Гнойный бактериальный менингит.
Микробиологическая диагностика

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

МУЗ «ПЕРВАЯ ГОРОДСКАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ БОЛЬНИЦА СКОРОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ»

СЕВЕРНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КУРС КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

Руководитель курса

проф. Воробьёва Н. А.

Гнойный бактериальный менингит. Микробиологическая диагностика

Выполнила

врач-интерн КДЛ

Петрова Л. В.

г. Архангельск

2009 г.

Оглавление

Введение

Анализ и учет результатов История

Частота и встречаемость гнойного бактериального менингита в мире в зависимости от возбудителя

Характеристика возбудителей гнойных бактериальных менингитов

Haemophilus influenzae

Neisseria meningitidis

Streptococcus pneumoniae

Прочие возбудители

Патогенез бактериального менингита

Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов

Показания к лабораторному исследованию

Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов

Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного

Бактериологическое исследование крови

Бактериологическое исследование экссудата из петехий

Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококк

Исследование трупного материала

Методы серологической идентификации менингококков или их антигенов

Реакция агглютинации в полистироловых пластинах

Реакция микропреципитации для определения серогруппы менингококков

Метод ВИЭФ.

Использованию реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления антител при менингококковой инфекции

Показания к проведению серологических исследований

Методика постановки РНГА с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами

Взятие крови

Учет реакции

Рекомендуемые сроки, кратность обследования и трактовка серологических результатов

РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции.

РНГА с диагностикумами, А и С

РНГА с диагностикумом серогруппы В

Групповая специфичность РНГА

РНГА при локализованных формах менингококковой инфекции (назофарингит и бактерионосительство)

РНГА при иммуно-эпидемиологических исследованиях

Применение РНГА для оценки эффективности вакцинопрофилактики менингококковой инфекции.

Современные методы генодиагностики гнойных бактериальных менингитов

Общие сведения и принципы

Показания к применению метода

Выделение ДНК

Ожидаемый эффект от внедрения метода

Задачи

Сроки выдачи ответов и их формулировка

Заключение

  • Список использованных источников

Введение

Менингиты бактериальной природы — тяжелейшие инфекционные заболевания, при которых в инфекционный процесс вовлекаются мягкие мозговые оболочки основания головного мозга и верхняя часть спинного мозга.

Локализация очага воспаления, а так же характерные для этих заболеваний тяжелейшие клинические проявления и генерализация процесса с поражением различных органов и тканей указывает на необходимость быстрого решения вопроса об этиологии заболевания и назначения адекватной антибактериальной терапии, которая неоднозначна для гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) разной этиологии.

От грамотного и своевременного проведения исследований по определению этиологического агента заболевания и как можно более раннего начала соответствующего этиотропного лечения зависит исход заболевания, показатели летальности, число и тяжесть постинфекционных осложнений.

Данные лабораторной диагностики бактериальных менингитов и изучение основных биологических свойств у возбудителей лежат в основе определения прогностических критериев в системе эпидемиологического надзора за бактериальными менингитами.

Рационально организованная, комплексная, лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов любой этиологии позволяет достоверно контролировать состояние проблемы этой инфекционной патологии.

История

В двадцатом столетии человечество добилось впечатляющих успехов в борьбе с инфекционными заболеваниями. Одни болезни отступали в силу естественных причин, другие — благодаря повышению уровня жизни и профилактике.

К особой группе жизнеугрожающих для человека и актуальных до сих пор заболеваний относится бактериальный менингит, история которого уходит в глубокую древность. Первые упоминания о болезни отмечены у Артея (II в. до н.э.) и Павла Эгинского (VII в.). По данным Трейтера В. А. (1920), эпидемические вспышки менингита встречались в Италии в I, II и VII веках. Позднее итальянскими врачами дано описание клинической характеристики менингита, а в 1805 г. впервые зарегистрирована и подробно освещена эпидемия цереброспинального менингита в Женеве. В последующем не раз упоминалось о многочисленных вспышках, переходивших порой в эпидемии, которые имели широкое территориальное распространение и продолжались в течение многих лет. Известный французский исследователь, изучавший менингиты в Африке (60-е годы), профессор Л. Лапессони так излагает свое впечатление от болезни: «Глядя на детей, лежащих в лихорадочном состоянии и на то, как быстро наступает коматозное состояние и судороги, на сраженных болезнью, как ударом молнии, понимаешь, почему даже упоминание о болезни — „менингит“ — вызывает животный страх, беспокойство, чувство безысходности и неотвратимой беды».

Отношение к болезни не изменилось и в настоящее время. Несмотря на достигнутый прогресс в отношении этиологии и патогенеза, а также на развитие новых направлений в антибактериальной терапии и профилактики, заболевание остается одной из важнейших причин летальности и инвалидизации, тем самым подтверждая высокую социальную значимость бактериальных менингитов в нескончаемом списке других заболеваний человека.

Частота и встречаемость гнойного бактериального менингита в мире в зависимости от возбудителя

Бактериальный менингит — нередко встречающееся заболевание, за последнее десятилетие отмечено снижение частоты заболеваемости почти на половину. В России средняя частота встречаемости бактериального менингита — 3 на 100 000 населения. Основным этиологическим фактором является N. meningitidis (60%), S. pneumoniae (30%) и H. influenzae (10%).

В США частота встречаемости бактериального менингита — от 2,5 до 3.5 случаев на 100 000 популяции.

До 1990 года основными этиологическими факторами бактериального менингита были три возбудителя — H. influenzae, N. meningitidis и S. pneumoniae, которые были причиной заболевания в 75% случаев. Большинство менингитов, вызванных H. influenzae (тип b) наблюдались у детей, в возрасте до 12 месяцев.

Однако, с появлением вакцин (HibTITER, Pedvax HIB, ProHIBit) случаев H. influenzae — опосредованных менингитов стало значительно меньше. Так, в США с проведением активной вакцинации, начатой в 1988 году, число случаев инфекций ЦНС, вызванной типом b H. influenzae, снизилось к 1997 году до 0,7 на 100. 000 населения (по сравнению с 421 случаев на 100. 000 в 1987 году).

Сегодня важнейшей причиной бактериального менингита является S. pneumoniae. Так, в США ежегодно регистрируется 3000 случаев пневмококковых менингитов ежегодно, при этом смертность при данном заболевании высокая, несмотря на соответствующую антибактериальную терапию. Высокой остается заболеваемость пневмококковыми менингитами у детей в возрасте до 6 месяцев и у пожилых лиц. Частота инфекционного менингита среди новорожденных в Скандинавских странах составила 1,9 на 100. 000 новорожденных; смертность превысила 5%.

Существенной проблемой антибактериальной терапии менингитов является широкое распространение полирезистентных штаммов S. pneumoniae. От 12% до 35% всех выделенных в США штаммов пневмококков резистентны к пенициллину, треть из которых имеют МПК к пенициллину более 2 мг/л.

Вторым по значимости возбудителем бактериального менингита (в России — первым) является N. meningitidis (серотипы A и С). В США заболеваемость менингитом, вызванного менингококком, составляет 0,6 случаев на 100. 000 населения, чаще всего среди детей, подростков и молодых лиц (от 2 до 18 лет).

В Исладии, как и в России, N. meningitidis вызывает наибольшее число заболеваний — 56%, тогда как Str. pneumoniae встречался в 20%, а H. influenzae и Listeria monocytogenes в 5% случаев соответственно. Смертность от менингита она составила 20% взрослого населения; при менингококковой инфекции — 16,2%, при пневмококковой — 25,9%.

Стрептококки группы В и Listeria monocytogenes являются причиной бактериального менингита у детей в неонатальном периоде (1−3% от всех случаев менингита у детей). Listeria monocytogenes является причиной менингита у пожилых, ослабленных больных и пациентов с иммунодефицитом на фоне нейтропении. У пациентов с шунтами важнейшими этиологическими факторами заболевания являются коагулаза-негативные стафилококки, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, P. aeruginоsa.

В этиологической структуре нозокомиального менингита очень большую проблему представляют грамотрицательные бактерии. Их доля в развитии нозокомиальной инфекции ЦНС составляет более 30% по сравнению с 2−4% грамотрицательных возбудителей в этиологии «внебольничного» менингита. К сожалению, большинство выделенных штаммов — энтеробактерии, K. pneumoniae, P. aeruginosa, Serratia spp., Acinetobacter baumannii, Salmonella группы B и D, Proteus mirabilis — полирезистентны к используемым для терапии менингита антибиотикам.

Энтерококковый менингит у новорожденных — довольно редкое, но коварное заболевание. Риск энтерококковой инфекции ЦНС возрастает у больных после нейрохирургических вмешательств.

Процент послеоперационных менингитов — 1,8%. Среди этиологической структуры преобладают Staph. aureus, псевдомонады (P. aeruginosa), K. pneumoniae и реже — энтеробактерии, а у пациентов с ликворреей — пневмококки.

Необходимо помнить о вторичном менингите, развивающемся как осложнение патологии ЛОР-органов, и прежде всего — среднего отита. Частота данного осложнения — 22% среди всех случаев бактериального менингита.

Характеристика возбудителей гнойных бактериальных менингитов

Haemophilus influenzae

Согласно «Определителя бактерий Берджи» Haemophilus influenzae наряду с другими многочисленными представителями (более 15 видов) относят к роду Haemophilus, который входит в семейство Pasteurellaceae (подгруппа 3), относящиеся к 5 группе микроорганизмов, включающей все факультативно-анаэробные грамотрицательные палочки. Из организма человека можно выделить 8 видов гемофилов, причем только 2 из них — Haemophilus influenzae и Haemophilus duckreyi являются основными патогенами человека.

Haemophilus influenzae — небольшие (0,3 — 0,4 * 1 — 1,5 мкм) грамотрицательные, сферические, овальные и палочковидные клетки. Иногда образуют нити и имеют заметный полиморфизм, особенно в материале от больных, которые получали в-лактамные антибиотики. Гемофилы неподвижны, спор не образуют, медленно окрашиваются анилиновыми красителями. Каталазоположительны. Оксидазоположительны.

Haemophilus influenzae — факультативный анаэроб, хорошо растущий на воздухе. Большинство видов Haemophilus при культивировании требуют присутствия в питательной среде X и/или V факторов. Термостабильный фактор роста X (гемин) образуется из гема путем замены двухвалентного иона железа на трехвалентный. Гем, в свою очередь, в изобилии содержится в эритроцитах, входя в состав гемоглобина. Фактор V — это термолабильный кофермент никотинамидадениндинуклеотид (НАД), участвующий в окислительно-восстановительных реакциях бактериальных клеток. Фактор V синтезируется рядом бактерий (например сардинами, стафилококками, нейссериями и другими) и присутствует в животных клетках, в том числе в эритроцитах. Добавление в питательную среду НАД удовлетворяет потребность микроорганизмов в факторе V. Внутри рода микроорганизмы дифференцируют по потребности в указанных факторах роста и на основании биохимических свойств.

Haemophilus influenzae нуждается как в X, так и в V факторах роста. Температурные границы роста гемофилов +24 — +43°С, оптимальная +37°С. Исходя из того, что гемофилам для культивирования необходимы факторы роста (X и/или V), оптимальной средой является «шоколадный» агар, в который входит гретая кровь, содержащая X и V факторы, выделяющиеся при термическом разрушении эритроцитов. В зависимости от состояния популяции на питательных средах капсульные штаммы Haemophilus influenzae формирует слизистые М-колонии (сочные, сероватые, с радужной окраской в проходящем свете) или блестящие S-колонии (полупрозрачные). Бескапсульные штаммы на твердых средах формируют очень мелкие R-колонии (с неровным краем, без радужной окраски в проходящем свете, серовото-белого цвета). Капсульные бактерии Haemophilus influenzae содержат капсульный полисахарид одного из 6 типов (а, b, с, d, e, f), которые отличаются по составу входящих в него углеводов и антигенным свойствам.

Основную эпидемиологическую опасность представляет Haemophilus influenzae типа «b», так как вызывает тяжелейшие менингиты, сепсис, пневмонии и другие инфекционные заболевания. Капсульный антиген Hib состоит из полирибозилрибитолфосфата (PRP или ПРФ). Идентификация Haemophilus influenzae по ферментативной и метаболической активности представляет определенные трудности из-за значительного различия показателей у различных штаммов одного и того же вида. Однако, определение метаболизма индола, уреазы и орнитиндекарбоксилазы (ОДС) является необходимым условием для биотипирования Hib, которое позволяет определить биотип с I по VIII.

Neisseria meningitidis

Возбудителем менингококковой инфекции является менингококк (Neisseria meningitidis), который относят к роду нейссерий, включенному (согласно «Определителя бактерий Берджи») в состав 4-й группы микроорганизмов, озаглавленной как «Грамотрицательные, аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки». Род нейссерий включает два вида патогенных микроорганизмов: N. meningitidis и N. gonorrhoeae, остальные представители этого рода являются резидентной флорой слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие, объединенные в один вид N. subflava, а также N. sicca, N. mucosa, N. flavescens, N. lactamica. Катаральный диплококк выделен в род Вranhamella, включающий: B. catarrhalis, B. caviae, B. ovis и B. cuniculi.

Менингококки требовательны к условиям культивирования. При росте требуют повышенной влажности и 5−10% содержания СО2 в воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В качестве источника нативного белка рекомендуется применять сыворотку крупного рогатого скота, лошадиную или кровь любого другого животного. Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе гидролизата мяса по Хоттингеру, эритрит-агар, агар АГВ, сухой питательный агар специального назначения. Сухие питательные агары, а также сыворотка крови должны быть обязательно проверены на пригодность для культивирования менингококка. Проверку производить со свежевыделенной культурой или эталонным штаммом менингококка, хранившемся в высушенном состоянии.

Морфологически клетки менингококков имеют округлую форму и размеры порядка 0,6−1,0 мкм. Величина микробных клеток и их форма могут различаться, что определяет характерный для менингококков признак клеточного «полиморфизма». Этот признак особенно выражен в мазках из свежих культур, при этом общая морфологическая картина культурального мазка, окрашенного по Граму, имеет вид лежащих беспорядочно полиморфных (по величине и окраске) грамотрицательных кокков (эффект «рассыпанного гороха»). Парное расположение менингококков (диплококков) наблюдают в препаратах, приготовленных из жидкостей и органов пораженного организма. В спинномозговой жидкости менингококки часто располагаются внутрилейкоцитарно и имеют форму кофейного зерна.

Антигенная структура менингококка сложна и включает капсульный полисахарид, липополисахарид, пили, белки наружной и внутренней мембран клеточной стенки. Современными исследованиями показана возможность менингококков самостоятельно секретировать в окружающую среду ряд антигенов (например, иммуноглобулин, А 1 — протеаза), которые играют ведущую роль в формировании вирулентных свойств менингококков.

Менингококки неподвижны, спор не образуют, жгутиков не имеют, являются строгими аэробами, чрезвычайно чувствительны к воздействию внешней среды. При росте на плотных питательных средах образуют небольшие, слегка выпуклые, полупрозрачные колонии с идеально ровными краями. При выдерживании посевов в термостате в течение 2 — 5 дней колонии увеличиваются в размере, становятся менее прозрачными и края их приобретают неровный вид.

Биохимическая активность менингококков невелика и из числа многих углеводов они ферментируют только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты без газа, не разжижают желатин, оксидазоположительны, каталазоположительны.

В соответствии с особенностями строения полисахаридной капсулы менингококки подразделяют на 12 серогрупп: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-Е, К, Н, L, I. Особое эпидемиологическое значение имеют менингококки серогрупп А, В, С, которые способны вызывать эпидемии и наиболее часто выделяются от больных генерализованными формами менингококковой инфекции. Другие серогруппы могут вызывать заболевания, но чаще выделяются из носоглотки носителей.

Определение серогрупповой характеристики менингококков является важнейшей составляющей в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией. Соответствующие современные классификации менингококков по различным антигенным системам (белки, липополисахариды, пили и другие) позволяют определять их популяционные особенности и отбирать наиболее иммуногенные компоненты для конструирования вакцинных препаратов нового поколения.

Streptococcus pneumoniae

Возбудителем пневмококковых менингитов является Streptococcus pneumoniae или пневмококк, который входит в состав рода Streptococcus (группа стрептококков ротовой полости), включенных в 17-ю группу «Грамположительные кокки».

Это овальные, иногда вытянутые вдоль оси ланцетовидные кокки, диаметром 0,5 -1,0 мкм, располагаются парами и окружены общей капсулой.

Строение клеточной стенки пневмококков типично для грамположительных бактерий. Ее основой является пептидогликан со встроенными углеводами, тейхоевыми кислотами, липопротеинами и поверхностными белками. Пневмококки неподвижны, спор не образуют, являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы. Для культивирования пневмококки нуждаются в богатых питательных средах, предпочитают капнофильные условия (5 — 10% СО2). Температурный оптимум +37°С. Каталазоотрицательны.

На плотных питательных средах растут в виде мелких, прозрачных, не склонных к слиянию колоний. На средах с кровью колонии пневмококков окружены зоной б-гемолиза (по классификации Браун) серовато-зеленого цвета, вследствие разрушения эритроцитов и превращения гемоглобина в метгемоглобин. Колонии склонны к аутолизу, что связано с активностью внутриклеточных ферментов.

Капсулы пневмококков являются основным фактором вирулентности, защищающим микроб от опсонизации и последующего фагоцитоза. Некапсулированные штаммы авирулентны. Среди других факторов патогенности наибольшее значение имеет уровень активности гиалуронидазы, пневмолизина, гемолизина и др.

По капсульному антигену проводят типоспецифическую дифференцировку пневмококков, которых насчитывают не менее 90 серотипов. Серотиповой пейзаж возбудителя зависит от географической области, климатических условий, возраста больных, вида патологии и со временем может меняться. Выявление особенностей циркуляции пневмококков позволяет значительно снизить заболеваемость пневмококковой инфекцией за счет вакцинопрофилактики групп риска.

Прочие возбудители

В структуре бактериальных менингитов, вызываемых «прочими» возбудителями, можно условно выделить менингиты новорожденных, посттравматические и послеоперационные менингиты, «вторичные» менингиты и менингиты иммунокомпромиссных больных.

Менингиты новорожденных, обусловлены возбудителями, входящими в род Streptococcus (S. agalactiae, S. pyogenes и др.), род Listeria (L. monocytogenes), семейство Enterobacteriaceae (Klebsiella spp., Enterobacter spp, E. coli и др.). Заражение происходит при прохождении плода по родовым путям или трансплацентарно.

У пациентов, перенесших травмы или операционные вмешательства, важнейшими этиологическими факторами заболевания являются представители рода Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis и др.), семейство Enterobacteriaceae (K. pneumoniae, E. coli, Proteus spp. и др.), рода Pseudomonas (P. aeruginosa, P. mallei и др.), рода Enterococcus (E. faecalis).

Менингиты у лиц с врожденным или приобретенным нарушением функций иммунной системы (тяжелые хронические заболевания сердечнососудистой системы, легких, почек, печени, туберкулез, онкологические заболевания, ВИЧ и т. д.) в первую очередь связаны с широким спектром грамотрицательных бактерий, входящих в семейство Enterobacteriaceae (K. pneumoniae, P. mirabilis, E. coli, Serratia spp.), род Pseudomonas, род Acinetobacter (A. baumanii), дрожжеподобных грибов (род Candida, род Cryptococcus).

«Вторичные» менингиты чаще всего развиваются как осложнения инфекционных заболеваний ЛОР-органов, остеомиелита и обусловлены представителями рода Staphylococcus (S. aureus), рода Pseudomonas (P. aeruginosa), семейства Enterobacteriaceae (K. pneumoniae, E. coli и т. д.).

Так называемые «прочие» возбудители широко распространены во внешней среде и составляют основной спектр условно-патогенной микрофлоры.

Патогенез гнойного бактериального менингита

Развитие бактериального менингита начинается с момента, когда вирулентные микроорганизмы преодолевают защитные барьеры центральной нервной системы, при этом в первую очередь в процесс вовлекается субарахноидальное пространство. Важнейшими резервуарами инфекции ЦНС являются назофарингеальные источники. Структурной особенностью ряда возбудителей являются поверхностные образования — пили, которые снабжены рецепторами, определяющими тропную адгезию бактериальной клетки к слизистой оболочке. Следует также отметить, что такие важнейшие возбудители бактериального менингита, как Str. pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, снабжены наружной оболочкой из полисахаридов, которая определяет такие факторы вирулентности, как невозможность фагоцитоза или незавершенный фагоцитоз и препятствует комплемент-опосредованному лизису бактерий.

Из назофарингеальных источников возбудитель путем локальной пенетрации в ткани может попасть в кровоток и затем, преодолев гематоэнцефалический барьер, достигнуть мозговых оболочек. Бактериемия является важнейшим механизмом распространения инфекции при менингите. Возможности защитных сил макроорганизма, направленные на эрадикацию возбудителя из цереброспинальной жидкости, резко ограничены ввиду исходно низкого титра антител и активности комплемента. Репликация бактерий инициирует выработку медиаторов воспаления — цитокинов, интерлейкинов 1, 6, фактора некроза опухолей, простагландинов (ПГЕ-2), лейкотриенов (ЛТ-В4), а также аккумуляции в цереброспинальной жидкости лейкоцитов.

Экспериментальные модели бактериального менингита демонстрируют существенное нарушение динамики цереброспинальной жидкости и изменение церебрального кровотока в результате развившегося воспаления. Возникающие нарушения проходимости капилляров в субарахноидальном пространстве приводят к снижению резорбции цереброспинальной жидкости, результатом же является повышение внутричерепного давления, падение церебральной перфузии и ауторегуляции. Эти нарушения приводят к стойким неврологическим нарушениям или к жизнеугрожающим ситуациям.

Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов

Показания к лабораторному исследованию

Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови. Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии. По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

Бактериологическому обследованию подлежат:

а) в детских учреждениях — дети, бывшие в общении с больными, и обслуживающий персонал всего учреждения;

б) в школах — учащиеся и преподаватели класса, где зарегистрирован больной;

в) в школах-интернатах (круглосуточное пребывание детей) — учащиеся, общавшиеся с больным в классе и в спальной комнате, а также преподаватели и воспитатели данного класса;

г) в семьях, квартирах — все лица, общавшиеся с больными;

д) в ВУЗах, средних учебных заведениях, ПТУ, спецучилищах, колледжах при возникновении случая заболевания на первом курсе — преподаватели и студенты всего курса; на старших курсах — только общавшиеся с больным в учебной группе и комнате общежития;

е) в других организованных коллективах — лица, проживающие в общежитии.

В детских дошкольных учреждениях бактериологические обследования контактных проводятся не менее двух раз с интервалом в 3−7 дней, в остальных коллективах — однократно.

Носители менингококков, выявленные при бактериологическом обследовании в детских дошкольных коллективах, школах-интернатах и др. детских учреждениях выводятся из коллектива на срок проведения санации. Из коллектива взрослых, в том числе учебных заведений, носители не изолируются.

Носители менингококков — дети и взрослые, выявленные в семейных очагах, в детские дошкольные учреждения, школы, школы-интернаты, санатории, оздоровительные лагеря и др. детские учреждения не допускаются. Бактериологическое обследование коллективов, которые посещали эти носители, не проводится.

При выявлении носителя менингококков среди больных соматических стационаров, его следует изолировать в бокс или полубокс. Вопрос о санации решается в зависимости от основного заболевания. При отсутствии возможности изоляции носителя курс санации проводится обязательно. Персонал отделения подвергается однократному бактериологическому обследованию, выявленные носители отстраняются от работы на время проведения санации.

Выявленные носители менингококков санируются на дому или в специально развернутых для этих целей отделениях: взрослые — ампициллином или левомицетином по 0,5 * 4 раза в день в течение 4-х дней. Детям эти препараты назначают по той же схеме в возрастных дозировках. Для санации носителей в закрытых коллективах взрослых рекомендуется рифампицин по 0,3 через 12 часов в течение 2-х дней.

Через 3 дня после окончания курса санации носители, независимо от примененного препарата, подвергаются однократному бактериологическому обследованию и при наличии одного отрицательного бактериологического анализа они допускаются в коллективы.

При длительном носительстве (свыше 1 месяца) и отсутствии воспалительных изменений в носоглотке носитель допускается в коллектив, где он был выявлен.

Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов

В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста Hemophilus influencae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов.

Идентификация вида N. meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических признаков.

При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков на сывороточном агаре бесцветны, круглые с ровным краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию.

Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и B. catarrhalis в отличие от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими.

Заболевания, где этиологическим агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным механизмом передачи, что обеспечивает широкое распространение. Из всех представителей этого рода наибольшей патогенностью обладают H. influenzae, впервые описанные Пфейффером в 1892 г. Этот возбудитель является наиболее частым агентом тяжелых генерализованных форм заболеваний, особенно у детей до 5 лет. ГБМ у взрослых могут быть обусловлены другими серологическими типами.

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высоко требовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить «шоколадный» агар.

Для проведения бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением: сроков забора, доставки патологического материала и условий транспортировки.

В бактериологическую лабораторию доставляется материал в следующем объеме:

1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 1,0 мл.

2. Ликвор в 0. 1% полужидком агаре (среда «обогащения») для бактериологического накопления культуры, 0,5 мл ликвора засевают в 5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.

3. «Толстая капля» крови для бактериоскопии.

4. Кровь в жидкой питательной среде или в 0,1% полужидком агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры, 5,0 мл крови засевают в 50,0 мл среды обогащения.

5. Кровь в количестве не менее 2-х мл для серологических исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.).

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляется в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в теплом виде (t0=+370С) в специально оборудованных контейнерах.

При невозможности немедленной доставки допускается хранение патологического материала в условиях термостата при +370С в течение 18 часов.

Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного

1-й день исследования

Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2 — 5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар (желательно до начала антибактериальной терапии) с соблюдением все правил асептики. Взятие ликвора производится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1,0 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования наливают в стерильную пробирку (не менее 1.0 мл) и частично засевают в 0,1% полужидкий агар (0,5 мл СМЖ добавляют в 5 мл 0,1% полужидкого агара). Касаться руками краев канюли, иглы и краев пробирок нельзя. Ватно-марлевую пробку полагается держать на весу за ее наружную часть.

СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3 — 0,5 мл материала и по 2 — 3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит «шоколадный» агар, вторая — сывороточный. Посевы ставят в термостат при +370С и создают условия повышенного содержания СО2 в атмосфере термостата. Пробирка с ликвором в полужидком агаре инкубируется в термостате.

Нативная спинномозговая жидкость, оставшаяся в пробирке, исследуется в серологических реакциях и используется для приготовления мазков.

Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит.

H. influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.

Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне.

Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2 — 3 капли засеять в чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

2-й день исследования

Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты — на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний «шоколадном» агаре — нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета cреды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на «шоколадном» агаре дают обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2 — 2,0 мм, легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины и короткие цепочки. На сывороточном агаре H. influenzae не растет. Крупные 3 — 5 мм колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P. aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета «шоколадного» агара.

Колонии пневмококков на обеих средах — мелкие (0,1 — 1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На «шоколадном» агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип б-гемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S. feacalis), которые в редких случаях могут вызывать менингит, особенно у детей 1 года.

В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2 — 3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности. Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20% сыворотки. H. influenzae и пневмококков — при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями.

На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H. influenzae, N. meningitidis и Str. pneumoniae.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при +370С.

Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1 — 2), то их отсевают на чашку с сывороточным или «шоколадным» агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, в также изредка в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P. aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки — гемолитические группы В, «зеленящие» и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии, синегнойную палочку, стафилококк и Ac. calcoaceticum проводят исследования в соответствии с методическими материалами.

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L. monocytogenes характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L. monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, «шоколадным» агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда «обогащения»).

При отрицательных результатах высев со среды «обогащения» повторяют через 1 — 2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

3-й день исследования

Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН.

Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию, серогруппирование идентификационной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы.

На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при +370С на 1 — 2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1 — 2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано раннее).

При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференцирующих стрептококки.

В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).

4-й день исследования

Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и Br. catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа.

Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при +370С, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции преципитации в агаре, а также для определения лекарственной устойчивости.

Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.

Бактериологическое исследование крови

При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка «толстой капли» из крови, взятой из вены или пальца.

В препарате «толстой капли» менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.

Кровь, взятую стерильно из вены, засевают на 0,1% полужидкий агар или жидкую питательную среду в отношении 1: 10, т. е. 1 — 2 мл крови можно посеять в пробирку с 7 — 10 мл полужидкого агара или 5 — 10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды. После суточной инкубации материал высевают на сывороточный и «шоколадный» агар в чашки Петри. При наличии роста готовят препараты для микроскопии. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с высевами через день. Выделение и идентификацию гемокультур проводят также, как при исследовании спинномозговой жидкости.

Бактериологическое исследование экссудата из петехий

При менингококцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в экссудате кожных петехий.

Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70% спиртом. В случае образования некроза в центре петехии экссудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже экссудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1 — 0,2 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вводят в толщу петехии и отсасывают обратно.

Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.

Засеянные чашки инкубируют при +370С 24 часа (в случае отсутствия роста — 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п. 3).

Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококк

1-й день исследования

Исследуемый материал — слизь с задней стенки глотки — берут натощак или через 3 — 4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке.

Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2 — 3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.

Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или средой обогащения, или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию. При посеве на чашку материал втирают на поверхности небольшого участка (1*2 см) среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.

Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации. На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.

При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через одни сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.

Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяют грелки (+35 — +400С) и немедленно помещают в термостат при +370С.

Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры.

Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном. Засеянные чашки помещают в термостат.

При транспортировке материала на короткое расстояние (1 — 2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2 — 4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят, погруженными в транспортную среду.

Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.

2-й день исследования

Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой-микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3 — 5 колоний). На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через 40 — 48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.

3-й день исследования

Изучают рост чистых культур, отсеянных из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также характеризующиеся «сухим» ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при дневном освещении.

Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых генерациях для менингококков характерны полиморфизм и вариабельность окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по выше описанным тестам.

Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный, то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими сыворотками.

4-й день исследования

Просматривают посевы, сделанные в предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном и желчном агаре (при +370С), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.

В этот же день выдают окончательный положительный или отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с полужидкой среды, соответственно, будут получены на сутки позднее.

Исследование трупного материала

Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококцемии — из печени, селезенки, легкого, надпочечников и т. д.). Кровь берут стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью стерильной пипетки с грушей в количестве 7 — 10 мл. Из них 2 — 3 мл засевают в 25 мл 0,1% полужидкого агара, а оставшиеся — 5 — 7 мл используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т. д,). Для посевов можно использовать, также сгустки крови из крупных сосудов.

Ликвор берут стерильной пипеткой из около оболочечного пространства (во время извлечения головного мозга из полости черепа), в стерильную пробирку в количестве 3 — 5 мл и немедленно высевают на чашки с питательными средствами. В количестве 0,1 мл исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее поверхности покачиванием, растирать шпателем не рекомендуется.

Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин).

Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой — по Граму.

Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды.

Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков-отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении — в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой