Обнаружение в белковых молекулах сигнальных аминокислотных последовательностей ответственных за адресный транспорт белков в клетке (Г. Блобель 1999 год)

Тип работы:
Курсовая
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. АКМУЛЛЫ

ЕСТЕСТВЕННО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра генетики

Направление 20 400

Биология

Курсовая работа

По дисциплине «Генетика и селекция»

Тема: Обнаружение в белковых молекулах сигнальных аминокислотных последовательностей ответственных за адресный транспорт белков в клетке (Г. Блобель 1999 год)

Уфа-2013

Введение

В данной работе будут рассматриваться опыты Гюнтера Блобеля по обнаружению в белковых молекулах сигналов, отвечающих за правильное перемещение белков внутри клетки и через мембраны. Кроме этого, будет изучена работа данного лауреата в сфере обнаружения у белков различных сигналов. Блобель начавший свою работу, как исследование механизмов переноса секреторных белков через мембрану эндоплазматической сети, через некоторое время, открывши принципы самоорганизации клеток и образования различных мембран и клеточных компартментов. Большинство клеточных белков, включая интегральные мембранные белки, содержат элементы присущих только им аминокислотных последовательностей. Эти последовательности расшифровываются специальными распознающими факторами, а соответствующие рецепторы и эффекторы определяют путь следования белка к месту, где он необходим.

Цель: рассмотреть эксперимент по обнаружению в белковых молекулах сигнальных аминокислотных последовательностей ответственных за адресный транспорт белков в клетке.

Задачи:

1. Рассмотреть биографию.

2. Разобрать суть эксперимента.

3. Подробно изучить один из методов эксперимента.

Глава 1. Биография Гюнтера Блобеля

блобель гипотеза белок транслокация

Родился в 1936 году в маленькой силезской деревушке Вальтерсдорф графства Шпроттау в восточной части Германии.

1945 год стал поворотным моментом в его жизни. До этого его детство представляло собой образец идиллии XIX века. В конце января 1945 года семье пришлось бежать от наступающей русской армии. Его отец — ветеринар остался еще на несколько дней, и покинул дом лишь за несколько часов до прихода Красной Армии. Рейнер, его четырнадцатилетний брат, увез Гюнтера, на небольшом автомобиле, его маму братьев и двух младших сестер к родственникам, живших к западу от Дрездена, в Саксонии. Всего лишь несколько дней спустя — 13 февраля 1945 года они с расстояния в 30 километров вспышки огня и багровое ночное небо, отражавшее неистовый огненный шторм, уничтожавший величайшие сокровища этого города во время одной из самых страшных бомбежек за всю историю Второй Мировой войны. Этот день стал для него самым ужасным и незабываемым. Ни у кого из родственников не оказалось достаточно места, чтобы разместить у себя всю семью, так что им пришлось разделиться и разъехаться по разным деревням. 9 сентября 1945 Гюнтер узнал о смерти его старшей сестры, красавицы Руфи, которая 10 апреля 1945 погибла в возрасте 19 лет во время воздушного налета на поезд, в котором она ехала.

К счастью, вскоре их жизнь начала налаживаться. Его отец смог продолжить свою ветеринарную практику в саксонском городке Фрейберг. К 1947 году так собралась почти вся семья.

Когда Гюнтер в 1954 году окончил среднюю школу, ему не позволили продолжить свое образование в университете, потому что он считался представителем «капиталистического» класса. К счастью, в то время, то есть до возведения Берлинской Стены, еще оставалась возможность свободно уехать в Западную Германию. Поэтому 28 августа, он покинул Фрейберг и отправился в западногерманский Франкфурт-на-Майне.

Он стал изучать медицину, сначала во Франкфурте, затем в Киле, Мюнхене и Тюбингене, и в 1960 году окончил Университет Тюбингена. Несмотря на то что он в течение двух лет проходил интернатуру в нескольких маленьких больницах, он решил отказаться от продолжение медицинской карьеры. Его в большей степени интересовали неразрешенные проблемы медицины, а не врачебная практика. По счастью, его старший брат Ганс уже имел аналогичный опыт в своей области — ветеринарии. Он добился получения престижной Фуллбрайтовской стипендии для обучения в США

И продолжил там свою специализацию в области микробиологии. Он очень быстро получил должность профессора с докторской степенью в Висконсинском Университете в Мэдисоне. Он очень сочувствовал Гюнтеру и помог решить стоявшую перед ним дилемму, посоветовав в получении стипендии на обучение в аспирантуре либо у Хорана, либо у Вэна Р. Поттера.

В мае 1962 года Гюнтер приплыл в Монреаль на немецком грузовом корабле и оттуда добрался до Мэдисона. В ноябре 1966 года он завершил свое обучение и решил отправиться в возглавляемую Джорджем Пэледом лабораторию клеточной биологии Рокфеллеровского университета. Революция в знаниях о клетке случившаяся в стенах этого университета в 1945 году и приведшая к открытию всех основных клеточных структур, продолжалась в области определения их структуры и функций. Появления Гюнтера в лаборатории совпало с окончанием второй стадии исследований и началом третьей стадии — молекулярного анализа клеточных функций. Он оказался достаточно удачлив и сумел принять участие в разработке этой третьей стадии исследования, которая продолжается до сих пор.

Джордж Пэлед был для него наиболее авторитетным наставником, добрым другом и прекрасным коллегой. Пэлед научил его тому, собрать воедино и осмыслить разрозненные факты, как сформулировать рабочую гипотезу и как разработать систему экспериментов, необходимых для проверки этой гипотезы.

В Нью-Йорке состоялась свадьба с Лаурой Майоглио. Лаура изучала историю искусств и после смерти отца унаследовала ресторан «Barbetta», открытый её отцом в 1906 году. Лаура познакомила Гюнтера со многими связанными с миром искусства удовольствиями, о которых он до этого времени не подозревал. Она очень поддерживала супруга в его работе и никогда не жаловалась на то, что он проводил в лаборатории слишком много времени.

В 1994 году он основал благотворительную организацию «Friends of Dresden, Inc. «, целью которой было организовать сбор средств в США для восстановления дрезденского собора Frauenkirche. Восстановление многих исторических памятников Дрездена стало одним из самых волнующих следствий объединения Германии и её освобождения от коммунистической идеологии. Детские мечты стали явью.

Глава 2. Метод исследования

Схема эксперимента

Как известно, белки в клетке синтезируются на специальных органеллах — рибосомах. Рибосомы эти либо плавают в цитоплазме, либо связаны со специальным компартментом клетки — шероховатой эндоплазматической сетью (мы сейчас говорим об эукариотической клетке). То есть вновь синтезируемый белок должен оказываться в цитоплазме. От цитоплазмы (точнее, цитозоля — растворимого компонента цитоплазмы) они отгорожены мембраной, а в них самих белковый синтез не идет или же ограничен очень малым набором белков. В полный рост встают два вопроса: как новехонькие белки узнают, куда они должны идти — в ядро, в митохондрии, в секреторные гранулы? И каким образом эти молекулы нередко весьма немалого размера пересекают липидную мембрану?

Блобель нашел ответы на оба вопроса. Как часто случается, они оказались взаимосвязаны. Общие закономерности, выявленные сегодняшним лауреатом, действуют во всех эукариотических организмах — от дрожжевой клетки до венца природы Hono sapiens.

К тому времени уже было известно, что белки, предназначенные клеткой к секреции в окружающую среду, каким-то образом попадают внутрь эндоплазматической сети (ЭПС), а оттуда уже идут наружу. Блобель и взялся выяснить — как именно они оказываются в ЭПС? В 1971 году он сформулировал «сигнальную гипотезу». Согласно ей, белки, предназначенные для секреции, содержат специальный сигнал, который распознается каким-то комплексом в ЭПС. В 1975 году Блобель показал, что этот сигнал закодирован непосредственно в аминокислотной последовательности белка, еще точнее — в его начальной, N-концевой части. А биохимические свидетельства натолкнули его на мысль, что белок проходит через мембрану по специальному каналу.

За два с половиной десятка лет, истекших с тех пор, этот процесс, получивший название котрансляционной транслокации, активно изучался и Блобелем, и в других лабораториях. Котрансляционной — потому, что протекает он одновременно с трансляцией, то есть синтезом белка на рибосоме. Современная картина транслокации, пожтвержденная многочисленными биохимическими и генетическими экспериментами, выглядит так. Как только рибосома синтезирует самое начало белка, где содержится сигнальный пептид, с ним связывается специальный комплекс — частица распознавания сигнала (signal recognition particle, SRP). В мембране ЭПС находится другой белковый комплекс — рецептор SRP. Он распознает SRP, связанную с растущей полипептидной цепью и рибосомой, и вся эта конструкция оказывается связанной на поверхности ЭПС. Рибосома при этом садится не просто на липидный слой, а связывается еще одним комплексом — так называемым Sec61p-комплексом, который и является каналом для транслокации белковой цепи. После связывания канал открывается, N-конец растущей цепи с помощью специального белка TRAM в него проталкивается, и дальше связывается белками-шаперонами внутри ЭПС. На этом этапе сигнальный пептид уже не нужен, и он в большинстве случаев отщепляется специальными протеазами. Далее уже рибосома спокойно синтезирует белок, который по мере роста проталкивается сквозь канал и уже в ЭПС складывается в нужную трехмерную структуру. Таков механизм в общих чертах — детали, выявленные Блобелем и его коллегами. К началу 80-х стало ясно, что механизм, предложенный Блобелем, работает не только в случае транслокации белков через мембрану ЭПС. Для каждой клеточной органеллы существует своя сигнальная последовательность, сродни почтовому индексу на конвертах. Конкретные белки, ответственные за транслокацию, разные для разных органелл, но принцип тот же — распознавание сигнального пептида, связывание с мембраной органеллы, связывание с трансмембранным каналом, проталкивание растущей пептидной цепи, отщепление сигнального пептида.

Рис. 1

Описание эксперимента

Свою экспериментальную деятельность Блобель начал в 60-х годах в качестве аспиранта в лаборатории Вэна Р. Поттера в Институте исследования рака Мак-Ардла. Затем он продолжил свою карьеру сотрудника лаборатории Джорджа Э. Пэледа в Рокфелеровском университете Нью-Йорка. К тому времени маршрут перемещения секреторных белков внутри клетки, начиная с момента их синтеза и заканчивая их выделением из клетки, — так называемый «секреторный путь» — уже был исследован Джорджем Пэленом и его сотрудниками. Используя этот метод быстрообменивающихся меток для введения радиоактивно меченых аминокислот в тканевые срезы с последующим фракционированием клеток и проведением авторадиографии, Пэлед и его коллеги установили, что секреторные белки проходят через мембрану гранулярной эндоплазматической сети во время или сразу после их синтеза. Было выдвинуто предположение, что перемещение секреторных белков по эндоплазматической сети приводит к их сегрегации (отделению) от цитозольных белков. Из эндоплазматической сети секреторные белки при помощи везикулярных переносчиков транспортируются в цистерны аппарата Гольджи. На конечном этапе секреции везикулы, отпочковываются от трансцистерны аппарата Гольджи и содержащие внутри себя секркторные белки, сливаются с плазматической мембраной, что приводит к выбросу (или экзоцитозу) этих белков во внеклеточное пространство (см. рис 1).

Первая версия сигнальной гипотезы.

В сотрудничестве с Дэвидом Сабатини Блобель проверил одну из гипотез, а именно гипотезу о различиях в белковом составе свободных и связанных с эндоплазматической сетью рибосом. В своем эксперименте они использовали одномерный электрофорез в SDS — полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Несмотря на то, что этот метод не позволял добиться разделения всех рибосомных белков, они не смогли обнаружить существенных различий в белковом составе этих двух групп рибосом. Следовательно, они опровергли гипотезу о том, что накопление в эндоплазматической сети мРНК, кодирующих секреторные белки, происходят из-за особых свойств рибосом, связанных с эндоплазматической сетью.

В 1971 году они выдвинули взамен этой гипотезы предложение о том, что аккумуляции мРНК на эндоплазматической мембране объясняется связыванием с мембраной мРНК, а образующегося в процессе её трансляции продукта. Предложили, что все мРНК секреторных белков содержат код для сигнальной N-концевой аминокислотной последовательности синтезируемого белка, опознаваемой неким растворимым фактором, который, в свою очередь, связывает комплекс «рибосома — синтезирующийся белок» с мембраной эндоплазматической сети. Также предложили, что свободные и связанные с эндоплазматической сетью рибосомы совершенно одинаковы и неразличимы между собой, и что они циклически перемещаются между цитозолем и эндоплазматической сетью. В то время были расшифрованы лишь некоторые участки аминокислотных последовательностей секреторных белков, и не существовало никаких доказательств того, что эти белки содержат некую общую для них N-концевую аминокислотную последовательность, что подобно N- концевая последовательность может быть временным, а не постоянным элементом синтезируемого белка. Поэтому у них не возникло сомнений относительно того, стоит ли опубликовывать гипотезу.

Для экспериментальной проверки этой гипотезы было необходимо разработать способ получения бесклеточной системы, в которой достоверно осуществлялись бы трансляция белков и их перемещение через мембрану микросом. Они надеялись воссоздать такую систему in vitro из определенных компонентов. Для выполнения этой задачи они начали серию экспериментов по разрушению клеточных структур. Начали с полисом. Используя пуромицин и концентрированный солевой раствор, выделили функциональные рибосомные субъединицы вместе со связанной с ними мРНК. Используя аналогичную методику, сумели осуществить «разборку» гранулярных микросом. В итоге им удалось получить мембранную фракцию, практически свободную от мРНК и рибосом. Кроме того, они выделили «нативные» маленькие рибосомные субъединицы, связывающие факторы инициирующие процесс трансляции. Эти инициирующие факторы могли диссоциировать подобно мульти-субъединичным комплексам. Получив все эти компоненты, они предприняли попытку реконструировать из известных компонентов функциональную систему трансляции транспорта белков.

Сигнальная пептидаза.

Совместно с Бернардом Добберштейном Блобель смог воспроизвести результаты, полученные в лабораториях Ледера и Мильштейна. Осуществили трансляцию полиА-мРНК миеломных клеток в бесклеточной системе, собранной из гетерологичных компонентов. В результате получили большой полипептид, который был примерно на 3 килодальтон больше, чем зрелая форма легкой цепи белка, секретируемого этими миеломными клетками.

Пытаясь разрешить вопрос о том, является ли удлиненная форма легкой цепи IgG физиологическим предшественником зрелой молекулы, или же она возникает как следствие проведение трансляции in vitro, они руководствовались тремя предположениями. Во-первых, как предположил Мильштейн и его коллеги, выполняющий операцию процессинга фермент (названный сигнальной пептидазой) представляет собой связанную с мембраной протеазу. Следовательно, этот фермент в процессе выделения гранулярных микросом может быть переведен в раствор и подвергнут обработке детергентом; после этого «выделение» полисомы, которые можно осадить центрифугированием, уже не будут содержать сигнальной пептидазы. Во-вторых, поскольку сигнальная последовательность предположительно обеспечивает связывание рибосомы с цис — стороной мембраны (см. рис. 2), то активность сигнальной пептидазы, скорее всего, будет связана с транс — стороной микросомной мембраны. В этом случае удаление сигнальной последовательности происходит только после того, как она обеспечит связывание белка с цис — стороной мембраны. В-третьих, после связывания с мембраной сигнальная последовательность в составе белковой молекулы перемещается через мембрану и появляется на другой её стороне. Там она отщепляется «котрансляционно» и «котранслокационно» то есть во время, но не после завершения этих процессов. Следовательно, в «выделенных» полисомах рибосомы, расположенные вблизи 5'-конца мРНК, могут содержать синтезируемые белковые цепочки, включающие в себя сигнальную последовательность. Наоборот, рибосомы, расположенные возле 3'-конца мРНК, должны содержать синтезируемые цепочки с уже отщепленной сигнальной последовательностью.

В полном соответствии с этими предположениями обнаружили, что синтез белковых цепочек, уже присутствующих в выделенных полисомах, может быть доведен до конца в бесклеточных трансляционных системах с образованием, как зрелой, так и удлиненной форм легкой цепи. Более того, в ходе эксперимента они отметили, что первым завершался синтез белковых молекул, уже утративших сигнальную последовательность, и лишь после этого завершался синтез тех молекул, которые все еще содержали её в своем составе (см. рис. 3) полученные результаты подтвердили о том, что рибосомы, расположенные ближе к 3'-концу мРНК, содержат синтезирующиеся белковые цепи с уже отщепленной во время процессов трансляции и транслокации сигнальной последовательностью. И наоборот, белковые цепи, синтезируемые рибосомами, находящимися возле 5'-конца мРНК, все еще содержат сигнальную последовательность. Поскольку в процессе подготовки препарата выделенных полисом они теряли сигнальную пептидазу, отщепление сигнальной последовательности оказалось невозможным. Результаты эксперимента с выделенными полисомами свидетельствовали о том, что полученная в результате завершения синтеза удлиненная форма легкой цепи IgG, несомненно, представляла собой артефакт, образующийся при синтезе in vitro. Во время синтеза in vivo сигнальная последовательность отщепляется от синтезирующейся молекулы, но не от молекулы, синтез которой уже завершен. Следовательно, полностью синтезированная удлиненная форма легкой цепи IgG не является физиологическим предшественником зрелой формы этого белка.

Воспроизведение процесса котрансляционной транслокации

полученная информация об отщеплении сигнальной последовательности дала ключ к дальнейшим попыткам воспроизвести процесс трансляции и транслокации легкой цепи IgG. С учетом сигнальной гипотезы способность удлиненной белковой цепи к транслокации через мембрану казалась сомнительной, то есть бесклеточный синтез полной удлиненной цепи в отсутствии мембран и последующая посттрансляционная инкубация полученного белка с микросомными везикулами не должны были привести к транслокации удлиненной цепи через мембрану везикул и её превращению в зрелую молекулу. Обнаружили, что добавление в реакционную среду, содержащую удлиненную форму легкой цепи IgG, микросомных везикул после завершения процесса трансляции in vitro не вызывает перехода молекул в зрелую форму.

На тот момент команда переживала чрезвычайно неудачный период в своих попытках воспроизвести процесс котрансляционной транслокации. Все микросомные препараты, которые готовились из тканей обычных лабораторных животных, очень сильно ингибировали синтез легкой цепи IgG уже в процессе трансляции. Поскольку процесс трансляции полностью ингибировался при добавлении микросомных мембран, исследователи ни коим образом не могла обнаружить связанную с трансляцией транслокацию белковых молекул через эти мембраны.

Решение этой дилеммы было найдено в декабре 1974 года. Появилась возможность подготовить и протестировать другой препарат гранулярных микросом, выделенных из нового материала — поджелудочной железы собаки. Введение таких микросомных мембран в реакционную среду не вызвало ингибирования трансляции. Проведенный электрофорез продуктов трансляции показал, что в присутствии микросомных везикул большая часть легкой цепи IgGсинтезируется в зрелой форме. Это в значительной мере свидетельствовало о том, что сигнальная последовательность синтезирующейся белковой цепи задействована в транслокационном аппарате мембраны и становится доступна для сигнальной пептидазы лишь на внутренней стороне везикулярной мембраны. Зрелые белковые молекулы осаждались из раствора вместе с везикулами, что подтверждало их локализацию во внутреннем пространстве этих везикул.

В качестве контрольного эксперимента они также осуществили трансляцию мРНК ретикулоцитов. Трансляция этой мРНК привела к обоазованию преимущественно двух глобиновых белковых цепочек. Обе цепи представляют собой цитозольные белки и, следовательно, содержат сигнальную последовательность, необходимую для перемещения во внутреннее пространство эндоплазматической сети. Кроме этого, при добавлении в реакционную среду микросомных везикул из клеток поджелудочной железы собаки глобиновые цепочки не должны укорачиваться, то есть не должно происходить отщепление части молекулы под действием сигнальной пептидазы. При добавлении в реакционную среду фракции микросомных мембран не наблюдалось перехода глобиновых цепей в меньшую по размеру форму. Но они обнаружили, что глобиновые цепи осаждаются вместе с микросомными везикулами. Для решения этой проблемы, провели пространственную инкубацию полученных продуктов реакции с протеолитическими ферментами. Посттрансляционная инкубация с протеолитическими ферментами должна была установить различия между белками, связанными с поверхностью мембраны, и белками, находящимися во внутреннем пространстве везикул. Обнаружили, что обе глобиновые цепи подвергались сильному разрушению под воздействием добавленных протеаз вне зависимости от того, осуществилась ли трансляция в отсутствие или в присутствии везикул.

Еще более важным оказалось то, что посттрансляционный протеолиз продуктов реакции, осуществляемый в присутствии микросомных везикул, вызывал деградацию удлиненной формы легкой цепи IgG, но не зрелой её формы. Полученные результаты свидетельствовали о том, что даже в присутствии микросомных мембран часть синтезирующихся белковых молекул не взаимодействует с транслокационным аппаратом мембраны; следовательно, после завершения реакции трансляции они остаются в удлиненной форме. Поскольку удлиненные молекулы не попадают во внутреннее пространство везикул, добавление протеолитических ферментов вызывает их протеолиз.

Собранные воедино, эти данные в значительной мере свидетельствовали о том, что они добились успеха и сумели воспроизвести in vitro начальные стадии транспорта секреторных белков внутри клетки. Это давало возможность проведения биохимического анализа процесса перемещения белков по эндоплазматической сети. Эти эксперименты ознаменовали начало молекулярной клеточной биологии. Впоследствии многие другие реакции, происходящие на поверхности мембраны, были также успешно воспроизведены in vitro.

Расширенная сигнальная гипотеза

Успех экспериментов по воспроизведению реакции трансляции вдохновил их на дальнейшую разработку и усложнение предложенной в 1971 году модели. Самым существенным из добавленных к гипотезе постулатов было утверждение, что транспорт белков через микросомную мембрану осуществляется через специальные мембранные каналы. Предположили, что транспортный канал для белков образуется субъединицами интегрального мембранного белка. Сигнальная последовательность синтезируемой белковой молекулы и рибосома, осуществляющая синтез данной цепочки, связывается с этими субъединицами, изменяя из конфигурацию, что приводит к образованию в мембране водного канала, обеспечивающего возможность транспортировки белковой молекулы через мембрану. Концентрация белокпроводящих каналов (мембранных каналов для транспорта белков) оставалась спорной в течение многих лет до тех пор, пока проведенные в 1991 году электрофизиологические эксперементы не подтвердили её. В течение 15 лет, прошедших с момента выдвижения этой гипотезы и до появления её доказательств, широкое распространение получили альтернативные гипотезы, предполагающие, что перенос секреторных белков через мембрану осуществляется прямо через бислой липидов без участия каких-либо мембранных белков.

Так же предполагалось, что интегральные мембранные белки, участвующие в транслокации сегмента синтезируемой белковой цепи на внутреннюю сторону везикулярной мембраны, могут использовать её сигнальную последовательность для запуска собственно процесса транслокации.

Наконец, они так же предсказали, что процесс транслокации белков через другие клеточные мембраны, например, перенос синтезированных в цитоплазме белков внутрь митохондрии так же должен быть опосредован некой сигнальной последовательностью, отличающейся от таковой секреторных белков.

Интеграция мембранных белков

Для того, чтобы проверить действительно ли интегральные мембранные мембранные белки используют сигнальную последовательность для запуска процесса транслокации белковой на внутреннюю сторону мембраны, провели исследование гликопротеина (G-белка) вируса везикулярного стоматита (VSV). Этот белок входит в состав мембраны вируса и состоит из N-концевого домена, экспонированного на поверхность мембраны, одного трансмембранного сегмента и С-концевого домена, взаимодействующего с капсидом вируса. Для обеспечения подобного расположения G-белка в мембране вируса его N-концевой домен должен быт транслирован на внутреннюю сторону мембраны, а в то время как С-концевой домен должен оставаться на ее внешней стороне.

По их мнению, для осуществления такой асимметричной интеграции в мембране эндоплазматической сети требовалась сигнальная последовательность, неотличимая от таковой секркторных белков, которая могла инициировать процесс транслокации белка. Еще одна дополнительная последовательность, которую они назвали «стоп-трансферной», должна была затем прерывать процесс транслокации. Предложили, что «стоп-трансферная» последовательность может приводить к латеральному открытию мембранного канала, таким образом обеспечивая белковой молекуле возможность перемещения из водной среды РСС в гидрофобное окружение липидного бислоя. Затем «стоп-трансофменая» последовательность становится трансмембранным сегментом молекулы, расположенным в толще липидного бислоя. С-концевой остаток белковой молекулы не подвергается транслокации и остается на внешней стороне мембраны. Следует отметить, что в те дни еще не существовало чистых препаратов мРНК, которые могли бы быть легко получены путем транскрипции in vitro рекомбинативных ДНК. Все что они могли сделать, — это выделить всю матричную РНК из клеток или тканей, содержавших основные типы мРНК, в процессе трансляции которых получились крупные и легко определяемые продукты. Клетки, инфицированные VSV, представляли собой отличную модель для исследовании, поскольку большая часть мРНК, выделенной из этих клеток кодировала вирусные белки. Среди этих белков G-белок был самым крупным и легче всего поддавался идентификации путем электрофореза. Эксперименты осуществляли в сотрудничестве с лабораторией Харви Лодиша, основную работу выполнили его аспирант Флора Катц и аспирант лаборатории группы Блобеля Вишвант Лиджаппа.

Как предполагалось, трансляция мРНК, выделенной из инфицированных VSV клеток, привела к образованию G -белка и других вирусных белков. Однако, вопреки ожиданиям, в случае присутствия во время трансляции микросомных везикул по меньшей мере половина молекул G-белка синтезировалась, в более тяжелой форме. Вместо того, чтобы отщеплять от молекулы G-белка предполагаемую сигнальную последовательность, мембраны, казалось, наоборот, что — то к ней добавляли. Полученные результаты привели их в сильное замешательство, но потом они подумали о том, что микросомы собаки могут содержат активированные олигосахаридилтрансферазу для осуществления котранслокационного гликозилирования G-белка. Присоединившиеся сахара могли с лихвой скомпенсировать потерю массы, происходящую после отщепления сигнальной последовательности и, следовательно, привести к замедлению миграции белка при электрофорезе. Биохимический анализ белков G0 и G1 подтвердили, что в состав G0 входила N-концевая сигнальная последовательность, которая в структурном и функциональном отношении была эквивалентна таковой секреторных белков. Молекулы G1-типа уже успели утратить сигнальную последовательность и присоединить к себе молекулы сахаров. Кроме того, включение в эксперимент посттрансляционного протеолиза, привело к полному разрушению белка G0, в то время как молекула белка G1 всего лишь превращалась в чуть более легкую молекулу.

Эта меньшая молекула представляла собой белок G1, утративший свой С-концевой домен.

Данные, полученные из эксперимента с посттрансляционным протеолизом, доказывали, что G-белок сумел правильно встроиться в везикулярную мембрану. Как и в случае интеграции iv vivo, объемный N-концевой домен переместился на внутреннюю поверхность с мембраны, в то время как меньший по размерам С — концевой домен, состоящий приблизительно из 40 аминокислотных остатков, остался на ее внешней стороне.

Микросомные везикулы оказались способны не только к транслокации секреторных белков, но также и к ассиметричному встраиванию мембранных белков и их гликозилированию.

Эти результаты показали, что асимметричная интеграция мембранных белков не является спонтанным процессом, а предтавляет собой реакцию, катализируемую в эндоплазматической сети и, возможно, использующую тот же механизм, который обеспечивает транслокацию секреторных белков. [8]

Сигнал — распознающий комплекс

Теперь следующей целью стала разработка транслокационного аппарата макросом на его функциональные компоненты. Они показали, что после промывки микросомных везикул растворяют соли теряющие способность к транслокации секреторных белков. Такие везикулы уже не могли осуществлять котрансляционную ранслокацию секреторных белков, синтезированных в бесклеточной системе трансляции, выделенной из зародышей пшеницы. Последующее добавление этого раствора в систему транслокации in vitro, содержащую уже обратные солевым растворам микросомные везикулы, приводила к восстановлению их транслокационной активности. Такие данные позволяли сделать предположение, что солевой раствор извлекал из мембран фактор активности, необходимый для осуществления транслокации белков. Аспирант лаборатории Питер Уолтер обнаружил, что этот фактор, будучи переведенным в солевой раствор, терял свою активность уже через несколько часов инкубации 0? С. Этот факт, обрекал на неудачу все попытки выделить этот фактор активности до тех пор, пока Питер не обнаружил, что добавление к раствору неионного детергента «Никкол» в низких концентрациях приводит к стабилизации этой активности. Они предложили, что «Никкол» защищает гидрофобный участок, отвечающий за транслокационную активность мембраны; возможно, это было место связывания с гидрофобной сигнальной последовательностью. С учетом этой концепции гидрофобного участка, оказалось возможным обеспечить быстрое восстановление фактора активности в процессе очистки препарата. Фактор активности имел коэффициент седиментации, равный 11S, и, согласно результатам электрофореза в SDS — полиакриламидном геле, состоял из 6 белков. Основываясь на всестороннем анализе его функции, они дали этому белковому комплексу название «сигнал — распознающий белок» (SRP).

Еще два года понадобилось на то, чтобы понять, что в составе очищенного фактора активности также входит 7S РНК. Они изменили его название, сохранив неизменной аббревиатуру; теперь фактор активности носил название «сигнал — распознающий комплекс». Большая и трудоемкая работа выполненная лабораториями Питера Уолтера и Бернарда Добберштейна, привела к созданию функциональной и структурной модели SRP и к открытию интересного гомолога этого комплекса в бактериальных организмах.

Функциональный анализ показал, что SRP клеток поджелудочной железы собаки связывался (с довольно низкой степенью сродства) с рибосомами клеток зародышей пшеницы. Однако, степень сродства SRP и рибосомам резко возрастала в случае, когда программирование работ рибосом из клеток зародышей пшеницы производилось при помощи мРНК, кодирующей секреторные белки (коровий пре — пролактин), а не цитозольные белки (глобин). Далее, если трансляция осуществлялась в присутствии гидроксилейцина вместо лейцина, то связывание SRP в значительной мере снижалось. Поскольку сигнальная последовательность пре — пролактина богата лейцином, полученные результаты означали, что SRP взаимодействует непосредственно с сигнальной последовательностью. Кроме того, взаимодействие с SRP вызывало прекращение трансляции в случае, когда рибосомы работали с мРНК секреторного белка, но не тогда, когда в трансляции принимала участие мРНК, кодирующая цитозольные белки. После прекращения трансляции размер синтезированного фрагмента секреторного белка составлял приблизительно 70 аминокислотных остатков. Это дает основания предполагать, что взаимодействие с сигнальной последовательностью происходит после того, как она полностью выйдет из туннеля в большой рибосомной субъединице препарата микросомных мембран процесс трансляции возобновляется; это могло означать, что мембрана эндоплазматической сети содержит рецепторы SRP, способные снова запускать трансляцию после того, как она была блокирована присутствием SRP.

Установили, что собранные in vitro полисомы, синтезирующие секреторные (не цитозольные) белки, связывалась с микросомами, лишенными SRP (после солевой обработки) только присутствии SRP. Связывания не происходило, если препарат SRP был предварительно обработан N — этилмалеимидом.

Полученные результаты говорили в пользу того, что транслокация белков через мембрану эндоплазматической сети представляет собой рецептор — опосредованный процесс. Гипотеза о том, что этот процесс происходит спонтанно и без участия других белков, была окончательно опровергнута.

Открытие сигнал — распознающего комплекса стало важным событием в молекулярном анализе процесса транслокации белков через мембрану эндоплазматической сети. Функция этого комплекса соответствовала функции «фактора связывания», существование которого было предсказано еще в 1971 году. Этот комплекс стал первым, выделенным и изученным компонентом мембранных систем транслокации. Он стал важным доказательством правильности сигнальной гипотезы.

SRP — рецептор

Рейд Гилмор, сотрудник лаборатории, воспользовался способностью подвергнуть солевой обработке микросомных мембран к восстановлению заблокированного SRP процесса синтеза секреторных белков и провел выделение очищенного рецепторного комплекса. Вместе с сигнальной пептидазой мембраны этот комплекс можно было перевести в раствор путем обработки уже промытых солевым раствором микросомных мембран неионным детергентом и умеренными концентрациями солей. Выделенный SRP — рецептор состоял из двух субъединиц. Большая субъединица представляла собой периферический мембранный белок, в то время как меньшая являлась интегральным мембранным белком и включала в себя один трансмембранный сегмент. Оба белка, как выяснилось, относились к ГТА-связывающим белкам. SRP и SRP — рецептор взаимодействовали друг с другом, SRP-рецепторы обнаруживались исключительно на эндоплазматических мембранах и были представлены в субстехиометрическом количестве по отношению к ассоциированным с мембраной рибосомам.

С открытием SRP и связанного с ним рецептора были определены и выделены все компоненты, участвующие в распознавании сигнальной последовательности и направленной транслокации белков через эндоплазматическую мембрану.

Сигнальная пептидаза

Участок синтезируемой молекулы секреторного белка, с которым взаимодействует сигнальная пептидаза при отщеплении сигнальной последовательности, становится доступным для этого фермента только на внутренней стороне эндоплазматической мембраны. Следовательно, отщепление сигнальной последовательности зависит от процесса транслокации. Сотрудник лаборатории Роберт Джексон разработал независимый от транслокации метод исследования процесса отщепления сигнальной последовательности. Он осуществил солюбилизацию микросомной сигнальной пептидазы при помощи детергента. Используя в качестве субстрата синтезированный in vitro предшественник секреторного белка, он показал, что выделенный таким способом фермент способен осуществлять корректное эндопротелитическое отщепление сигнальной последовательности.

Аспирант лаборатории Эмили Эванс выполнила очистку солюбилизированной микросомной сигнальной пептидазы. Это оказалось очень сложным делом, поскольку для сохранения активности фермента требовалось присутствие липидов и детергентов на всех стадиях этого процесса. Удаление липидов из раствора приводило к быстрой инактивации фермента. К их удивлению, очищенная сигнальная пептидаза оказалась комплексом, состоящим из пяти различных субъединиц; все они являлись интегральными мембранными белками.

Очистив и выделив SRP — рецептор и сигнальную пептидазу, они получили два компонента микросомной мембраны, которые могли быть переведены в растворимую форму при помощи детергентов, и которые они могли по отдельности использовать для изучения интактных микросом и процесса транслокации. Их следующей задачей стало выделение РСС. Составляющие его белки скорее должны были быть интегральными мембранными белками. Для того, чтобы отделить их от других мембранных белков, необходимо было солюбилизировать их при помощи детергентов. Однако, в отличие от SRP — рецепторов и сигнальной пептидазы, для осуществления корректного анализа их активности необходимо было осуществить обратное встраивание этих белков в протеолипосомы.

Электрофизиологическое обнаружение каналов транспорта белков

Впервые они предложили концепцию существования каналов транспорта белков (РСС), образованных интегральными мембранными белками, еще в 1975 году. Однако, эта концепция оставалась довольно спорной, в частности, из — за того, что они не смогли представить прямых её доказательств. Появились альтернативные модели, предполагающие, что белки транспортируются непосредственно через липидный бислой. В 1985 году они показали, что синтезирующиеся белковые молекулы в процессе транслокации оказываются доступны для водорастворимых агентов. Несмотря не то, что эти данные соответствовали концепции водных РСС, их было недостаточно для полного исключения гипотезы о том, что водное окружение белковой молекулы могло временно создавать гидрофильными «головками» липидов, а не белками, формирующими такой водный канал.

Несмотря на то, что электрофизиологические методы использовались в качестве стандартных методов идентификации и характеристики ионных каналов, они никогда не применялись ранее для обнаружения и характеристики каналов для транспорта белков. Трудно было предположить, как такие каналы ведут себя в электрофизиологическом плане. Предполагалось, что они должны открываться и закрываться при транслокациии каждой молекулы белка. Более того, Блобель полагал, что скорее всего, прохождение молекул белка через канала не будет сопровождаться одновременным сонаправленным переносом большого количества ионов или низкомолекулярных соединении. Было похоже, что РСС постоянно пребывали в закрытом состоянии, за исключением транслокациии белковых молекул. Скорее всего, эти каналы имели также некую систему предотвращения сонаправленного переноса ионов во время транслокациии белков. Поэтому было неясно, удастся ли вообще обнаружить эти каналы при помощи электрофизиологических методов.

Поскольку гранулярные микросомы были слишком маленькими для применения методики «пэтч — кламп», они решили использовать в своем исследовании систему плоского билипидного слоя, предложенную в 1962 году Мюллером и коллегами. Для получения этой системы необходимо осуществить слияние липосом с плоским билипидным слоем, расположенным в отверстии перегородки, разделяющей две камеры (см рис. 4). Добавление микросом в цис — камеру приводит к случайным слияниям отдельных гранулярных микросом с липидным бислоем, что доказывает увеличением его проводимости. При помощи электронной микроскопии было доказано, что каждая из везикул гранулярных микросом содержит около сотни ассоциированных с мембраной рибосом. Многие из этих рибосом потенциально находятся в процессе транслокациии белковой цепи через мембрану. Следовательно, маловероятно, что несколько скачков проводимости, зарегистрированных ими, были связаны с каналами транспорта белков. Тем не менее, тот факт, что они вообще смогли зарегистрировать изменения в проводимости, означал, что слияние микросомных везикул с плоским бислоем действительно имело место.

Перед Блобелем возник вопрос: возможно ли было закрыть открытый пуромицином канал, увеличив концентрацию солей в растворе, что должно было привести к диссоциации рибосом от мембраны? Если при низких концентрациях солей и пуромицина они добивались открывания отдельного РСС, то при последующем увеличении концентрации солей он закрывался. Этот результат вполне согласовался с предположением, что открытие пуромицином канала удерживаются в таком состоянии ассоциированными с мембраной рибосомами, но закрываются, когда рибосомы отделяются от мембраны (см. модель на рис 5).

Возможно ли обнаружение РСС в других мембранах и методами, отличными от индуцированного пуромицином отщепления синтезируемой белковой цепи? Служит ли сигнальная последовательность лигандом, необходимым для открывания таких каналов, как это предполагала сигнальная гипотеза? Чтобы ответить на эти вопросы Блобель обратил внимание на плазматическую мембрану прокариотических клеток. Считалось, что в процессе эволюции эндоплазматическая сеть появилась в результате впячивания прокариотической плазматической мембраны внутрь клетки. Действительно, сигнальная последовательность бактериальных секреторных белков нормально функционирует обеспечивая их транслокацию через мембрану эндоплазматической сети эукариотической клетки и, наоборот, сигнальная последовательность, работающая в эукариотических клетках, также обеспечивает транслокацию эукариотических секреторных белков через прокариотическую мембрану. Следовательно, вполне возможно, что каналы для транспортировки белков через прокариотическую плазматическую мембрану похожи на аналогичные каналы эндоплазматической сети эукариот.

Визуализация РСС

Используя генетические методы анализ, Шекман и его коллеги определили в качестве наиболее вероятного кандидата на роль РСС в клетках дрожжей комплекс Sec61. Рапопорт и другие сумели выделить из клеток млекопитающих аналог вышеупомянутого дрожжевого комплекса, используя технику субфракционирования с последующим встраиванием комплекса в протеолипосомы. Выполненная ими работа позволила установить, что РСС представляет собой гетеротример, состоящий из б, в и г — субъединиц комплекса Sec61 (рис. 6).

Целью работы Блобеля являлась — визуализация транспортных каналов в активном состоянии. Для этого к рибосомам добавляется усеченная мРНК, трансляция, которой дает белковые цепи, достаточно длинные для того, чтобы сигнальная последовательность оказалась экспонированной на поверхности большой рибосомной субъединицы. Такие комплексы рибосома/ синтезируемый белок можно использовать для взаимодействия с SRP, SRP — рецептором и комплексом Sec61.

Вне всяких сомнении, каналы транспорта белков представляют собой одно из чудес природы. В отличие от ионных каналов, которые открываются и закрываются только в одном измерении, РСС работают в двух измерениях, в плоскости липидного бислоя и поперек него. Они не просто обеспечивают пассивное перемещение белковой молекулы, но и «сканируют» развернутую белковую цепь по мере её прохождения через канал; обнаружив «стоп — трансферную» последовательность, канал открывается в латеральном направлении. Более того, РСС сконструированы таким образом, что не пропускают больших количеств низкомолекулярных соединении и ионов. Совсем недавно было получены доказательства существования обратной транслокациии и дезинтеграции мембранных белков. Для обеспечения протеолиза секреторных и интегральных мембранных белков цитоплазматическими протеазами белки могут транспортироваться в обратном направлении или перевариваться прямо на поверхности эндоплазматической сети. Обратная транслокация и дезинтеграция осуществляется путем открывания транспортного канала с внутренней стороны мембраны или путем дополнительного латерального открывания каналов со стороны липидного бислоя. [2. 3]

Глава 3. Методы, используемые в ходе реализации эксперимента

В ходе своей работы Блобел использовал множество методов для её реализации. Наиболее интересным я считаю метод электрофореза в SDS полиакриламидном геле.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Механизм разделения

Элетрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.

При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:

белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;

количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;

собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

Интерпретация результатов

В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и другое.

Заключение

В данной работе была изучена биография нобелевского лауреата Гюнтера Блобеля. Его работа, начавшаяся как исследование механизмов переноса секреторных белков через мембрану эндоплазматической сети, со временем превратилась в увлекательное путешествие в мир клетки, открывшее принципы самоорганизации клеток и образования различных мембран и клеточных компонентов. Большинство клеточных белков, включая интегральные мембранные белки, содержат элементы присущих только им аминокислотных последовательностей. Эти последовательности расшифровываются специальными распознающими факторами, а соответствующие рецепторы и эффекторы определяют путь следования белка к месту, где он необходим.

Разобрав эксперимент, стало ясно, что механизм, предложенный Блобелем, работает не только в случае транслокации белков через мембрану ЭПС, что для каждой клеточной органеллы существует своя сигнальная последовательность, сродни почтовому индексу на конвертах.

В данном эксперименте используется метод электрофореза, заключающийся в разделении смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью.

Список литературы

1. «Нобелевские лекции -100 лет» физиология и медицина том XV 1999−2000 авторы: В. С. Лобанков, В. В. Аношина, В. С. Разинов.

2. http: //www. nobelprize. org/nobel_prizes/medicine/laureates/1999/blobel-lecture. pdf

3. Внутриклеточная сигнализация, авторы: Зинченко В. П. Долгачева Л.П., Пущино 2003 год.

4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.

5. http: //www. nehudlit. ru/books/detail6105. html

6. http: //images. yandex. ru/yandsearch

7. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е. С. Северина., 2003.

Приложение

Рис. 2

Секреторный путь. Секреторные белки (показаны красным) синтезируются рибосомами, связанными с ЭПС. Затем при помощи везикулярных переносчиков они перемещаются в комплекс Гольджи и далее выводятся за пределы клетки.

Рис. 3

Первая версия сигнальной гипотезы (1971 год)

Сигнальная последовательность обозначена на рисунке крестиком и, согласно гипотезе должна узнаваться «фактором связывания», обеспечивающим связывание молекулы синтезируемого белка с мембраной ЭПС.

Рис. 4

Процесс считывания в полисомах миеломных клеток в бесклеточной системе трансляции.

Рис. 5

Схематической представление бислойной системы. Цис — камера отделена от Транс — камеры пластиковой перегородкой с маленькими круглыми отверстием, затянутым липидным бислоем. Слева: в цис — камеру добавлены гранулярные микрсомы (RM). Справа: отдельная микросома слилась с плоским бислоем.

Рис. 6

Схематическое изображение индуцированного пуромицином направленного высвобождения синтезируемой полипептидной цепи с последующей «разборкой» гранулярных микросом при высоких концентрациях солей.

Рис. 7

Топология гетеротримера Sec61 в мембране эндоплазматической сети.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой