Изучение возможности применения метода амплитудного анализа лазерного излучения для изучения плотности микробных популяций и закономерностей их роста в раз

Тип работы:
Лабораторная работа
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Изучение возможности применения метода амплитудного анализа лазерного излучения для изучения плотности микробных популяций и закономерностей их роста в различных условиях

Цейтлин В.А., Бахир А. Н.

Изучены зависимости светорассеяния популяций Staphilococcus aureus и Esherichia coli в питательном бульоне с различными добавками и физиологическом растворе. Обнаружены заметные различия в закономерностях, показывающие зависимость светорассеяния от состояния клеточной стенки и цитоплазмы. Для клеточной суспензии в питательном бульоне показана возможность использования светорассеяния для количественного анализа плотности популяции и оценки кинетических параметров роста.

Измерение плотности популяции и параметры роста всегда представляют интерес во многих исследованиях. Популяции микроорганизмов удобны краткостью жизненного цикла, но часто оценка плотности популяций представляет большую проблему. Предложено много методов решения от простого подсчета клеток в поле видимости до использования продуктов метаболизма и различных связанных с обменом веществ параметров [1,2]. Полезным может быть использование физико-химических методов в силу их универсальности, интегральности и быстроты получения результатов. Микроорганизмы по размерам близки к типичным коллоидным системам и перспективным представляется использование методов их исследования. Важным свойством, отличающим коллоидные системы от истинных растворов, является светорассеяние, которое зависит от размерного распределения дисперсных частиц и от оптических свойств материала их составляющего.

Целью исследований была оценка возможностей метода светорассеяния в изучении микробных популяций. Использовалась установка для регистрации светорассеяния в виде амплитудного анализа лазерного излучения [3]. Основа метода состоит в зависимости номера регистрирующего канала на который приходит максимум от плотности суспензии и размеров составляющих частиц, установлен рост номера максимума с увеличением размера и увеличением количества рассеивающих частиц в единице объема системы. Для стационарной популяции можно постулировать неизменность размерного распределения клеток и зависимость рассеяния только от плотности микробной взвеси.

Для получения стандартных плотностей микробных взвесей использовался стандарт мутности на 109 клеток и создавались разведения десятичным логарифмом плотности равным: в пятом — 4, четвертом — 5, третьем — 6, втором — 7, первом — 8 и, соответственно, в нулевом — 9. Растворы использовались для построения калибровочного графика плотность популяции — номер канала, по которому в дальнейшем определялись плотности популяций для кинетических исследований.

Взвеси микробных клеток готовились на основе физиологического раствора и питательного бульона ГРМ, для изучения влияния добавок в бульон добавлялись хлорид натрия и глюкоза: к 9 мл исходного бульона добавляется 1 мл насыщенного раствора соли (36 г в 100 г воды) или 1 мл раствора глюкозы (10 г в 100 мл воды). Расчет показывает около 3% по соли и 1% по глюкозе, таким образом, следует ожидать очень заметного смещения осмотических равновесий.

Для описания роста популяций использовалась общая модель Ферхюльста-Пирла

с линеаризацией для определения параметров

светорассеяние популяция лазерное излучение

Рисунок 1. Калибровочные кривые

Обработанные по этой форме данные использовались для построения графика в координатах (v/N) — N, для получения зависимости между плотностью популяции и номером канала использовалась стандартная операция пакета Excel Microsoft Office подбора уравнения нелинейного тренда для набора точек, а для получения численных значений констант уравнения Ферхюльста-Пирла — линейногоДля сравнения данных и решения вопроса переносимости данных в физиологическом растворе для оценки роста в питательном бульоне были построены калибровочные графики для взвесей в бульоне и физрастворе. В результате собственных исследований установлено, что имеется различие очевидное графиков для обеих микробных популяций (рис. 1). Причинами могут быть процессы роста в бульоне и невозможность их в физрастворе, с этим будут связаны различия в состояниях клеточных мембран и цитоплазмы. Для E. coli соотношение зависимостей в физрастворе и бульоне отлично от S. aureus., объяснить это можно из-за большей подверженности клеточных мембран кишечной палочки осмотическим воздействиям [1]. Очевидна большая применимость метода для низших разведений, для нулевого — второго разведений изменение плотности клеточной взвеси в десять раз приводит к заметному сдвигу в номере канала, а для третьего — пятого сдвиги находятся на грани ошибки метода. Для оценки ожидаемого вида кривой с учетом всех влияний можно провести среднюю аппроксимирующую линию. Большие различия зависимостей светорассеяния в бульоне и в физрастворе указывают на невозможность использования результатов в физрастворе для других растворов и необходимость построения калибровочных кривых для каждого раствора конкретно с обязательным учетом возможных процессов роста.

Рисунок 2. Калибровочные кривые

Обработанные по этой форме данные использовались для построения графика в координатах (v/N) — N, для получения зависимости между плотностью популяции и номером канала использовалась стандартная операция пакета Excel Microsoft Office подбора уравнения нелинейного тренда для набора точек, а для получения численных значений констант уравнения Ферхюльста — Пирла — линейногоДля сравнения данных и решения вопроса переносимости данных в физиологическом растворе для оценки роста в питательном бульоне были построены калибровочные графики для взвесей в бульоне и физрастворе. В результате собственных исследований установлено, что имеется различие очевидное графиков для обеих микробных популяций (рис. 1). Причинами могут быть процессы роста в бульоне и невозможность их в физрастворе, с этим будут связаны различия в состояниях клеточных мембран и цитоплазмы.

Для E. coli соотношение зависимостей в физрастворе и бульоне отлично от S. aureus., объяснить это можно из-за большей подверженности клеточных мембран кишечной палочки осмотическим воздействиям [1].

Очевидна большая применимость метода для низших разведений, для нулевого — второго разведений изменение плотности клеточной взвеси в десять раз приводит к заметному сдвигу в номере канала, а для третьего — пятого сдвиги находятся на грани ошибки метода. Для оценки ожидаемого вида кривой с учетом всех влияний можно провести среднюю аппроксимирующую линию. Большие различия зависимостей светорассеяния в бульоне и в физрастворе указывают на невозможность использования результатов в физрастворе для других растворов и необходимость построения калибровочных кривых для каждого раствора конкретно с обязательным учетом возможных процессов роста.

Рисунок 2. Зависимость положения максимума для взвесей:

А- S. aur; B- E. coli. — аппроксимирующая кривая.

Для оценки возможности применения метода амплитудного анализа для изучения процессов роста была исследована зависимость светорассеяния взвесей S. aureus и E. coli во втором разведении в исходном бульоне и бульоне с добавками соли и глюкозы. Были получены следующие результаты (рис. 2). Зависимости максимумов каналов и плотности популяций от времени приведены в таблицах 1 (стафилококк) и 2 (кишечная палочка). С помощью калибровочных кривых были оценены плотности популяций и кинетические параметры.

Таблица № 1

t, мин.

n, канал

lg N

N

(N/t) /N

Уравнение

без добавок

0

245

7,873

7,47107

-

dN/dt= (0,056−210-10N) N

15

271

8,104

1,27108

0,0274

30

288

8,257

1,81108

0,0199

45

294

8,312

2,05108

0,0079

60

299

8,358

2,28108

0,0067

с добавкой соли

0

160

7,524

3,34107

-

dN/dt= (0,048−10-9N) N

15

170

7,571

3,73107

0,0069

30

175

7,595

3,94107

0,0035

45

179

7,614

4,11107

0,0028

60

181

7,623

4, 20107

0,0014

с добавкой глюкозы

0

213

6,0975

1,25106

-

dN/dt= (0,063−410-10N) N

15

230

7,211

1,63107

0,0615

30

239

7,613

4,10107

0,0403

45

248

7,886

7,69107

0,0311

60

262

8,053

1,13108

0,0212

Результаты линеаризации данных показывают изменение обеих констант в уравнении, но наблюдается большее изменение под влиянием добавок постоянной роста в уравнении Ферхюльста — Пирла по сравнению с константой угнетения. Наблюдается закономерный рост константы роста в ряду «бульон с солью» — «чистый бульон» — «бульон с глюкозой» для обеих популяций.

Таблица № 2

t, мин.

n, канал

lg N

N

(N/t) /N

Уравнение

без добавок

0

257

8,053

1,13108

-

dN/dt= (0,039−210-11N) N

15

268

8,378

2,39108

0,0351

30

278

8,663

4,60107

0,0321

45

286

8,884

7,65108

0,0266

60

292

9,045

1,10109

0,0207

с добавкой соли

0

160

6,463

2,90106

-

dN/dt= (0,028−210-9N) N

15

167

6,617

4,14106

0,0199

30

173

6,749

5,61106

0,0174

45

177

6,836

6,85106

0,0121

60

181

6,923

8,37106

0,0121

с добавкой глюкозы

0

213

7,114

1,30107

dN/dt= (0,045−910-10N) N

15

230

7,330

2,14107

0,0261

30

242

7,478

3,01107

0,0193

45

249

7,563

3,66107

0,0119

60

254

7,624

4,21107

0,0086

Видно, что в случае бульона с добавкой соли резко возрастает константа угнетения и ее рост начинает оказывать преобладающее влияние на рост популяции.

Результаты исследования позволяют утверждать перспективность применения метода светорассеяния для исследования процессов роста и оценки плотности микробных популяций при высоких плотностях клеточных взвесей, когда другие методы дают наивысшую вероятность ошибок измерений.

Список литературы

1. Перт Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. — М.: Мир, 1978. — 332с.

2. Дикий И. Л. и др. Микробиология: Руководство к лабораторным занятиям. — К.: ИД «Профессионал», 2004. — 594 с.

3. Овчинников А. И. Фотометр на базе гамма — спектрометра. — Физическое образование в вузах. — 2004. — Т. 10, № 4. — с. 68 — 74.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой