Вирощування женьшеню

Вступ.

Женьшень, Panax ginseng C.A. Меy («Корінь життя») — багаторічна трав’яниста рослина, рід сімейства Аралієві. Включає 11 видів, що виростають в Азії та Північній Амеріці.

Добре відома лікарська рослина. В основному використовується як адаптоген і в якості загальнотонізуючого лікарського засобу. У Кореї та Китаї корінь женьшеню також використовують у приготуванні їжі. Східна медицина стверджує, що препарати женьшеню продовжують життя і молодість женьшень справжній вперше почали вирощувати, мабуть, ще в 1 ст. до н. е. в північних районах Кореї. У цій країні він протягом майже двох тисячоліть був найважливішою статтею експорту. У 1957 р. загальна площа плантацій женьшеню в КНДР становила близько 200 га; більша частина посадок була зосереджена в провінціях Північний Хванхе і Південний Хванхе, при цьому 135 га — біля м. Кесон (Бєліков, 1959). З 1 га отримували 1,8−3,0 т сирого кореня, а середня вага 6-річних товарних коренів становив 60−75 р. У Китаї культивувати женьшень почали дещо пізніше, ніж в Кореї, в II-IV ст. н. е. (Gong Xichen, 1992). Спочатку викопані в лісі рослини розсаджували в одному місці, знову ж таки в лісі, і тільки потім стали обладнати плантації з штучними навісами.

Сучасний стан виробництва женьшеню. У відсталих країнах виробництво женьшеню ще не набрала промислових маштабів, вирощування женьшеню проходить в природі, на плантаціях.

Плюси: висока якість, нативність Мінуси: порушення біоценозу женьшеню, висока собівартість, складність у стандартіаціі готового продукту, незначний об'єм виробництва.

У розвинених країнах біотехнологічні аспекти отримання гінзенозидів.

Плюси: технологічне виробництво, задоволення попиту, невисока прогнозована вартість, задане кількість продукту і безпечність.

Мінуси: продукт не природний, необхідність у визначенні біоеквівалентності до діючої субстанції.

Для збереження біоценозу женьшеню і задоволення потреби в гінзенозидів необхідно розробляти високоефективні біотехнологічні підходи культивування як самого женьшеню, так і отримання панаксозидів з культури клітин рослин. Підходи, що розроблюються повинні забезпечити високу якість продукту, значний об'єм виробництва, низьку собівартість і доступність за ціною. Актуальність обумовлена прагненням старіючого населення планети використовувати для профілактики хвороб та зміцнення життєвих сил органів нативних, натуральних рослинних компонентів.

В Україні немає власної сировини женьшеня. Спроби культивувати цілу рослину не мали широкого поширення у виробництві. Україна щорічно закуповує різних продуктів з екстрактом женьшеню на 2, 8 млн долларів. Необхідно знайти можливість для забезпечення населення вітчизняною продукцією та збереження золотовалютного резерву.

1. Нормативна документація.

сировина гінзенозид настоянка При розробці технологічних процесів і розрахунку апаратів і балансів була використана наступна нормативна література.

ГОСТ 7.9-95 Реферат и аннотация. Общие требования;

ГОСТ 19.101-77 ЕСПД. Види программ и программних документів;

СТВУЗ-ХПІ-1.03-2007 ССОНП. Нормоконтроль документів у сфері навчального процесу. Порядок організації та проведення;

СТВУЗ-ХПІ-3.01-2007 ССОНП. Текстові документи у сфері навчального процесу. Загальні вимоги до виконання;

СТВУЗ-ХПІ-3.03-2006 ССОНП. Конструкторські документи у сфері навчального процесу. Загальні вимоги до виконання;

СТВУЗ-ХПІ-3.04-2006 ССОНП. Формати. Основні написи. Вимоги до виконання.

СТВУЗ-ХПІ-3.05-2002 ССОНП. Конструкторські документи. Креслення. Вимоги до виконання.

СТВУЗ-ХПІ-3.06-2002 ССОНП. Конструкторські документи. Специфікації. Вимоги до виконання.

СТВУЗ-ХПІ-3.07-2007 ССОНП. Конструкторські документи у сфері навчального процесу. Схеми. Загальні вимоги до виконання.

СТВУЗ-ХПІ-3.08-2007 ССОНП. Технологічні документи у сфері навчального процесу. Вимоги до виконання.

2. Техніко-економічне обґрунтування.

Одним з головних чинників побудови сталої та ефективної економіки в сучасних умовах об'єктивно вимагає формування інвестиційної політики в міжнародних відносинах, розвиток ринків продукції різних галузей, з урахуванням особливостей регіонів. Перехід до ринкових відносин і демонополізації української економіки зумовили формування проекту економічного співробітництва в галузі виробництва женьшеню. Поряд з традиційним збором цього найціннішого кореня женьшеню, інтерес до його виробництва через інвестиційні проекти економічного і промислового співробітництва необхідно розглядати не як альтернативу сформованим традиційним формам його видобутку, а як об'єктивно можливе його доповнення, що дозволяє більш повно розкрити і використовувати біоресурсного потенціал у індустрії. З цих позицій створення і функціонування проекту спільного співробітництва в галузі створює передумови для розвитку ефективної економіки України та країн учасниць, розширює горизонт пошуку раціональних форм і методів використання природних і економічних ресурсів регіону. Крім того, розвиток економічного співробітництва на основі раціональної спільної діяльності з ефективного використання біоресурсів, капіталу і технології Республіки Корея, дозволяє професійно займатися кожному учаснику проекту, що найбільшою мірою відповідало б його досвіду, навичкам і традиціям. У Північно-Східній Азії, Республіка Корея — добрий ринок, на якому знайде збут значна кількість продукції. На жаль, розвиток економіки для України стримується склалися економічними умовами в регіоні, що не дозволяє забезпечувати очікуваний результат. Практика останніх десятиліть показала, що обсяги женьшеню продовжує мати тенденцію до зниження. Багато в чому це пов’язано з недосконалою організаційно-виробничою структурою заготовок і непристосованістю до «жорстких» умов ринкових відносин.

У сучасній ситуації рішення даної проблеми стає особливо актуальним, оскільки для України відкриваються широкі можливості розвитку вирощування женьшеню і перспективою включення у світовий ринок женьшеню. У той же час, як показують дослідження, менші дивіденди в результаті здійснення даного проекту припадають Республіці Корея. Так, в результаті аналізу цього проекту фондової біржею цінних паперів Номура (Японія), страховою компанією Самсунг, Елджі, аналітики дійшли висновку, що при розділі прибутку по 1/3 частини, корейська сторона забезпечить собі прибуток лише V частини банківських відсотків при вкладенні передбачуваної інвестиційної суми в міжнародні банки. У республіці Корея питання виробництва та системи реалізації женьшеню мають свої особливості. Виробництвом женьшеню тут займаються господарства, бо достеменно відомо, що ніякої інформації про знахідки дикорослого женьшеню в Кореї не вдається отримати за останні більш ніж 70 років. Так, в 1989 році в Республіці було 38 843 виробляють женьшень господарств, але вже за даними за 1998 рік їх число зменшилося до 20 000. На жаль, з ряду причин виробництво женьшеню в країні йде на спад. У той же час споживання женьшеню на душу населення тут становить на рівні 10 американських доларів, при ємності ринку, включаючи реалізацію імпортного та вітчизняного продукту, на рівні 49 млрд. американських доларів. Експорт становить близько 10 млрд. дол. Як показують дослідження, за останній час зростає споживання женьшеню (дикого), що надходить до Республіки Корея щорічно з Північної Кореї, Китаю, Примор’я. Результати показують, що в 1998 році з 100 тис. коренів женьшеню, імпортованого з Північно-східного Китаю, приблизно 20 тис. Представляється, що в найближчому майбутньому до Республіки Корея буде завезено натурального (дикорослого) і дорощенного женьшеню не менше ніж на 100 млн. дол. Однак ринок може отримати розвиток за умови, якщо різниця в ціні складе між дико вирощеним і вирощеним женьшенем не в 100 разів, а хоча б близько 20. В даний час ємність ринку Кореї щодо дикорослого і культивованого женьшеню становить близько 100 млн. амер. дол Розрахунки показують, що в перспективі виробництво женьшеню в Примор'ї може забезпечити половину цієї потреби, тобто виробництво продукції може досягти 50 млн. амер. дол Такий прогноз підтверджується наведеними в роботі економічними розрахунками експортно-імпортних операцій на світових женьшеневий ринках, а також аналізі даних склалися навколо корейського ринку, що дозволяє обґрунтувати можливості виробництва женьшеню в Примор'ї для великого ринку країн Північно-Східної Азії та міжнародного ринку. Виконані дослідження, безумовно, внесли істотний внесок у вивченні біопотенціала українського женьшеню, вдосконалення організації його виробництва на основі проекту економічного співробітництва, а також конкурентоспроможності, особливо дикого женьшеню, на світових женьшеневих ринках. Необхідно відзначити, що в міжнародному співробітництві питання женьшеневий індустрії залежить не тільки від рішення комплексної проблеми виробництва необхідної кількості дикого і культивованих женьшеню, але він у тісному зв’язку і з їх якістю, можливостями закупівель та експорту, системи реалізації, переробки та зберігання. Наявність вищевказаних проблем зумовило потребу в пошуку і розробці наукових положень, спрямованих на розробку проекту економічного співробітництва в галузі вирощування женшеню.

На прикладі вищесказаного бачимо, що вирощування та збір натурального «лісового» женьшеню для України є не доцільним, приходимо до висновку що виробництво женьшеню in vitro є більш вигідним і економічно вірним рішенням. З економічної точки зору виробництво женьшеню в лабораторії має великі перспективи в Україні, тому що всі можливості для цього в нашій державі є. Для приклад можна посилатися на цифри, на кожен вкладений 1 долар маємо 15 доларів чистого прибутку. Таке виробництво забезпечило б все населення вітчизняним, не дорогим продуктом і принесло прибуток державі.

3. Технологічна частина.

3.1 Характеристика кінцевої продукції виробництва.

Кінцевим продуктом виробництва є суха речовина гінзенозиду, виділенного з біомаси калусної культури женьшеню, номер реєстраційного посвідчення UA/11 370/01/01 від 1 березня 2011 року.

Форма випуску: порошок (субстанція) у ємкостях з поліетилену високої щільності, нержавіючої сталі для виробництва стерильних лікарських форм (зручних для вживання) або настоянка у влаконах 40−50 мл, та промислові 100−300 мл.

Сучасні медичні дослідження показали, що женьшень містить унікальний набір речовин, що надають сильну дію на організм людини. Серед них такі біологічно активні речовини, як гінзенозид (сапоніни або тритерпенові глікозиди) Гінзенозиди — це основні діючі біологічно-активні компоненти, як натурального кореня женьшеню, так і вирощеного in vitro. Гінзенозиди за хімічною класифікацією належать до тритерпенових сапонінових гликозидів і поділяються на: панаксозіди, А і В, панаквілон, панаксін, гінзенін, які часто називають просто панаксозіди.

Сапоніни — безазотисті глікозиди рослинного походження з поверхнево-активними властивостями. Розчини сапонінів при збовтуванні утворюють густу стійку піну. Назва походить від латинського sapo (нар. відмінок saponis) — мило. Широко поширені в природі, зустрічаються в різних частинах рослин — листі, стеблах, коренях, кольорах, плодах. Містять аглікон (сапогенін) і вуглеводну частину. Для виділення групи сапонінів з інших вторинних метаболітів використовуються властивості поверхневої активності і гемолітичної активності. Однак не всі сапоніни можуть ними володіти. Тому речовини можуть поміщати в групу сапонінів на основі структурної формули (стероїдні та терпеноідние глікозиди). Гінзенозиди належать до терпиноїдних глікозидів.

Рисунок 3.1-основні біологічні речовини кореню женьшеню.

Хімічний склад. Корінь женьшеню містить суміш тритерпенових тетрациклічних сапонінів даммаранового ряду — панаксозіди (гінзенозіди). Крім того, в корінні є ефірна олія (0,25−0,5%), пектинові речовини (до 23%), вітаміни В1, В2 і ін, мікро-і макроелементи, крохмаль (до 20%), даукостерін. З калусної тканини штаму БІО-2, отриманої in vitro від кореня женьшеню, виробляють біомасу женьшеню суху (Biomassa Ginseng sicca).

Зовнішні ознаки. Суха біомаса женьшеню являє собою шматочки округлої або неправильної форми, легкі, пористі, легко розсипаються при розтиранні в порошок.

Рисунок 3.2-хімічний склад кореня женьшеня Колір від світло-жовтого до світло-коричневого. Запах слабкий, специфічний. Смак солоновато-гіркий.

Мікроскопія. При розгляді порошку біомаси видно обривки округлих меристематичних і овальних паренхімних клітин з тонкими стінками; в клітинах багато простих крохмальних зерен з освітнім центром у вигляді крапки або щілини; зустрічаються кристали у вигляді призм.

Якісні реакції. Для ідентифікації біомаси використовують також мікрохімічний реакцію на крохмаль з розчином люголя після попереднього набрякання біомаси у воді протягом 15 хв. Під мікроскопом видно скупчення червоних і коричнево-фіолетових набряклих крохмальних зерен. Справжність біомаси встановлюють також за допомогою хроматографії спиртового розчину суми тритерпенових глікозидів після проведення кількісного визначення в тонкому шарі сорбенту на пластинах в системі н-бутанол-95% етанол-концентрований розчин аміаку (9:2:5 за об'ємом). Після висушування хроматограм, прояви 5%-ним розчином сірчаної кислоти і нагрівання в струмі гарячого повітря на хроматограмі має з’явитися не менше чотирьох плям від світло-бузкового до фіолетового кольору в області Rf = 0,26 ± 0,43 (тритерпенові глікозиди).

Числові показники. Вміст суми глікозидів в кінцевому продукті, визначених гравіметричним методом, повинно бути не менше 1,5%; вологість не більше 8%; золи загальної не більше 13,5%.

Дія і застосування. Гінзенозиди — тонізуючий засіб — знімає втому і підвищує працездатність, має адаптогенні і імуностимулюючі властивості. Адаптогенні речовини допомагають пристосуватися людині до нових умов клімату, невагомості, хвороби і т. п. Такі властивості женьшеню пов’язані з панаксозидами, які підвищують опірність організму шкідливим фізичних, хімічних і біологічних факторів. Імуностимулюючу дію їх виражається в стимуляції продукції антитіл, що супроводжується збільшенням кількості загального білка і гамма-глобулінів в крові. Панаксозиди стимулюють кровотворення, майже в 2 рази підсилюють біосинтез нуклеїнових кислот, білків і жирів в кістковому мозку, збільшують міотичної активність клітин кісткового мозку. Ці глікозиди мають і радіозахисним дією як при внутрішньому (інкорпораціонному), так і при зовнішньому впливі іонізуючих випромінювань, сприяють виведенню з організму інкорпорованого в кістковій тканині стронцію-90, що, мабуть, пов’язано з посиленням обміну кальцію в кістках. Це відноситься і до інших радіоактивних ізотопів. Захисний ефект проявляється не тільки при профілактичному введенні женьшеню перед гамма-опроміненням, а й при введенні його через деякий час після опромінення. Біологічно активні речовини женьшеню зменшують поглинання полісахаридів, посилюють ресинтез глікогену та фосфатів високої енергії. Встановлено тенденція до прискорення відновлення альбуміну в крові в постгеморатичному періоді, підвищення загальної реактивності організму, благотворний вплив на функції залоз внутрішньої секреції. Зокрема, препарати женьшеню посилюють статеву збудливість і мають позитивну дію при імпотенції. У малих дозах панаксозиди збуджують руховий і дихальний центри довгастого мозку, а у великих, навпаки, викликають їх пригнічення. Більшість клініцистів вважають женьшень засобом, збудливим центральну нервову систему і за широтою терапевтичної дії набагато перевершує фенамін. Проте у великих дозах женьшень надає не збуджує, а має седативну дію. Деякі дослідники вважають, що під впливом препаратів женьшеню проявляється дуже добрий ефект у поліпшенні самопочуття людей, що займаються розумовою працею. Зокрема, підвищується продуктивність праці в нічний час і поліпшується пам’ять. Панаксен, панаксозиди і панаксовая кислота знижують вміст цукру в крові до нормального рівня, прискорюють синтез глікогену з глюкози. Подібно до інсуліну вони прискорюють синтез в печінці і сприяють накопиченню їх у жирових тканинах. Є відомості про те, що женьшень не тільки гальмує виникнення надлишку холестерину в крові, але і є хорошим профілактичним засобом при атеросклерозі. Під впливом препаратів підвищується поглинання метіоніну в печінці і прискорюється його перехід в альбумін сироватки крові, стимулюється тканинне дихання печінки та головного мозку і тому споживання кисню ними збільшується. Женьшень посилює скорочення серця, нормалізує артеріальний тиск. Препарати женьшеню нетоксичні і практично нешкідливі. У них немає абсолютних, з медичної точки зору, протипоказань, але незважаючи на те що під впливом женьшеню знижується артеріальний тиск, не слід призначати його при гіпертонічній хворобі, особливо під час літньої спеки, як і в інших випадках в цей час.

Настоянки — це рідкі спиртові або водно-спиртові витяги, отримані зазвичай з висушеного або свіжого рослинного або тваринного сировини без нагрівання і видалення екстрагента. Згідно з визначенням ДФУ (I вид., 2001 р. с. 513) настоянки — це рідкі препарати, звичайно одержувані з висушеної рослинної або тваринної сировини. Готують настоянки мацерацією, перколяції або іншим відповідним методом із застосуванням спирту відповідної концентрації. Готують їх у співвідношенні 1:10 або 1:5. Майже всі настоянки представляють собою темно-пофарбовані рідини.

3.2Характеристика сировини, матеріалів та напівпродуктів.

Показники, що регламентують вимоги до якості сировини, матеріалів та напівпродуктів, що використовуються у виробництві гензинозиду наведені у таблиці 3.1.

Таблиці 3.1 — Показники, що регламентують вимоги до якості сировини, матеріалів та напівпродуктів.

3.3Обгрунтування вибору технологічної схеми.

Культура клітин вищих рослин є альтернативним способом отримання рослинної сировини для медицини, ветеринарії, парфумерії та харчової промисловості. Суть способу полягає в отриманні біомаси культивованих клітин рослин у стерильних умовах в біореакторах промислового обсягу. Суть методу виражається в наступному: з одиничного рослини виділяють клітини і отримують за відпрацьованою технологією культуру клітин цієї рослини, тобто клітини, здатні активно рости при багаторазових пересіву. Для нарощування значних кількостей клітинної біомаси використовують біореактори значних обсягів, аж до десятків куб. м. Часто біомаса клітин in vitro перевершує за властивостями природне або плантаційне сировину. На сьогоднішній день природні сировинні запаси лікарських рослин виснажуються, багато видів (женьшень, золотий і маралів корінь, солодка) знаходяться на межі зникнення. Плантаційний спосіб вирощування часто нерентабельний, непридатний для тропічних рослин, рідкісних, зникаючих видів лікарських рослин і передбачає використання гербіцидів, інсектицидів, що негативно позначається на якості одержуваного сировини та її екологічності. Таким чином, за відсутності ареалу виростання високоцінної лікарської рослини або у зв’язку з його вкрай рідкісною зустрічаються на будь-якому з континентів земної кулі отримання біомаси культур клітин виявляється незамінною. При цьому аналоги розробляються в проекті лікарських засобів за хімічною структурою, біологічної ефективності і спектру властивостей у світовій практиці фактично відсутні.

Переваги біопрепарату: Не дивлячись на те, що дані біологічні субстанції загальновідомі в світовій практиці, пропоновані до комерціалізації біопрепарати є принципово новими продуктами на відповідному ринку біопрепаратів:

1) вперше пропонується випускати клітинні біомаси, отримані в штучно відтворених «природних» умовах, що стали можливими завдяки: — Оригінальному штаму клітинної культури, створеному автором і не має аналогів у світі (де стабільний синтез вторинних метаболітів у клітинах in vitro можливий тільки для з'єднань, що сприяють проліферації клітин — ця концепція ефективно використовується для цілеспрямованого отримання штамів-продуцентів культур рослинних клітин); - Унікальної біотехнології відтворення клітинної маси, розробленої за участю вчених МДУ і ІФР (не дивлячись на неодноразові спроби біотехнологів, заяву аналогічного продукту на Західному ринку не відбулося саме через відсутність рівноцінних стабільних технологій продукування клітинної маси, зокрема з Dioscorea deltoidea. Автором вивчений зростання суспензійних культур клітин рослин і розроблена ефективна система і способи їх вирощування, де застосовуються закономірності росту культур клітин в періодичному, напівпроточних, проточному (хемостат, закритий протока) режимах культивування в біореакторах різної конструкції і обсягу).

2) вперше пропонується екстенсивно вийти на ринок космоцевтікі з біопрепаратом даного класу (субстанції фуростанолового глікозидів стабільного контрольованого змісту), що стало можливим завдяки розробленій за участю авторів тексту оригінальною технологією масового виробництва субстанції з культивованої клітинної культури Dioscorea deltoidea.

3) авторами розробки реалізовані багаторазово менш трудомісткі і менш витратні методи виділення діючої субстанції з клітинної маси.

4) Продукція вирішує проблеми споживачів:рядовий споживач вирішує для себе проблему забезпечення доступним і, що дуже важливо — ефективним і безпечним лікувально-профілактичним засобом за доступною ціною. Біопрепарат відповідає таким критеріям:

— Широкий спектр дії біопрепаратів;

— Ефективність (явний оздоровчий ефект);

— Порівняно низька ціна;

— Добрі рекомендації (від лікарів, спеціалістів, які мають досвід збуту БАДів на ринку РФ, вченими і т.д.).

Виробники вирішують для себе проблему необхідності додаткової експансії на ринку, підвищення конкурентоспроможності своєї продукції, що випускається. Так, виробники харчової продукції, що орієнтуються на сектор продуктів функціонального призначення (тут — лікувально-профілактичних продуктів харчування), отримують можливість проривного виходу на ринок з продуктами незвичайного, досить нового і широкого спектру лікувально-профілактичної дії. Виробники косметичної продукції - кремів, бальзамів, пін і т. п. — отримують у своє розпорядження інгредієнт, який будучи застосовуємо в мізерних кількостях (отже — мала націнка) надає ефективну і зриме захисне і відновлює дію на шкіру. Для таких виробників дуже важлива динамічна реакція споживачів на що випускається косметичний продукт, так як вкладення в запуск і розкручування його на ринку, як правило, вельми великі в цій області. Наявність таких яскраво виражених актопротекторний характеристик у пропонованого препарату, на нашу думку, буде відразу відзначено і підтверджено споживачами.

3.4 Характиристика біологічного об'єкту.

Основним типом культивованої рослинної клітини є калус. Значно рідше культивують клітини пухлин рослин різного походження. Культури пухлинних клітин незалежно від способу культивування на рівні морфології мало відрізняються від культур калусних клітин. Значною фізіологічною відміною між ними є гормононезалежний пухлинних клітин, що дозволяє їм ділитися і рости на поживних середовищах без добавок фітогормонів або їх аналогів. Однак пухлинні клітини позбавлені здатності давати початок нормально організованим структурам. У деяких випадках вони здатні утворювати тератоми (потворні органоподобні структури), нормальний розвиток яких не походить. Калусні клітини в пересадковій культурі можуть спонтано отримати гормононезалежність. Природа такої незалежності до ауксину і цитокинин, найчастіше застосовуваним при вирощуванні клітинних культур рослин, може бути генетичної (результат мутації) або епігенетичної (результат експресії генів, що визначають гормононезалежність клітини). При генетичній гормононезалежності калусні клітини поводяться як пухлинні, при епігенетичної вони мають ознака в ряду перетворень клітина — рослина — клітина. Калусних клітина, в результаті поділу якої виникає калусная тканина, або калус, представляє один з типів клітинної диференціювання, притаманній вищій рослині. Для рослини калус є тканиною, що виникає при виняткових обставинах (зазвичай при травмах) і функціонуючої нетривалий час.

Ця тканина захищає травмоване місце, накопичує живильні речовини для анатомічної регенерації або генерації органу. Для отримання культивованих калусних клітин in vitro фрагменти тканин різних органів вищих рослин (експланти) поміщають на штучне живильне середовище в пробірки, колби, чашки Петрі. Процес отримання первинного калусу і підтримка пересадковою культури вимагає строго стерильних умов. Для цього за допомогою стерильних розчинів, що містять хлор або ртуть (гіпохлорити, сулема, діацід), до яких для кращого змочування додані детергенти, стерилізуют експланти, ретельно відмиваючи їх потім від використовуваного розчин стерильною водою. Живильні середовища, розчини, інструменти, матеріали, необхідні для роботи, стерилізують в автоклавах або сухожарових шафах. Всі маніпуляції з культурами проводять в мікробіологічних боксах, опромінюваних перед роботою ультрафіолетом, або ламінарбоксах, де стерильність досягається постійною подачею стерільной повітря в робочий об'єм. Особливості дедіфференціровкі клітин експланти і каллусогенеза залежать від епігенетичних характеристик складових його тканин. Клітини спеціалізованих тканин, експлантованних на живильне середовище, що містить мінеральні солі, джерела вуглецю, вітаміни і гормоноподібні речовини, тобто структури, характерні для їх специфічної функції в рослині, і повернутися до стану ділиться клітини. Часто експланти, що використовують для отримання калусу, є фрагментом органу і включає тканини, клітини яких по-різному диференційовані. Різне тканинне походження первинних калусних клітин є однією з причин гетерогенності культури калусної тканини, так як деякі функциональні особливості вихідних диференційованих клітин передаються у ряді клітинних поколінь як стійкі модифікації або епігенетично успадковані ознаки. У клітинах експланти, що складається з неподілених спеціалізованих клітин, на самому початку культивування можуть спостерігатися зміни в метаболізмі, що викликаються і травматичними синтезами, і діференцировка, і підготовкою до процесу розподілу. Для розділення цих процесів можна застосовувати предінкубацію експлантів на середовищі без гормонів протягом декількох діб (3−6). Це дозволяє виключити не тільки зміни, пов’язані з травмою, але й можливе неконтрольоване вплив ендогенних гормонів експлантати на досліджувані процеси. У підготовлювану до поділу клітці стимулюється синтез всіх типів РНК, зникають тканспеціфічні білки-антигени і з’являються білки, специфічні для клітин, які діляться і калусної тканини. Це свідчить про зміну активності генів і білкового апарату клітин при діференціровці. Освіта калусу не у всіх випадках пов’язане з травматичним впливом. Калус може виникнути в результаті проліферації внутрішніх тканин експланти без зв’язку з поверхнею зрізу. Зростаючий калус розриває шари тканини і розвивається на поверхні. Освіта калусу при експлантуванні фрагмента тканини в умовах in vitro свій-ного дводольним і однодольних покритонасінних і голонасінних рослинам, папоротям, мохам, печеночникам. Первинний калус, що виник на експланти через 4−6 тижнів (залежно від швидкості росту клітин), переноситься на свіжу живильну середу (субкультівіється). Розмір трансплантації при культивуванні на агаризованому живильному середовищі зазвичай становить від 60 до 100 мг маси тканини на 30−40 мл живильного середовища. Таким чином, техніка культивування тканин рослин дозволяє отримати тривалу пересадочних калусних культуру з будь-яких живих тканинних клітин інтактного рослини. Клітини різному дифференцирувати (у тому числі і меристематические) переходять in vitro до складного процесу дедиференціації, втрачають притаманну їм структурне організацію і специфічні функції і індукуються до справжньої, утворюючи первинний калус. У процесі субкультування формується штам, характеризує індивідуальними генетичними і фізіологічним можливостям. При культивуванні рослинних клітин і при вирощуванні культури тканин застосовуються середовища Мурасіге — Скуга, Нагата — Такебе, Хеллера, Нича-Нича, Кнудсон та інші в різних модифікаціях. Основними компонентами поживних середовищ для культури клітин і тканин рослин є мінеральні солі (макро-і мікроелементи), джерело вуглецевого живлення (зазвичай сахароза або глюкоза), вітаміни, регулятори росту. Іноді до складу поживних середовищ включають комплексні органічні добавки (гідролізат казеїну або суміш амінокислот, дріжджовий екстракт, екстракти з різних органів рослин).

Методи вирощування культури калусних тканин.

Поверхневе культивування. Культура калусних тканин вирощується поверхневим способом на напіврідкому агаризованому середовищі (концентрація агару — 0,6−1%), де із застосуванням інших желюючих полімерів або на містках з фільтрувального паперу або дисках з пінополіуретану, занурених у рідке живильне середовище. Калусна тканина, що вирощується поверхневим способом, представляє собою аморфну?? масу тонкостінних паренхімних клітин, що не має чітко визначеної анатомічної структури. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим або червоним; пігментованим повністю або зонально.

Рисунок 3.4-Культивування калусу на живильному середовищі.

Залежно від походження і умов вирощування калусних тканини бувають:

1) пухкими, сильно обводненими, легко розсипається на окремі клітини,.

2) середньої щільності, з добре вираженіми меристематические вогнищами;

3) щільними, із зонами редукуватиго камбію і судин.

Як правило, в тривалій пересадковою культурі, на середовищах, де є ауксини, особливо синтетичний аналог ауксину — 2,4 — дихлор-феноксиуксусной кислоту (2,4 — Д), калусні тканини втрачають пігментацію і стають більш пухкими. У циклі вирощування калусні клітини після низки поділів проходять звичайний для клітини рослин онтогенез: вони приступають до зростання розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калусниі клітини і, нарешті, деградують. Калусні клітини, вирощувані поверхневим способом, часто застосовують для збереження в зростаючому стані колекцій різних штамів, ліній, мутантів, для регенерації рослин, з них також виходять суспензії клітин, культивованих в рідкому живильному середовищі. [4].

Суспензійне культивування. Культури клітин рослин, що вирощуються в рідкому живильному середовищі, зазвичай називають суспензійного культурами. Термін цей не є строго науковим і точним, так як не пояснює основний особливості поведінки клітин при такому вирощуванні. Отримано ще порівняно мало культур клітин вищих рослин, за своїми параметрами повністю задовольняють вимогам суспензіоного (глибинного) культивування. Значною мірою це ґрунтується труднощами отримання культури клітин, що складається переваг громадської з окремих клітин або невеликих їх агрегатів. Безумовно, вирощування клітинних суспензій в рідкій живильної середи має ряд переваг перед вирощуванням калусних клітин поверхневим способом. Суспензійні культури зручніше для проведення біохімічних і молекулярно-біологічних експериментів — вивчення індукції ферментів і зв’язку їх з подіями клітинного циклу, експресії та репресії певних генів, ізолювання і характеристик мутантів. Суспензійну культуру можна отримати з фрагментів органу рослини (диски запасаючої паренхіми м’ясистих коренів моркви, петрушки, бульб картоплі та ін), проте цей шлях більш трудомісткий і вимагає більшого часу. Клітини експланти повинні при цьому утворювати первинний калус, і тільки після цього поверхневі калусні клітини, що потрапили в рідку середу і розмножилися в ній, дадуть початок лінії, здатної рости в суспензії. Зазвичай для отримання культури клітин використовується культура калусной тканини. Пухкі обводнені культури калусних тканин більш придатні для переведення в суспензію, ніж структуровані щільні калус[9]. Оптимальними підходами для отримання суспензії є вирощування калусів на середовищі з 2,4 — Д, виключення з середовища іонів кальцію, обробка пектиназа трансплантації, призначеного для вирощування в суспензійний культурі. Для отримання культури клітин береться найбільш життєздатна частину калусної тканини, а її кількість повинна бути в 15−20 разів більше в розрахунку на обсяг живильного середовища, ніж при серійному культивуванні на агарі. При цьому може використовуватися живильне середовище того ж складу, що і для поверхневого культивування, але в деяких випадках збільшують кількість ауксинів і (або) зменшують кількість цитокінів. Режим перемішування та аерації при ініціації культури клітин зазвичай такий же, як і при подальших серійних субкультуванні культур клітин на ролерах і гойдалках (кругова гойдалка -10−12 оборотів / хв). Освіта первинної суспензії рослинних клітин можна вважають результатом трьох процесів:

1) розпадання калусної тканини на клітини і невеликі клітинні агрегати в момент внесення в рідку живильне середовище,.

2) відділення клітин і клітинних агрегатів з поверхні шматочків тканини протягом перших субкультуванні;

3) ділення і росту клітин, що утворилися по перших двох способів, і розростаються клітинних агрегатів на більш дрібні агрегати і клітини. Останній процес є типовим для зростання стабілізувати розщепленої культури клітин вищих рослин. Первинну суспензію перед субкультивуванням або в спец. циліндрі поділяють на фракції за швидкістю седиментації (викорис — товують вехньої фракцію), або фільтрують через 1−2 шари марлі, нейлонові або металеві сита, щоб позбутися від великих щільних шматків калусної тканини, залишків експланти і дуже великих агрегатів. Фільтрування рекомендується і в кількох наступних субкультуваннях до придбання клітинної суспензією бажаних характеристик. Однак агрегованість суспензії залежить не тільки від характеристик початкової лінії, але і від умов культивування. Для глибинного культивування рослинних клітин застосовують способи, розроблені для мікробіологічних цілей. Використовують закриті або відкриті системи в періодичному або проточному режимах. Хоча при глибинному вирощуванні рослинних клітин принцип турбідостата практично не застосовується. Однією з причин цього є руйнування частини клітин при відведенні їх до оптичного приладу. Вирощування суспензії клітин рослин в установках безперервного культивування за принципом хемостат застосовується як для вивчення метаболізму клітин, стабільно підтримуються в різних фазах клітинного циклу, так і при промисловому вирощуванні клітинної біомаси з метою отримання економічно важливих продуктів. Однак до теперішнього часу найбільш вивченим і поширеним режимом глибинного культивування клітинних суспензій є закрита періодична система. У цьому випадку для аерації та перемішування суспензії використовують ролери, гойдалки, ферментери з механічними і магнітними мішалками або ферментера барботажного типу, де аерація і перемішування здійснюється повітряним потоком. Критеріями росту в циклі вирощування служить збільшення числа клітин, їх сирої та сухої маси. Модельна ростова крива має типові Б-подібну форму (рис. 3.5).

Рисунок 3.5-Модельна ростова крива На ній розрізняють: Фази кривої зростання популяції рослинних клітин: I — лаг-фаза; II — експоненціальна фаза; III — фаза лінійного росту; IV — фаза уповільненого зростання; V — стаціонарна фаза; VI — фаза відмирання.

1) латентну (лаг) фазу, в якій видимий ріст інокуляту не так видно не по одному з критеріїв. При цьому спостерігається висока інтенсивність дихання, максимальні значення енергетичного рівня, інтенсивний синтез ДНК, РНК, білків та інших компонентів клітини, але низький мітотичний рівень. Тривалість періоду адаптації залежить від кількості та фізіологічного стану інокуляту й умовний культивування;

2) експонентну фазу, що характеризується зростанням з максібітної швидкістю, максимальними величинами мітотичної активності, а також переважанням дрібних клітин меристематичниго типу;

3) лінійну, протягом якої швидкість росту постійна;

4) фазу уповільненого зростання, пов’язаного з субстратним лімітованих та інгібуванням продуктами обміну, що характеризується незбалансованим зростанням популяції за основними критеріями, зниженням рівня дихання, переходом частини клітин в диференційоване складаючись, збільшенням частки великих вакуолізірованние клітин, збільшенням синтезу вторинних метаболітів (серцевих глікозидів, антрахінону, диосгенина);

5) стаціонарну фазу, що характеризується ще малою швидкістю деградації клітин, яка врівноважується поділом клітин, високіми біосинтетичними і біотрансформуються потенціями життєздатних диференційованих клітин, низьким рівнем дихання і явищем надзвичайно великих вакуолізуванням клітин;

6) фазу деградації клітин з питомою швидкістю росту, що приймає негативне значення. Форма реальних ростових кривих може значно відрізнятися тривалістю фаз від модельної. Процеси ростового циклу залежать від виду рослини, кількості внесеного матеріалу і умов культивування (склад живильного середовища, температура, початкове значення рН, склад газової фази, швидкість перемішування). Первинний і вторинний метаболізм культивованих клітин рослин відоспеціфічний, залежить від типу диференціювання вихідних клітин рослини і регулюється умовами вирощування. Генетична мінливість клітин як наслідок їх культивування поза організмом, зникнення одних і поява інших стійких ознак, що передаються у ряді клітинних поколінь, призводить до виникнення з первинної калусної тканини генетично і фенотипічно розрізняються ліній клітин. Це дозволяє відібрати або створити експериментально лінії, що зберігають біосинтетичні системи, характерні для вихідної рослини, і лінії, що синтезують принципово нові речовини. Культивування окремих клітин джерелом окремих (одиночних) клітин є клітинні суспензії в рідкому живильному середовищі, мацерація тканин рослин, ізольованої протопласти після відновлення ними клітинної стінки. Причому ізольовані протопласти є ідеальними окремими клітинами. Культивування окремих клітин дозволяє отримувати клони і досліджувати генетичну і фізіологічну стабільність чи мінливість при вирощуванні клонового матеріалу. Окремі клітини важливі для клонової селекції мутантних, гібридних, трансформованої ліній. Зазвичай в ці клітини вводять маркерні гени або створюють маркерні ознаки для забезпечення селективних умов відбору. Мацерованної клітини тканини рослини є гарною моделлю для порівняльного вивчення фізіологічних процесів в тканини і відслушною клітині. Разом з тим при культивуванні цих клітин на середовищі, стимулюючої поділ клітин, вони диференціюються і утворюють калусні клітини. Для отримання окремих мацерованної клітин використовують спеціальні мацеріруєтся ферментативні препарати, що містять мацеразу (полігалактуронази), пектиназу, полівінілпіролідон, сульфат калію, сорбіт (маніт), 2-ГЯ-морфоліно-етансульфонова кислоту. Дана процедура проводиться в ламінарному боксі в умовах суворої стерильності. Окремі клітини також можуть бути отримані з суспензій із використанням мікроманіпулятора, проточного цитофлюориметрів або шляхом послідовних розбавлень. У цьому випадку суспензії готуються різними способами:

1) 1 -2 мл суспензії відбирають з супернатанта після осідання основної маси клітин,.

2) суспензію фільтрують через фільтри з зменшеним діаметром пор. Для послідовних разкладів використовують плати для мікротітрувань, що дозволяє мікроскопічно контролювати клітинний склад при послідовних розведеннях.Індукція поділок окремих клітин можлива при застосуванні дуже багатою живильного середовища, причому об'єм середовища повинен бути мінімальним. Однак навіть при дотриманні всіх цих умов відсоток розділилися клітин залишається дуже низьким. Більш ефективні методи «годуючого шару» або «тканини-няньки». Для створення «годуючого шару» беруть суспензію клітин того ж виду рослини. Клітинна суспензія повинна знаходитися в ранній стадії ростового циклу. Калусна культура, що служить «тканиною-нянькою», також повинна бути в стадії активного зростання. При досягненні колонією, що виросла з окремої клітини, розміра 0,5−1 мм, вона може бути перенесена для подальшого вирощування на агаризоване живильне середовище безпосередньо або на фільтр, поміщений на поверхню поживного агару. Використання «годуючого шару», «тканини-няньки» або мінімального обсягу середовища, в яку поміщається окрема клітина, пов’язане з явищем, званим «дія фактора кондиціонування». Незважаючи на численні спроби визначити природу речовин, які індукують поділ окреної клітини, і механізм дії фактора кондиціонування, дане питання остаточно не вирішене. Вивчення механізму взаємодії клітин при розмноженні їх в популяції - важлива наукова проблема, яка вирішується на рівні культивування окремих клітин. [9].

Принципи складання поживних середовіщ Всі живі клітини потребуються екзогенних джерелах живлення, что тримаються в поживних середовищах. Живильне середовище забезпечує жіттєдіяльність, ріст і розвиток біооб'єктів. Перш ніж починати роботи з культівування різніх тіпів клітін, звітність, точно знаті їх.

Постійнім компонентом поживної середи є вода, в якій потребуються всі живі клітини. Живильні речовини утворюють (мінеральнісолі, цукри, амінокислоти, карбонові кислоти, спирту, альдегіди) або колоїдні (білки, ліпіді, неорганічні з'єднання) розчини. Деякі компоненти поживних середовищ, що знаходяться в твердому агрегатному стані, можуть або утворюваті придонних облог, або рівномірно розподілятіся по всьому об'єму у вигляді суспензії, або плавати на поверхні розчин (частки вугілля). Жидкі вуглеводні при внесенні у воду утворюють фракцію, что не змішується. У живильному середовіщі повинні буті присутні всі елєменти, необхідні для побудова компонентів живих клітін в доступній для усвійськовій формі. У великих кількостях клітинам необхідні макроелементи: вуглець, азот, кисень, воден, фосфор, сірка, калій, кальцій, магній. Постачання клітін киснем здійснюється за рахунок води. Вуглець є складових частин всех органічних з'єднань и его джерела численні и різноманітні: найчастіше цукри, багатоатомні спиртами и органічні кислоти. У якості азотного субстрату для виготовлення поживніх середовищ службовців у основного білки твариного і рослиного походження. Крім макроелементів, клітини потрібні деяк мікроелементах: натрій, марганець, нікель, кобальт, хлор, цинк, мідь, кремній, молібден, бор, ванадій и деякі інші. Крім основних пластичних и енергетичних компонентів, живильне середовища може містити і так звані чинниками зростання. Це органічні з'єднання (вітаміни, амінокислоти, пурінові и пірімідінові підстави та ін), в яких потребуються ауксотрофності клітини и які сінтезувати не в змозі. Відсутність таких речовин приводить до порушення обмінних процесів и припиненням зростання клітин. В якості необхідніх компонентів поживної середи можуть виступати гази: (КН3, Н2б), помірно (С02) або погано (1ч2, 02, Н2, СН4) розчинні у воді. Живильні середовища можуть мати невизначений склад, тобто включати біогенні добавки (рослиного, твариного або мікробного оходження). Застосовують також середовища, приготовані з чисто хімічних. Сполука у заздалегідь визначених співвідношеннях. Це так звані синтетичні середовища. Застосування знаходять и полусинтичні поживних середовища, що поєднують у своєму складі компоненти як натуральних, так и синтетичних середовіщ. Середовіща даних типів мают як переваги, так и недоліки.

З Економічної точки зору найбільш доцільно використання природного, більш дешевої сировини, ніж речовини в чистому вигляді. Однак тільки застосування середи дозволяє точно реєструвати и регулювати протікання в культуральному середовищі.

Процеси, які допомагають їх оптімізації. Компромісним підходом є використання напівсинтетичних середовищ, до складу яких поряд із з'єднаннями відомої хімічної природи входять біогенні добавки. В якості біологічних добавок для індукції первинного калусу можно використовувати рослинні екстракти (10−15% від загального обсягу середовища): кокосове молоко (рідкий ендосперм кокосового горіха), витяжки з незрілих зернівок кукурудзи (краще в період молочної стиглості), які містять цитокініни — кинетин і зеатин (6-ти заміщені амінопурин) і NN-діфенілмочевіна.У культурі in vitro застосовують рідкі та агаризовані (тверді) середовища. Рідкі середовища використовуються для культивування суспензій, калусов, ізольованих органів і тканин, рослин — регенерантів. При цьому для підтримки експлантів в пробірці з середовищем поміщають спеціальні містки — підтримки з фільтрувального паперу або синтетичних пористих матеріалів. Агаризовані середовища готують на основі агар-агару — полісахариду, що входить до складу морських водоростей, який утворює з водою гель при pH 5,6−6,0. іноді в якості ущільнювача і замінника агар-агару використовують поліакриламідні гелі (біогелі) P10 і P200. Для штучних поживних середовищ розчини макро-і мікросолей готують заздалегідь і використовують багато разів. Це маткові (концентровані) розчини. Їх зберігають у спеціальних умовах: макро-і мікросолі в холодильнику в посудинах з притертими пробками при 0… +4 оС; вітаміни, фітогормони, ферменти, рослинні екстракти — при-20 оС в невеликих по 5−10 мл посудинах з пробками (пеніцилові флакони). Маткові розчини макросолей зазвичай перевершують робітники по концентрації в 10−40 разів, мікросолей — в 100−1000 разів, вітамінів — в 1000 разів. Розчини фітогормонів бажано готувати безпосередньо перед роботою з середовищами. Для приготування маточного розчину макро-і мікросолей кожну сіль розчиняють в окремому стаканчику при нагріванні, потім зливають і доводять до потрібного обсягу. В охолоджену суміш мікросолей останнім додають розчин солей молібдену, а в макросолі - розчин солей магнію (для запобігання випаданню осаду). Маткові розчини хлористого кальцію і хелату заліза (сірчанокисле залізо + ЕДТА, або Na ЕДТА — трилон Б) готують і зберігають окремо від інших солей. Концентровані розчини вітамінів готують наступним чином: 10-кратні навішування розчиняють у 10 мл дистильованої води кожен окремо. Фітогормони — це речовини, які погано розчиняються у воді. Тому попередньо 100 мг речовини розчиняють у невеликих кількостях (0,5−2,0 мл) спирту (ауксини, гібереліни), 0,5−1н HCl або КОН (цитокініни), потім підігрівають до повного розчинення (крім абсцизовой кислоти і кінетіна) і доводять до 100 мл об'єму (1 мл містить 1 мг речовини). У таблиці представлено склад найбільш часто використовуваних живильних середовищ. Як правило, починаючи працювати з новим об'єктом, дослідники модифікують складу стандартних середовищ, особливо часто варіюючи концентрації і набір органічних компонентів. Приватні приклади поживних середовищ (рис. 3.6).

Рисунок3.6 — Приватні приклади поживних середовищ.

3.5 Опис технологічного процесу.

Рисунок 3.7-Гідро-пневматична схема виробництва гінзенозиду СТ1.1-приготування компонентів живильного середовища; Ст1.2.-підготовка води; Ст1.3-приготування живильного середовища; ТП2-приготування спирту етилового; ТП3-нарощування біомаси; ТП4-екстракція біомаси; ТП5-очищення витяжки; ТП6-відстоювання і фільтрування напівфабрикату; ТП7-отримання настоянки; ПМВ1-розлив та маркування; ПМВ2-пакування сухої речовини Приміщення для роботи з культурами клітин Стерилізація живильних середовищ, як і всі інші маніпуляції при роботі з клітинними культурами, проводиться в боксових приміщеннях або в ламінарному боксах. Боксове приміщення являє собою ізольовану кімнату з не сорбуючим пил покриттями, що має передбоксник і забезпечену необхідним загальним і спеціальним освітленням, системами припливної та витяжної вентиляції, холодним і гарячим водопостачанням, а також підводами газів та стисненого повітря. Альтернативою боксовим приміщенням, що вимагає менших витрат на устаткування, є ламінар-бокси, або стерильні робочі місця. У цьому випадку в будь-якому приміщенні може бути створений локальний стерільний об’ем, необхідний для роботи і створює біологічну захист користувачів. Технічно завдання вирішується шляхом постійного обдування місця проведення робіт ламінарним потоком. При роботі з завідомо непатогенними матеріалами потік Обезпилення повітря з робочої зони виходить безпосередньо в навколишній простір. У випадку роботи з потенційно патогенним матеріалом повітря перед виходом з робочої зони додатково фільтрується, можливість обдування оператора при цьому виключена. Залежно від пристрою ламінар-боксу потік обезпилення повітря в робочій зоні може бути горизонтальним, вертикальним або похилим.

Ламінар-бокс з горизонтальним потоком. Обезпилення повітря типу УОБГ (установка обеспилування біологічна з горизонтальним потоком) забезпечує очищення повітря, що подається в робочу зону, шляхом фільтрації на фільтрах грубого і тонкого очищення, вбудованих в прилад (у міру забруднення грубий фільтр промивається, тонкий змінюється). Прилад має вбудовані джерела освітлення, УФ опромінення (для стерилізації робочої зони в перервах між використанням боксу) і регулятор швидкості повітряного потоку. [11].