Исследование эксцизионной репарации оснований ДНК в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius

Тип работы:
Дипломная
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Дипломная работа

Исследование эксцизионной репарации оснований ДНК в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius

СОДЕРЖАНИЕ

  • ВВЕДЕНИЕ
  • ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1.1 Повреждения азотистых оснований ДНК
    • 1.2 Окисление ДНК. 8-оксогуанин
    • 1.3 Дезаминирование оснований. Урацил
    • 1.4 Апурин-апиримидиновые сайты
    • 1.5 Эксцизионная репарация оснований ДНК
    • 1.6 Репарация ДНК в эмбриональном развитии
    • 1.7 Эмбриогенез морского ежа
  • МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2.1 Реактивы
    • 2.2 Дезоксирибоолигонуклеотиды
    • 2.3 Ферменты
    • 2.4 Стандартные буферы и смеси
    • 2.5 Выращивание эмбрионов морских ежей
    • 2.6 Приготовление клеточных экстрактов
    • 2.7 Измерение общей концентрации белка
    • 2.8 Введение 32P метки по 5'-концу ОДН
    • 2.9 Хроматографическая очистка меченого ОДН
    • 2. 10 Электрофоретическая очистка меченого ОДН
    • 2. 11 Определение выход после очистки и отжиг комплементарных цепей ОДН
    • 2. 12 Электрофоретический анализ ОДН
    • 2. 13 Электрофоретический анализ белков
    • 2. 14 Анализ расщепления ОДН клеточными экстрактами
    • 2. 15 Анализ ДНК-полимеразной активности экстрактов
    • 2. 16 Обработка результатов
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3.1 Поиск генов, кодирующих ферменты ЭРО в геноме морского ежа
    • 3.2 Выращивание эмбрионов морских ежей
    • 3.3 Приготовление экстрактов эмбрионов морских ежей
    • 3.4 Измерение активности ферментов репарации
      • 3.4.1 Активность урацил-ДНК-гликозилазы
      • 3.4.2 Активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы
      • 3.4.3 Активность AP-эндонуклеазы
      • 3.4.4 Активность ДНК-полимераз
  • ВЫВОДЫ
  • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8-oxoGua 7,8-дигидро-8-оксогуанин

Ade аденин

AP апурин/апиримидиновый (сайт)

Cyt цитозин

dN дезоксирибонуклеотиды

dNTP дезоксирибонуклеотидтрифосфат

Gua гуанин

PMSF фенилметансульфонил фторид

SDS додецилсульфат натрия

Tris трис (гидроксиметил)аминометан

Ura урацил

АФК активные формы кислорода

ДТТ 1,4-дитиотреитол

ОДН олигодезоксирибонуклеотид

ПААГ полиакриламидный гель

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭРО эксцизионная репарация оснований

ВВЕДЕНИЕ

Система эксцизионной репарации оснований (ЭРО) является одной и ферментативных систем клетки, препятствующих повреждению структуры ДНК. Повреждения происходят во всех клетках, содержащих ДНК, как вследствие экзогенного влияния, так и в ходе нормальных метаболических процессов. В активно пролиферирующих клетках необходимость поддержания интактной структуры ДНК обусловлена высокой интенсивностью процессов репликации. Поэтому большой интерес представляет изучение особенностей ЭРО в эмбриональном развитии живых организмов. эксцизионный репарация морской еж эмбрион

Удобными объектами для изучения молекулярных процессов, происходящих во время развития, являются иглокожие, в частности морские ежи рода Strongylocentrotus. Во-первых, эмбрионы иглокожих в природе подвергаются интенсивному воздействию внешней среды, приводящему к множественным повреждениям ДНК, что предполагает наличие у них высокого уровня активности ферментов репарации. Во-вторых, эмбриогенез морских ежей хорошо и подробно изучен, отработаны методики инкубации большого количества зародышей, позволяющие получать препарат эмбрионов на конкретной стали развития.

Целью данной работы было изучение активностей ключевых ферментов трех этапов эксцизионной репарации оснований в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius (A. Agassiz, 1863). Нами были поставлены следующие задачи:

— исследовать урацил-ДНК-гликозилазную и оксогуанин-ДНК-гликозилазную активности клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius;

— исследовать активность клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius, расщепляющую ДНК по AP-сайтам;

— исследовать ДНК-полимеразную активность клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ДНК — важнейшее соединение в живом организме, универсальный носитель генетической информации. ДНК в клетке относительно стабильна, однако ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100 000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных воздействий. Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к ее злокачественному перерождению. Поэтому одной из важнейших задач в живой клетке является поддержание неповрежденной структуры ДНК. Этим занимаются ферменты, принадлежащие к нескольким системам, объединенным названием «системы репарации ДНК».

Существует несколько главных систем репарации. Реактивация — процесс превращения поврежденных оснований в нормальные без расщепления ДНК и последующего синтеза. Так, например циклобутановые пиримидиновые димеры, образующиеся под действием УФ-облучения, превращаются в два остатка тимидина прокариотическим ферментом фотолиазой. В клетках млекопитающих и E. coli обнаружен целый класс алкилтранфераз, репарирующих некоторые алкилированные основания (при этом происходит перенос алкильной группы на белок). Остальные типы репарации проходят с деградацией участка цепи, содержащего повреждение, и последующим синтезом ДНК. При таких серьезных повреждениях, как двунитевые разрывы, обширные бреши и межцепочечные сшивки, включается система рекомбинационной репарации, при которой используется неповрежденная копия генетического материала, присутствующая в клетке. Система репарации гетеродуплексов узнает неканонические пары в составе ДНК и удаляет их. Наконец существуют две системы эксцизионной репарации — эксцизионная репарация нуклеотидов и эксцизионная репарация оснований (ЭРО). Они отличаются как по субстратной специфичности, так и по механизмам действия. Субстратами для эксцизинной репарации нуклеотидов являются объемные химические аддукты в ДНК, повреждения, вызванные УФ-облучением, и внутрицепочечные сшивки. В ходе этого пути эксцизии подвергается участок ДНК длиной в несколько десятков нуклеотидов; данная система низкоспецифична к типу повреждения. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) напротив, высокоспецифична к повреждению за счет наличия особых ферментов — ДНК-гликозилаз, чувствительных к тому или иному типу повреждения. Субстратами ЭРО являются повреждения, незначительно искажающие структуру ДНК — модифицированные основания, апурин-апиримидиновые сайты (AP-сайты), некоторые гетеродуплексы. Основная особенность, отличающая ЭРО от всех других типов репарации, состоит в том, что поврежденный элемент выщепляется в виде одиночного основания, а не в составе олигонуклеотида.

Рис. 1 Наиболее распространенные модифицированные азотистые основания, возникающие при повреждении ДНК. Продукты дезаминирования: урацил (I), гипоксантин (II), ксантин (III). Продукты окисления: 8-оксогуанин (IV), 2,4-диамино-6-оксо-5-формамидопиримидин (V), 8-оксоаденин (VI), 4,6-диамино-5-формамидопиримидин (VII), тимингликоль (VIII), 5,6-дигидроурацил (IX), 5,6-дигидротимин (X), 5-гидроксиметилурацил (XI). Продукты УФ-облучения: цис-син циклобутановый тиминовый димер (XII). Продукты электрофильного присоединения: 3-метиладенин (XIII), 7-метилгуанин (XIV), 2,4-диамино-6-оксо-5N-метил-5-формамидопиримидин (XV), 1, N6-этеноаденин (XVI), 3, N4-этеноцитозин (XVII), O6-метилгуанин (XVIII). Рисунок предоставлен руководителем работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution_ShareAlike 2,5 Generic.

1.1 Повреждения азотистых оснований ДНК

Повреждения ДНК можно условно разделить на спонтанные и идущие под действием внешних генотоксических факторов. Под спонтанным повреждением ДНК понимается такое повреждение, которое может образовываться вследствие нормального метаболизма клетки. Так, сюда относятся процессы дезаминирования, утраты оснований (образование AP-сайтов), окислительного повреждения продуктами кислородного метаболизма и алкилирования эндогенными переносчиками метильной группы. Также к спонтанным можно отнести ошибки, возникающие в процессе репликации. Экзогенные генотоксические факторы (ионизирующая радиация, ультрафиолетовое излучение и реакционноспособные ксенобиотики) часто вызывают такие же или подобные повреждения, поэтому такое деление действительно условно. Например, ионизирующая радиация приводит к радиолизу воды, продукты которого окисляют азотистые основания так же, как и эндогенные метаболиты кислорода, а многие ксенобиотики вступают в реакции электрофильного присоединения с азотистыми основаниями, не отличающиеся принципиально от реакций с эндогенными донорами алкильных групп. К числу поврежденных оснований, возникающих исключительно под действием внешних факторов, можно отнести продукты, появляющиеся в ДНК при облучении в ультрафиолетовом диапазоне, такие как тимидиновые фотодимеры.

На рис. 1 приведены наиболее часто встречающиеся повреждения азотистых оснований ДНК.

1.2 Окисление ДНК. 8-оксогуанин

К числу повреждений, очень часто встречающихся в ДНК, относятся окисленные пурины и пиримидины. Одним из главных реагентов-окислителей является кислород в виде его активных форм. К активным формам кислорода (АФК) относятся супероксид-анион-радикал *O2-, перекись водорода H2O2, гидроксильный радикал *OH и синглетный кислород 1O2. Реактивность АФК повышается в ряду O2 < H2O2 < *O2— < *OH. АФК могут взаимодействовать со всеми типами биомакромолекул и повреждать их [1]. Так, например в случае липидов клеточных мембран АФК способны запускать процесс их перекисного окисления, а в случае ДНК — вносить окислительные повреждения, ведущие к мутациям и изменению генетической информации. Очень чувствительны к АФК ферменты, содержащие в структуре SH-группы, легко поддающиеся окислению.

АФК возникают в клетке при протекании нормальных метаболических процессов (дыхание, метаболизм ксенобиотиков и др.), а также при экзогенном воздействии и в условиях клеточного стресса. При нормальном кислородном дыхании в цепи переноса электронов может происходить восстановление молекулярного кислорода промежуточными продуктами, в основном в комплексе I дыхательной цепи. При этом образуется супероксид-анион-радикал *O2-, и происходит его утечка в митохондиальный матрикс и цитоплазму. При нормальном клеточном метаболизме такой процесс имеет место, однако процент утечки невелик и то количество АФК, которое при этом образуется, не вызывает серьезных повреждений клеточных структур и генетического материала. В условиях же окислительного стресса утечка АФК из митохондрий значительно усиливается, что приводит к значимым повреждениям органелл клетки и ДНК, вплоть до гибели клетки.

Помимо дыхательной цепи источниками АФК в клетке являются многие ферменты, использующие молекулярный кислород для окисления субстрата (оксидазы). Например, оксидазы макрофагов генерируют *O2— для борьбы с бактериальными патогенами [2]. В печени, надпочечниках и ряде других тканей содержатся цитохромы P450 — ферменты-оксидазы, использующие молекулярный кислород для окисления ксенобиотиков. Также определенный вклад в производство АФК вносят ферменты, содержащиеся в пероксисомах и лизосомах [3].

Экзогенными источниками АФК в клетке могут быть некоторые ксенобиотики и ионизирующая радиация. Продукты распада радиоактивных элементов представляют собой высокоэнергетические заряженные частицы и фотоны. При проникновении в живую клетку они вызывают радиолиз воды, продуктами которого являются АФК, а также радикалы H* и ряд других соединений. Каждая частица, постепенно тормозясь и отдавая энергию, способна продуцировать множество молекул АФК [1]. Поэтому при воздействии на клетку ионизирующей радиации количество молекул АФК может на порядки превышать то, которое образуется в нормальных условиях. Кроме того, продукты радиолиза сосредоточены вдоль трека проходящей частицы, поэтому высока вероятность повреждения находящихся рядом молекул биополимеров и возрастания локальных концентраций окисленных соединений. В случае ДНК это приводит к образованию кластерных повреждений — модификаций ДНК, расстояние между которыми меньше нескольких нуклеотидов.

АФК различаются как по способности реагировать с ДНК, так и по способности диффундировать в клетке. Так, *OH очень легко вступает в реакции с ДНК и другими соединениями, однако по этой причине срок его жизни очень мал, так как он успевает прореагировать практически сразу после образования. *O2— и H2O2 напротив, менее реакционноспособны, однако могут по этой причине диффундировать на большие расстояния в клетке. В различных частях клетки *O2— и H2O2 могут быть разными способами восстановлены до более реактивного *OH.

Одним из наиболее хорошо изученных окислительных повреждений ДНК является 8-оксогуанин (8-oxoGua), продукт окисления гуанина. Это повреждение образуется при многих способах окислительного повреждения ДНК — при обработке ионами переходных металлов в присутствии O2 и восстановителей, ?-облучении, обработке пероксинитритом, агентами, индуцирующими образование синглетного кислорода, активированными метаболитами некоторых канцерогенов, УФ-облучении в присутствии фотосенсибилизаторов или H2O2 и т. п. [4]. Так же было показано что 8-oxoGua в значительном количестве образуется в клетке как при действии генотоксических агентов, так и при эндогенном окислении. С помощью различных методик оценен уровень 8-oxoGua в клетке, который составляет ~1 8-oxoGua/106 Gua [5].

Появление в цепи ДНК остатка 8-oxoGua приводит к тому, что ДНК-полимераза при новом цикле репликации может включить в дочернюю цепь напротив него остаток dAMP вместо остатка dCMP. Таким образом, создается предмутагенный гетеродуплекс 8-oxoGua: Ade. Эта ошибка может быть исправлена при репарации, но если этого не происходит, пара G: C меняется на T: A, то есть возникает точковая мутация. Однако биологическое действие 8-oxoGua не ограничено ошибками репликации. Это поврежденное основание может влиять не только на ДНК-полимеразу, но и на другие ДНК-зависимые ферменты: присутствие 8-oxoGua в последовательности узнавания ингибирует расщепление ДНК некоторыми рестриктазами [6] окисление Gua в последовательности CpG ингибирует метилирование соседнего основания Cyt-метилтрансферазой человека [7] и т. д. Кроме того основание Gua может окисляться не только в самой ДНК, но и в составе мононуклеотидов, например, GTP. Это может приводить к ошибкам трансляции, так как GTP является субстратом для РНК-полимераз, а также к нарушению работы GTP-зависимых белков, участвующих во внутриклеточной сигнализации.

1.3 Дезаминирование оснований. Урацил

Другой важный путь повреждения оснований ДНК — дезаминирование. Дезаминированию могут подвергаться основания Cyt, Ade и Gua, однако скорость дезаминирования Cyt в 50−100 раз больше, чем Ade и Gua. Продуктом дезаминирования Cyt является урацил (Ura), а продуктами дезаминирования Ade и Gua — гипоксантин и ксантин соответственно. Ura не входит в число канонических оснований ДНК, однако является таковым для РНК. В двуцепочечной ДНК дезаминирование Cyt проходит главным образом при атаке молекулой H2O по атому C4 протонированного основания с последующим отщеплением NH4+ [8]. В одноцепочечных участках ДНК возможно присоединение молекулы H2O по двойной связи C5=C6, что облегчает последующую атаку второй молекулой H2O по атому C4 с образованием промежуточных продуктов 5-гидро-6-гидроксицитозина и 5-гидро-6-гидроксиурацила. Урацил удаляется из ДНК ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (Ung у бактерий, UNG у эукариот). В отсутствие репарации ДНК-полимераза включает dAMP напротив Ura при новом цикле репликации, что приводит к точечной мутации в том случае, если Ura возник при дезаминировании Cyt. Ксантин и гипоксантин также могут быть причинами мутагенеза в клетке, так как полимеразы могут включать напротив этих оснований dAMP [9, 10].

1.4 Апурин-апиримидиновые сайты

Апурин-апиримидиновые (AP-) сайты возникают в ДНК вследствие гидролиза N-гликозидных связей. Это может происходить как спонтанно, так и под действием ферментов-гликозилаз, выщепляющих поврежденные основания в процессе репарации. Спонтанный гидролиз N-гликозидных связей легко происходит в кислой среде, так как ключевым шагом в этом механизме является протонирование азотистого основания. Однако он происходит с достаточной скоростью и при физиологических значениях pH [11, 12]. Скорость потери неодинакова для различных оснований и зависит от pKa протонируемого атома (N7 в основании Gua, N1 в Ade, N3 в Cyt, O2 в Thy). Поэтому при физиологических значениях pH в первую очередь происходит потеря пуриновых оснований, т. е. происходит «апуринизация» ДНК. Скорость апуринизации значительно повышается в случае модифицированных пуринов, несущих постоянный положительный заряд (например, 7-метилгуанина).

AP-сайты обладают высокой цитотоксичностью и мутагенностью, так как, во-первых, они химически нестабильны: после отщепления основания нет ограничений для нуклеофильной атаки по атому С1', что приводит к элиминации 3'-фосфата и образованию одноцепочечного разрыва. Во-вторых, AP сайты эффективно блокируют действие многих ДНК-полимераз, которые при достижении их останавливаются, а затем либо диссоциируют, либо включают напротив них в дочернюю цепь dAMP. Эта закономерность получала название «правило А» и показана для многих полимераз [13].

1.5 Эксцизионная репарация оснований ДНК

Все вышеперечисленные повреждения ДНК в живой клетке удаляются системой эксцизионной репарации оснований. Первый шаг пути эксцизионной репарации — узнавание и выщепление модифицированного основания специальными ферментами, которые носят название ДНК-гликозилаз. При том, что в ДНК может встречаться множество различных повреждений, в природе существует ограниченное количество ДНК-гликозилаз, обладающих более или менее широкой субстратной специфичностью. Так, например 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза эукариот (OGG1) способна выщеплять многие окисленные пурины, а урацил-ДНК-гликозилаза эукариот (UNG) — только остатки урацила. ДНК-гликозилазы катализируют удаление основания по механизму нуклеофильного замещения. В зависимости от типа гликозилазы нуклеофильным агентом может выступать молекула воды или одна из аминогрупп в активном центре фермента [5].

ДНК-гликозилазы делятся на монофункциональные и бифункциональные. Эти типы ферментов отличаются по механизму катализируемой реакции и по продуктам, которые получаются на выходе. Так, монофункциональные гликозилазы катализируют только выщепление азотистого основания с образованием AP-сайта. Нуклеофильным агентом в такой реакции является молекула воды, которая замещает собой азотистое основание (рис. 2А). Бифункциональные гликозилазы после выщепления основания вносят разрыв с 3' стороны от образовавшегося AP-сайта по механизму ?-элиминирования. Эта активность называется AP-лиазной. Продуктом такой реакции является одноцепочечный разрыв с 3'-концевой фосфатной группой и 5'-концевым ненасыщенным альдегидным фрагментом. При этом реакция идет с образованием основания Шиффа между остатком аминокислоты активного центра фермента и С1' атомом остатка дезоксирибозы. (рис. 2Б). Некоторые бифункциональные гликозилазы катализируют и дальнейшую стадию элиминирования AP-сайта, называемую ?-элиминированием. При этом расщепляется связь между атомом C5' и атомом кислорода фосфатной группы. После этого в ДНК остается одноцепочечный разрыв, обрамленный с обеих сторон фосфатными группами [14] (рис. 2В).

Рис. 2 Расщепление ДНК по AP-сайту AP-эндонуклеазами (А) и AP-лиазами, катализирующими реакцию ?-элиминации (Б) или ?,?-элиминации (В). Рисунок предоставлен руководителем работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution_ShareAlike 2,5 Generic.

Продукты реакций, катализируемых ДНК-гликозилазами, не являются непосредственно субстратами для ДНК-полимераз, поэтому в ходе ЭРО подвергаются дальнейшему процессингу. В зависимости от типа ДНК-гликозилазы, работающей на первом шаге, существует несколько путей ЭРО (рис. 3).

Первый путь ЭРО начинается с выщепления основания монофункциональной ДНК-гликозилазой. Получившийся AP-сайт является субстратом для AP-эндонуклеазы, которая гидролизует фосфодиэфирную связь с 5'-стороны от AP-сайта. Это приводит к образованию 3'-концевой OH-группы, служащей субстратом для ДНК-полимераз, и 5'-концевого 2'-дезоксирибо-5'-фосфата (dRP), который блокирует 5'-конец. Дальнейшая репарация может идти либо по «короткозаплаточному», либо по «длиннозаплаточному» пути ЭРО. В первом случае ДНК-полимераза (ДНК-полимераза? в клетках высших эукариот) встраивает dNMP на место поврежденного звена. Затем остаток dRP удаляется с помощью dRP-лиазной активности, которая в клетках высших эукариот также принадлежит ДНК-полимеразе ?. После этого ДНК-лигаза (в клетках высших эукариот ДНК-лигаза III? в комплексе с вспомогательным белком XRCC1) лигирует получившиеся фрагменты. При длиннозаплаточной ЭРО после встраивания первого dNMP репаративный синтез продолжается с заменой 2−20 нт и вытеснением или деградацией впереди лежащей цепи ДНК; в клетках высших эукариот этот синтез ведется ДНК-полимеразами? или? с привлечением вспомогательных факторов (PCNA, RFC, RPA). Вытесненный фрагмент удаляется флэп-эндонуклеазой (FEN1), а затем происходит лигирование последней фосфодиэфирной связи — в клетках высших эукариот это делает ДНК-лигаза I [15].

Рис. 3 Общая схема процесса эксцизионной репарации оснований у высших эукариот [5]

Второй путь ЭРО начинается с выщепления основания бифункциональной ДНК-гликозилазой. В случае ?-элиминирования AP-сайта альдегидный фрагмент вместе с фосфатной группой удаляется также AP-эндонуклеазой. В случае ?-элиминирования 3'-фосфатные группы выщепляются из ДНК фосфатазной активностью, которая у E. coli принадлежит опять же AP-эндонуклеазам, а в клетках человека -- полинуклеотидкиназе/3'-фосфатазе. Таким образом в ДНК образуется однонуклеотдиная брешь, которая может застраиваться как по короткозаплаточному, так и по длиннозаплаточному пути ЭРО. Отличие короткозаплаточного пути в данном случае будет в том, что в случае бифункциональных гликозилаз не требуется dRP-лиазная активность, так как уже на стадии ?-элиминирования образуется свободная 5'-фосфатная группа [15].

Так же существуют пути ЭРО, независимые от ДНК-гликозилаз («инцизионная репарация нуклеотидов»), в ходе которой AP-эндонуклеаза расщепляет фосфодиэфирную связь с 3'-стороны от повреждения, а затем идет синтез с вытеснением цепи.

2.6 Репарация ДНК в эмбриональном развитии

Процессы репарации ДНК протекают на всех стадиях развития организма, так как поддержание интактной структуры носителя генетической информации является одним из ключевых условий выживания клетки. Однако интенсивность этих процессов не одинакова для разных органов и тканей, а также в разные периоды жизни организма. Это связано в первую очередь с тем, что при активной репликации генетического материала в ДНК возникает множество ошибок и повреждений, которые необходимо оперативно удалять, чтобы клетка безошибочно закончила деление. Репликативные ДНК-полимеразы с определенной долей вероятности включают в состав вновь синтезируемой цепочки неканонические азотистые основания, например, Ura. Кроме того, любая ДНК-полимераза может ошибаться и включать некомплементраный нуклеотид с образованием неканонической пары. При клеточном делении активно идут процессы синтеза всех возможных видов биологческих молекул, поэтому высока вероятность повреждения ДНК различными клеточными метаболитами. Все это может привести к мутациям, поэтому процессы репарации приобретают особое значение во время активного клеточного деления. Для некоторых ДНК-гликолилаз показана возможность участия в репарации непосредственно в репликативной вилке. Так например человеческая аденин-ДНК-гликозилаза гетеродуплексов (MUTYH) [16] связывается с белками репликации PCNA и RPA, что говорит о сочетании процессов синтеза и репарации. Для нематод Caenorhabditis elegans показана взаимосвязь между активностью урацил-ДНК-гликозилазы и одной из контрольных точек клеточного цикла, останавливающей клеточное деление и запускающей апоптоз при сильном повреждении ДНК [17].

Очевидно, что клеточное деление, а, значит, и процессы репликации ДНК наиболее интенсивно протекают на стадии эмбрионального развития. Поэтому особый интерес вызывают работы, направленные на исследование активности различных ферментов репарации в процессе эмбриогенеза растений и животных. При исследовании клеток мозга эмбрионов мышей было показано, что экспрессия гена OGG1 наблюдалась в строго определенной зоне активно делящихся потомков эпендимных клеток. При этом уже на стадии дифференцировки клеток происходил резкий спад уровня экспрессии. [18] Для N-метилпурин-ДНК гликозилазы млекопитающих (MPG) также известно, что экспрессия ее гена максимальна в активно пролиферирующих клетках, в частности, в клетках зародышевого пути. Существуют данные, указывающие на необходимость присутствия MPG для нормального протекания процесса клеточного деления. [19] Интересно, что гомолог этого белка из растений, 3-метиладанин-ДНК гликозилаза Arabidopsis thaliana, экспрессируется в двух местах — в меристемной ткани зародыша, дающей начало эндосперму, и в тканях листьев взрослого организма. [20] Для UNG в культуре клеток человека показано возрастание экспрессии с ростом уровня пролиферации клеток [21].

В целом можно сказать, что во многих исследованиях отмечается корреляция между уровнем пролиферации клеток и уровнем активности различных ферментов репарации. При этом зачастую с развитием организма этот уровень значительно снижается. Многие исследователи отмечают, что снижение активности систем репарации во взрослом организме может быть одним из механизмов старения. Однако высокий уровень экспрессии и активности ДНК-гликозилаз может быть связан не только с необходимостью поддержания неповрежденной структуры ДНК при репликации. ДНК-гликозилазы могут быть вовлечены и в другие клеточные процессы, протекающие на стадии эмбриогенеза. Так, у растений существует уникальная ДНК-гликозилаза DEMETER (DME), удаляющая из ДНК остатки 5-метилцитозина (mCyt). Исследование мутантов по этому белку в Arabidopsis thaliana показало, что на выживаемость потомства влияют только мутации в материнском аллеле DME. [22] Это связано с тем, что метилирование Cyt по положению C5 — ключевой механизм импритинга генов. Введение метильной «метки» приводит к ингибированию экспрессии импритированного гена, а удаление метки — к ее активации. Ген DME экспрессируется в центральной клетке женского гаметофита, дающей начало эндосперму, и белок DME деметилирует промоторную область гена MEDEA, активируя его транскрипцию.

Хотя у животных нет гомологов белка DME, различные ДНК-гликозилазы животных также могут быть вовлечены в процессы деметилирования ДНК. Особый интерес представляет механизм деметилирования ДНК у Danio rerio -- рыбы семейства карповых, которая широко используется как модельный организм в биологии развития позвоночных. На первом этапе остаток mCyt подвергается дезаминированию 5-метилцитозиндезаминазой (AID) с образованием остатка Thy, который затем удаляется из ДНК активностью T: G-специфичной тимин-ДНК-гликозилазы (MBD4). При этом функциональное взаимодействие этих ферментов стимулируется белковым фактором GADD45 [23]. Интересно, что для MBD4 человека показана дополнительная активность по удалению mCyt из ДНК [24]. В куриных эмбрионах деметилирование ДНК осуществляется белковым комплексом, в состав которого входят несколько ферментов, в том числе 5-метилцитозин-ДНК-гликозилаза и несколько РНК-геликаз, и CpG-богатая РНК. 5-метилцитозин-ДНК-гликозилаза куриных эмбрионов является гомологична MBD4 человека и обладает активностью как в отношении mCyt, так и в отношении Thy в парах T: G, однако присутствие других участников комплекса стимулирует первую активность и ингибирует вторую [25]. Предпочтительным субстратом для этого комплекса является полуметилированная ДНК, которая возникает в клетке при репликации, когда материнская цепочка метилирована, а дочерняя — еще нет [26]. Для всех ферментов и РНК, входящих в состав деметилирующего комплекса, показана преимущественная транскрипция в активно пролиферирующих клетках эмбриона [27].

Таким образом, репарация в эмбриогенезе растений и животных представляет большой интерес для исследования. Одним из распространенных и хорошо изученных объектов эмбриологических исследований являются морские ежи рода Strongylocentrotus (тип Echinodermata, класс Echinoidea, отряд Echinoida, семйство Strongylocentrotidae). Это очень удобный объект для подобной работы, потому что на данный момент известно достаточно много о его эмбриональном развитии, как на уровне морфологии, так и на уровне взаимодействия генов.

2.7 Эмбриогенез морского ежа

После оплодотворения вновь образованный эмбрион морского ежа подвергается полному, радиальному голобластическому дроблению. Первое и второе деление проходят в перпендикулярных друг другу меридиональных плоскостях. После них образуются четыре бластомера, которые затем делятся в экваториальной плоскости. Это третье деление разбивает эмбрион на две «полусферы» — анимальную и вегетативную, соответствующие анимальному и вегетативному полюсам эмбриона. На этой стадии формируются восемь равных по размеру бластомеров, что говорит о равномерности деления. Однако уже при следующем делении формируются клетки, отличающиеся по размеру. Четыре клетки анимального яруса эмбриона делятся в меридиональном направлении, формируя восемь одинаковых по размеру клеток, называемых мезомерами. При этом клетки вегетативного яруса делятся в экваториальном направлении и формируют два клеточных слоя, один из которых представлен клетками большого размера, называемых макромерами, а другой мелкими клетками — микромерами, расположенными полярно. При следующем делении веретено дробления мезомеров проходит экваториально, вследствие чего образуются два слоя, an1 и an2, клетки в которых расположены в шахматном порядке. Макромеры делятся меридионально, формируя пласт из восьми клеток, подстилающий an2, микромеры также делятся, однако несколько позже, формируя небольшой кластер на вегетативном полюсе. Веретена 6-го деления проходят во всех клетках экваториально, а 7-го — меридионально. Это приводит к образованию 128-клеточной бластулы.

Рис. 4 Схема дробления эмбриона морского ежа [28].

Стадия бластулы начинается с 128 клеток. Бластула представляет собой полую сферу, центральная полость которой (бластоцель) заполнена жидкостью. Бластулу формирует одноклеточный слой, таким образом, каждая клетка находится в контакте как с жидкостью бластоцеля так и с оболочкой оплодотворения. Бластула ограничена в объеме этой оболочкой, поэтому с каждым следующим делением размер клеток становится все меньше. Клеточный слой утончается, в то время как количество клеток в нем растет. На этом этапе все клетки делятся синхронно. После 9−10-го деления бластулы фаза синхронного деления заканчивается, и на внешней поверхности бластулы формируются множественные реснички [29]. При этом бластула начинает вращаться внутри оболочки оплодотворения. В клетках анимальной части начинается синтез и секреция особого белка, который разрушает оболочку оплодотворения, и бластула «вылупляется» из нее. Далее зародыш становится подвижным. [30].

Вскоре после вылупления вегетативная сторона зародыша уплощается и утолщается, он утрачивает сферическую форму. Затем в бластоцель мигрируют клетки первичной мезенхимы, происходящие из материала микромеров. Зетам происходит инвагинация стенки бластулы с образованием первичной кишки (архетерона), который растет через бластоцель к анимальному полюсу. (гаструляция). Несколько позже анимальная стенка уплощается, конец архетерона приближается к ее внутренней поверхности. Из этого участка архетерона в бластоцель мигрируют клетки вторичной мезенхимы, дающие начало личиночному скелету. В итоге формируется билатерально симметричная личинка (призма).

В ходе дельнейшего развития ветви скелетных спикул входят в контакт с эктодермой и индуцируют образование двух пар выростов — так называемых рук. С появления закладки первой пары рук личинку принято называть плутеусом или эхиноплутеусом. Вскоре после этого в эктодерме появляются первые нейроны, происходит дифференциация пищеварительного тракта и возникает ротовое отверстие. На этом заканчивается ранее развитие эмбриона и личинка переходит к активному питанию.

Рис. Схематичное изображение плутеуса морского ежа рода Strongylocentrotus [28].

Описанные морфологические преобразования сопровождаются изменением содержания различных веществ в клетках эмбриона. Во время дробления бластулы зародыш использует фонд материнских ферментов (например, ДНК-полимераз), запасенных в икре. Постепенно этот фонд расходуется, материнские ДНК-полимеразы заменяются вновь синтезированными. Кроме того, расходуется запас питательных веществ. Питательные белки в икре морского ежа по большей части представлены главным желточным белком (major yolk protein, MYP). 31] Он состоит 1346 аминокислот и имеет молекулярную массу ~159 кДа. Этот белок относится к семейству трансферринов и содержит сайт связывания ионов Fe3+. В процессе развития MYP подвергается протеолитическому расщеплению по специфическим сайтам. [32] Это может приводить к высвобождению ионов железа, и индуцировать окислительные повреждения ДНК эмбриона. Кроме того, по ходу развития изменяется состав среды, с которой контактирует эмбрион. Если первые 12 часов эмбрион находится под оболочкой оплодотворения, защищающей в некоторой степени его от многих внешних воздействий, то после вылупления бластулы зародыш оказывается свободно плавающим в морской воде, в которой содержатся множество агентов, способных повредить ДНК.

Таким образом, развивающемуся эмбриону морского ежа необходимо наличие эффективных систем репарации ДНК. Одним из этапов исследования этих систем является определение наличия и измерение активностей ключевых ферментов репарации ДНК.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы

В работе использовали трис (гидроксиметил)аминометан (Tris) борную кислоту, персульфат аммония, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), тритон Х-100, глицерин (все — «Helicon», Россия), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) 1,4-дитиотреитол (ДТТ) (все — «Sigma», США), мочевину («ICN Biomedicals», США), акриламид, бромфеноловый синий, ксиленцианол, формамид, LiClO4, ацетон (все -- «Реахим», Россия), MgCl2 («Serva», Швейцария), г-[32P]ATP с удельной активностью 1,43 МБк/мкл (Лаборатория биотехнологии ИХБФМ СО РАН), остальные реактивы и растворители квалификации х.ч. и ос.ч. отечественного производства. Для очистки меченых олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) после введения радиоактивной метки использовали сорбент С18 NenSorb («PerkinElmer Life Sciences», США)

2.2 Дезоксирибоолигонуклеотиды

В работе использовали предоставленные руководителем работы ОДН следующих последовательностей:

23oG: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3' (X = 8-oxoGua)

23 °F: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3'(X = (3-гидрокситетрагидрофуран- 2-ил)метилфосфат, THF)

23U: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3' (X = урацил)

23G: 5'-CTCTCCCTTCGCTCCTTTCCTCT-3'

23C: 5'-CTCTCCCTTCCCTCCTTTCCTCT-3'

23comp: 5'-AGAGGAAAGGAGCGAAGGGAGAG-3'

Primer 1 5'-CTCTCCCTTC-3'

Primer 2 5'-CTCCTTTCCTCT-3'

Template 5'-AGAGGAAAGGAGTGAAGGGAGAG-3'

2.3 Ферменты

В работе использовали полинуклеотидкиназу бактериофага T4 (10 000 ед. акт. /мл; «Биосан», Россия), Ung E. coli (1000 ед. акт. /мл; «New England Biolabs», США), Fpg E. coli (130 мкМ), APEX1 человека (115 мкМ) и ДНК-полимераза человека (89 мкМ) предоставленные руководителем работы.

2.4 Стандартные буферы и смеси

В работе использовали следующие стандартные буферы и смеси, далее приводящиеся без расшифровки состава:

FDLB 80%-ный (v/v) формамид, 20 мМ Na-ЭДТА, 0,1%-ный (w/v) ксиленцианол, 0,1%-ный (w/v) бромфеноловый синий

TBE 90 мМ Tris, 90 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА

0,1ЧTE 1 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ ЭДТА

2.5 Выращивание эмбрионов морских ежей

Все операции проводили при 18 °C. Для выращивания эмбрионов у взрослых половозрелых особей S. intermedius, собранных в заливе Петра Великого в районе морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН, инициировали вымет гамет путем встряхивания животных. Затем смешивали икру и сперматозоиды из расчета 2−5 мл суспензии спермы на 100 мл густой суспензии яйцеклеток, выдерживали 1−2 мин. и разбавляли до 1 л морской водой, профильтрованной через фильтровальную бумагу. После оседания клеток промывали морской водой 2−3 раза. Контроль эффективности оплодотворения проводили, подсчитывая процентное соотношение оплодотворенных клеток в пробе, пробы с эффективностью больше 90−95% использовали для дальнейших экспериментов. Эмбрионы выращивали в открытом сосуде объемом 10 л при постоянном перемешивании мешалкой со скоростью 50 об. /мин. Начальная концентрация эмбрионов составляла 3000 шт/мл. После стадии вылупления бластулы эмбрионы разбавляли в два раза, концентрация составляла 1200−1500 шт/мл. Через определенные промежутки времени, согласно методике [33] из инкубационного сосуда отбирали от 400 до 1500 мл (в зависимости от разбавления), и центрифугировали при 2000Чg до оседания клеток. Осадки замораживали при -20°C, затем переносили в -70°C для хранения.

2.6 Приготовление клеточных экстрактов

Для лизирования размороженные во льду клетки смешивали с лизисным буфером (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 М NaCl, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 0,5%-ный тритон Х-100, 0,3 мМ PMSF) в объемном соотношении 1:5. Смесь подвергали гомогенизации, последовательно пропуская через шприцы с разным диаметром отверстия игл (0,8, 0,7, 0,6, и 0,4 мм). Через каждую иглу смесь пропускали два раза. Все операции проводились на льду. Полученные гомогенаты центрифугировали в течение 20 мин. при 14 000Чg при температуре 4 °C. Супернатант диализовали в мешках с размером пор, соответствующим 1,5 кДа (Sigma) против 2 смен по 1 л 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) при 15 °C в два этапа: первый — в течение 2 ч., второй в течение ночи. К экстрактам добавляли ДТТ до концентрации 1 мМ и глицерин до 9%, расфасовывали порциями по 1 мл и хранили при -70°C.

2.7 Измерение общей концентрации белка

Содержание белка в экстрактах измеряли методом окрашивания на бумаге Whatman 3 MM. Готовили стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина с концентрациями 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 мг/мл и наносили на бумагу капли каждого раствора размером по 2 мкл. Экстракты разводили в 10 раз и также наносили на бумагу по 2 мкл. Затем бумагу смачивали ацетоном, высушивали под тягой, и замачивали в растворе 0,25%-го кумасси голубого R250 в 45%-ном метаноле и 10%-ной уксусной кислоте в течение 5 мин. Бумагу отмывали раствором 20%-го метанола и 5%-ной уксусной кислоты, затем споласкивали водой и высушивали. Полученный образец сканировали и обрабатывали результат в программе «Quantity One» v4.6.3 («Bio-Rad»).

2.8 Введение 32P метки по 5'-концу ОДН

Фосфорилирование ОДН проводили в буфере следующего состава: 70 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. На 200 пмоль ОДН в объеме 10−50 мкл добавляли 20 ед. акт. полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 и 5 МБк г[32P]-ATP (примерно 3,5 пмоль). После инкубации в течение 40 мин. при 37 °C реакцию останавливали прогреванием в течение 2 мин при 95 °C, отбирали 1 мкл реакционной смеси для последующего определения выхода продукта.

2.9 Хроматографическая очистка меченого ОДН

Меченые ОДН *23oG, *23 °F, *23C и *23G отделяли от невключившегося г[32P]-ATP обращеннофазовой хроматографией на сорбенте С18 NenSorb. Перед нанесением образца 200 мкл сорбента, упакованного в колонку, смачивали 1 мл метанола, затем 1 мл бидистиллированной воды, а затем уравновешивали 2 мл буфера, содержащего 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 1 мМ ЭДТА. К реакционной смеси добавляли 500 мкл того же буфера. После нанесения образца колонку промывали последовательно 2 мл того же буфера и 2 мл воды. Меченый ОДН элюировали с колонки 50%-ным метанолом в объеме 1 мл. Затем очищенный ОДН упаривали досуха под вакуумом (Concentrator plus, Eppendorf, Германия) и растворяли в 50 мкл буфера 0,1ЧTE.

2. 10 Электрофоретическая очистка меченого ОДН

Меченый ОДН *23U отделяли от невключившегося г[32P]-ATP и других продуктов электрофоретически. Для этого реакционную смесь, объем которой по возможности был минимален, наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) и проводили электрофорез (разд. 3. 12). Фрагменты геля, содержащие ОДН, измельчали, добавляли 200−300 мкл воды и элюировали ОДН в течение ночи, затем отделали элюат центрифугированием при 13 000 об/мин. К нему добавляли 1,2 мл 2%-го раствора LiClO4 в ацетоне и оставляли на ночь при -20°C. После центрифугирования в течение 10 мин. при 13 000 об. /мин. супернатант сливали, осадка трижды промывали, добавляя каждый раз 1 мл ацетона и центрифугируя в тех же условиях. После последней промывки осадок досушивали под вакуумом и растворяли в 0,1ЧTE в объеме, соответствующем объему реакционной смеси, использованной для фосфорилирования ОДН.

2. 11 Определение выход после очистки и отжиг комплементарных цепей ОДН

Для определения выхода отбирали 1 мкл очищенного ОДН и анализировали его и аликвоту, отобранную непосредственно после фосфорилирования, гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (разд.3. 12). В случае, если для дальнейших экспериментов был необходим одноцепочечный ОДН, его концентрацию доводили до 500 нМ добавлением буфера 0,1ЧTE (pH 8,0). В случае, когда ОДН должен был быть двуцепочечным, проводили отжиг с двукратным молярным избытком немеченой комплементарной цепи в следующем режиме: 1 мин при 95 °C, 10 мин при 37 °C, 30 мин при комнатной температуре. Конечную концентрацию дуплекса приводили к 500 нМ добавлением буфера 0,1ЧTE (pH 8,0). Полученный дуплекc хранили при -20°C.

2. 12 Электрофоретический анализ ОДН

При проведении гель-электрофореза в денатурирующих условиях использовали 20%-ном ПААГ (соотношение акриламид: бис-акриламид 19: 1), содержащий 7,2 М мочевину и буфер TBE. Электрофорез проводили в полиакриламидной пластине толщиной 0,4−0,8 мм и длиной 20−30 см в буфере TBE при напряжении 600−1000 В без специального охлаждения. После разделения продуктов реакции в геле радиоактивность полос определяли радиолюминесцентным сканированием экрана «Image Screen K» («Kodak», США) с использованием системы «Molecular Imager FX» («Bio-Rad Laboratories», США). Результаты обсчитывали с использованием программы «Quantity One» v4.6.3 («Bio-Rad»)

2. 13 Электрофоретический анализ белков

Содержание мажорных полос высокомолекулярного белка в экстрактах определяли электрофорезом в ПААГ (соотношение акриламид: бис-акриламид 39: 1) с электродным буфером 25 мМ Tris-глицин (pH 8. 3) в системе Лэммли: концентрирующий гель — 4% ПААГ, 125 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% SDS; разделяющий гель — 12% ПААГ, 375 мM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% SDS. Электрофорез вели при 200 В в течение 40 мин. После электрофореза гель окрашивали в течение ночи в растворе 0,1% Кумасси бриллиантового голубого R250 в 40% этаноле/10% уксусной кислоте. Отмывыли раствором 40% этанол/10% уксусная кислота 4 раза по 15 мин.

2. 14 Анализ расщепления ОДН клеточными экстрактами

Для анализа расщепления ОДН клеточными экстрактами к размороженному экстракту добавляли меченый субстрат до концентрации 50 нМ. Реакционную смесь (50 мкл) инкубировали при 37 °C, отбирая аликвоты (5 мкл) через 2, 5, 10, 20 мин. При анализе расщепления субстратов *23U и *23oG/23comp к реакционной смеси добавляли ЭДТА до концентрации 5 мМ. Для учета неспецифической деградации субстрата клеточные экстракты параллельно инкубировали с контрольным ОДН, не содержащим повреждения. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 0,2 M NaOH и прогреванием при 95 °C в течение 2 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 5 мкл 0,2 M HCl. К аликвоте добавляли 8 мкл раствора FDLB, продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд. 3. 12). При анализе расщепления субстрата *23F/23comp реакцию останавливали добавлением 5 мкл раствора FDLB и прогреванием при 95 °C в течение 2 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд.3. 12).

2. 15 Анализ ДНК-полимеразной активности экстрактов

Для определения полимеразной активности был сконструирован субстрат, состоящий из 23-звенной ДНК-матрицы и двух праймеров, в 10 и 12 нуклеотидов длинной, между которыми находилась однонуклеотидная брешь. (*Primer1*Primer2/Template) Праймер 1 был помечен радиоактивной меткой по 5'-концу, 3'-конец оставался свободным. Реакцию вели в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 10 мМ МgCl2, 1 мM ДТТ, 25 мМ KCl, 100 мкМ dATP. Концентрация субстрата составляла 100 нМ. Реакционную смесь (20 мкл) инкубировали при 20 °C в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл раствора FDLB и прогреванием при 95 °C в течение 2 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд. 3. 12)

2. 16 Обработка результатов

Данные, полученные при обсчете радиоавтографов гелей, были использованы для построения графиков накопления продуктов реакции в программе SigmaPlot v9.0 (SPSS, США) методом регрессии к линейной функции. Тангенс угла наклона получившихся прямых брался за скорость реакции. Скорости расщепления неспецифического субстрата вычиталась из скорости расщепления специфического. Из трех наборов данных, полученных по трем независимым повторам эксперимента, вычислялась стандартная ошибка параметров уравнения регрессии.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Поиск генов, кодирующих ферменты ЭРО в геноме морского ежа

В базе данных GenBank при помощи алгоритма BLAST был проведен поиск последовательностей, гомологичных основным белкам ЭРО человека и E. coli, в полностью секвенированном геноме близкородственного вида S. purpuratus. Результаты поиска приведены в табл. 1, где показаны последовательности человека и E. coli и соответствующие им последовательности S. purpuratus, которые при выравнивании дали общую оценку (total score) > 200. Как видно, в геноме S. purpuratus содержатся ДНК-гликозилазы суперсемейств Ung и Nth, и полностью отсутствуют представители суперсемейства Fpg/Nei. Также не было обнаружено гомологов ДНК-гликозилаз, удаляющих алкилированные основания (AlkA и Tag E. coli, MPG человека). Возможно, репарация алкилированных оснований у морских ежей идет по другим путям, например, с использованием окислительных деметилаз. В отличие от клеток человека, где нет гомологов АП-эндонуклеазы Nfo, у S. purpuratus присутствуют АП-эндонуклеазы обоих суперсемейств -- Xth и Nfo. Были обнаружены также гомологи ДНК-полимераз и ДНК-лигаз человека, принимающих участие в ЭРО, однако отсутствовал гомолог эндонуклеазы FEN1, необходимый для длиннозаплаточного пути ЭРО. В целом можно сказать, что S. purpuratus и, скорее всего, S. intermedius обладают полным набором ферментов, необходимых для осуществления короткозаплаточной ЭРО для большинства повреждений, которые репарируются по этому пути в организме человека.

Табл. 1 Гомологи основных ферментов ЭРО в геноме S. purpuratus

Функция

E. coli

H. sapiens

S. purpuratus

ДНК-гликозилазы

Ung*

UNG

LOC586702**

TDG

LOC586471

SMUG1

LOC577235

LOC577424

MBD4

LOC578658

NTHL1

LOC588914

OGG1

LOC586897

MUTYH

LOC586497

АП-эндонуклеазы

APEX1

LOC584564

Nfo

LOC592745

ДНК-полимеразы

POL?

LOC582628

POL?

LOC575728***

POL?

LOC589064***

ДНК-лигазы

LIG1

LOC752989

LIG3

LIG3

*Даны только те последовательности человека и E. coli, для которых присутствуют гомологи в геноме S. purpuratus с общей оценкой выравнивания > 200.

**Приведены обозначения геномных локусов S. purpuratus в базе данных GanBank.

***Каталитическая субъединица.

3.2 Выращивание эмбрионов морских ежей

Исследование активности ферментов репарации проводилось на клеточных экстрактах, полученных из эмбрионов морского ежа S. intermedius на разных стадиях развития. Выращивание эмбрионов осуществлялось на базе морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Для получения половых клеток морского ежа половозрелых самок и самцов, собранных со дна бухты около морской станции, подвергали легкой тряске, после чего они начинали выделять икру и сперму. Половые продукты собирали в ёмкости с фильтрованной морской водой. Клеткам давали осесть, затем запускали искусственное оплодотворение. 33] Оплодотворение и выращивание эмбрионов проводили при оптимальной температуре развития 18 °C как описано в разделе «Материалы и методы». Описанная техника искусственного оплодотворения является общепринятой, ее употребляют с теми или иными модификациями все исследователи.

Признаком успешного оплодотворения является отхождения желточной оболочки от поверхности плазматической мембраны и образование перивителлинового пространства. Этот процесс называют формированием оболочки оплодотворения. Для контроля эффективности оплодотворения из смеси отбирали аликвоту 10−20 мкл, рассматривали под бинокулярной лупой и подсчитывали количество яйцеклеток с оболочкой оплодотворения и без нее.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой