК- структуры с пропеллерными петлями характеризуются оптимальной геометрией квадруплекса.

Показать Свернуть

Содержание

1 Оглавление.

2 Список терминов, условных обозначений и сокращений.

3 Введение.

4 Обзор литературы.

4.1 й-квадруплексы.

4.1.1 Общие сведения.

4.1.2 Общие структурные черты квадруплексных ДНК.

4.1.3 Факторы стабилизации квадруплексов.

4.1.4 Влияние петель на стабильность квадруплексов.

4.2 Наноструктуры на основе О-квадруплексов.

4.3 Сенсоры на основе О-квадруплексов.

4.4 Аптамеры.

4.4.1 Открытие аптамеров.

4.4.2 Аптамеры как терапевтические агенты.

4.4.3 ДНК-аптамер к тромбину.

4.5 Компьютерное моделирование О-квадруплексов.

4.5.1 Моделирование молекулярной динамики.

4.5.2 Моделирование М Д О-квадруплексов.

4.5.3 Взаимодействие О-квадруплексов с катионами.'.

4.6 Гибридный квантово-механический/молекулярно-механический метод.

4.6.1 Общие принципы.

4.6.2 Молекулярная динамика Кара-Паринелло (СРМО).

4.6.3 Применение К М и КМ/ММ-подходов для расчётов характеристик Оквадру плексов.

4.7 Изотермическая титрационная калориметрия.

4.7.1 Общие принципы.

4.7.2 Математический аппарат.

4.7.2.1 Модель одного набора идентичных сайтов.

5 Материалы и методы.

5.1 Портирование силового поля раплЬвсО на архитектуру ОЯОМАСЗ.

5.2 Сравнение ЯМР- и РСА-моделей 15-ТВА.

5.3 Влияние типа петель на геометрию квадруплекса.

5.3.1 Создание выборки квартетов.

5.3.2 Угол поворота квартетов относительно друг друга в квадруплексе.

5.3.3 Отклонения квартета от плоскости.

5.3.4 Гистограмма распределения значений углов поворота квадруплекса и отклонений квартета от плоскости.

5.4 Взаимодействие квадруплекса из двух G-квартетов с катионами.

5.4.1 Модельные эксперименты КМ/ММ.

5.4.2 Изотермическая титрационная калориметрия (ИТК).

5.4.3 Моделирование молекулярной динамики.

6 Результаты и обсуждение.

6.1 Внутримолекулярные взаимодействия в структуре аптамера.

6.1.1 Сравнение ЯМР- и РСА-моделей 15-ТВА.

6.1.2 Причины структурной устойчивости ЯМР-модели по сравнению с РСА-моделью

6.1.3 Комплексы тромбина с 15 -ТВА.

6.1.3.1 Комплексы 1:1.

6.1.3.2 Комплексы 1:2.

6.1.4 Структурная динамика G-квадруплекса. Значения угла поворота как показателя структурной деформации.

6.2 Влияние типа петель на геометрию квадруплекса.

6.2.1 Параметры описания геометрии и конформационного полиморфизма квадруплексов.

6.2.2 Четырехтяжевые параллельные квадруплексы.

6.2.3 Структура типа & laquo-кресло»-.

6.2.4 Одномолекулярные квадруплексы с топологией цепи (3+1).

6.2.5 Структура типа & laquo-корзина»-.

6.2.6 Мономолекулярные параллельные квадруплексы с пропеллерными петлями.

6.2.7 Бимолекулярные квадруплексы с латеральными петлями.

6.2.8 Бимолекулярные квадруплексы с диагональными петлями.'.

6.2.9 Бимолекулярные параллельные квадруплексы с пропеллерными петлями.

6.2. 10 Влияние типа петель на геометрию квадруплекса.

6.3 Взаимодействие катионов с квадруплексами.

6.3.1 Моделирование классической МД.

6.3.1.1 Модельные эксперименты с катионом натрия.

6.3.1.2 Модельные эксперименты с катионом калия.

6.3.1.3 Вклад петель в связывание катиона.

6.3.2 КМ/ММ-исследование.

6.3.3 Изотермическая титрационная калориметрия.

6.3.4 Взаимодействие квадруплексов с катионами.

6.3.4.1 Моделирование М Д не поддерживает гипотезу двух участков связывания катионов в структуре 15-ТВА.

6.3.4.2 Модельные эксперименты МД: проникновение ионов в G-квадруплекс.

6.3.4.3 Корреляция движений катионов во время полного обмена катионом между G-ДНК и окружающим растворителем.

6.3.4.4 Оценочные моделирования КМ/ММ.

6.3.4.5 ИТК-эксперименты.

6.3.4.6 Динамика и сворачивание в-квадруплексных структур.

Список литературы

1. Gellert, M., Lipsett, M.N. and Davies, D.R. (1962) Helix formation by guanylic acid. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 48, 2013−2018.

2. Arnott, S., Chandrasekaran, R. and Marttila, C.M. (1974) Structures for polyinosinic acid and polyguanylic acid. Biochem. J, 141, 537−543.

3. Zimmerman, S.В. (1976) X-ray study by fiber diffraction methods of a self-aggregate of guanosine-5'-phosphate with the same helical parameters as poly (rG). J. Mol Biol., 106, 663−672.

4. Simonsson, T. (2001) G-quadruplex DNAstructures-variations on a theme. Biol. Chem., 382, 621−628.

5. De Lange, T. (2005) Telomere-related genome instability in cancer. Cold Spring Harb. Symp. Ouant. Biol, 70, 197−204.

6. Wright, W.E., Tesmer, V.M., Huffman, K.E., Levene, S.D. and Shay, J.W. (1997) Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. Genes Dev, 11, 2801−2809.

7. Lei, M., Podell, E.R. and Cech, T.R. (2004) Structure of human POT1 bound to telomeric single-stranded DNA provides a model for chromosome end-protection. Nat. Struct. Mol. Biol, 11, 1223−1229.

8. Sen, D. and Gilbert, W. (1988) Formation of parallel four-stranded complexes by guanine-rich motifs in DNA and its implications for meiosis. Nature, 334, 364−366.

9. Sundquist, W.I. and Klug, A. (1989) Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetrads between hairpin loops. Nature, 342, 825−829.

10. Gilbert, D.E. and Feigon, J. (1999) Multistranded DNA structures. Curr. Opin. Struct. Biol, 9, 305−314.

11. Cogoi, S. and Xodo, L.E. (2006) G-quadruplex formation within the promoter of the KRAS proto-oncogene and its effect on transcription. Nucleic Acids Res, 34, 2536−2549.

12. Rankin, S., Reszka, A.P., Huppert, J., Zloh, M., Parkinson, G.N., Todd, A.K., Ladame, S., Balasubramanian, S. and Neidle, S. (2005) Putative DNA quadruplex formation within the human c-kit oncogene. J. Am. Chem. Soc, 127, 10 584−10 589.

13. Dexheimer, T.S., Sun, D. and Hurley, L.H. (2006) Deconvoluting the structural and drug-recognition complexity of the G-quadrupl ex-forming region upstream of the bcl-2 PI promoter. J. Am. Chem. Soc, 128, 5404−5415.

14. Siddiqui-Jain, A., Grand, C.L., Bearss, D.J. and Hurley, L.H. (2002) Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A, 99, 11 593−11 598.

15. Hurley, L.H., Von Hoff, D.D., Siddiqui-Jain, A. and Yang, D. (2006) Drug targeting of the c-MYC promoter to repress gene expression via a G-quadruplex silencer element. Semin. 16.

Заполнить форму текущей работой