РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФОРМ PGC-1? В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 612. 74,577. 29
Регуляция экспрессии изоформ PGC-1a в скелетных мышцах
Д. В. Попов1,2*, Е. А. Лысенко1, И. В. Кузьмин1,3, О. Л. Виноградова1,2, А. И. Григорьев1,2 1Институт медико-биологических проблем РАН, 123 007, Москва, Хорошевское ш., 76а 2Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 119 192, Москва, Ломоносовский просп., 27б, стр. 10 3Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет, 119 234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 *E-mаil: danil-popov@yandex. ru Поступила в редакцию 26. 11. 2014
РЕФЕРАТ В обзоре рассмотрены функциональная роль и регуляция экспрессии различных изоформ бел-ка-коактиватора PGC-1a, одного из ключевых регуляторов биогенеза митохондрий в скелетной мышце. Паттерн экспрессии мРНК PGC-1a может значительно изменяться в покое и после мышечной активности. Это связано с тем, что экспрессия гена PGC-1a с канонического и альтернативного промоторов регулируется различными физиологическими стимулами, которые воздействуют на разные сигнальные пути. Экспрессия с канонического (проксимального) промотора регулируется главным образом через AMP-активируемую протеинкиназу, а с альтернативного — через ?2-адренорецепторы. Транскрибируемые с обоих промоторов мРНК подвергаются альтернативному сплайсингу с образованием укороченных изоформ PGC-1a, которые обладают значительно большей устойчивостью к деградации и регулируют преимущественно ангиоге-нез, тогда как полноразмерные изоформы — биогенез митохондрий. Существование нескольких изоформ частично объясняет широкий спектр функций этого белка и повышает способность организма адаптироваться к различным физиологическим стимулам. Регуляция экспрессии гена PGC-1a с помощью различных сигнальных путей позволяет рассчитывать на разработку фармакологических способов воздействия на экспрессию этого гена. Это может иметь важное значение для лечения и профилактики различных заболеваний, таких, как метаболический синдром и сахарный диабет. Изучение механизмов, регулирующих экспрессию гена PGC-1a, и их функциональной роли может позволить управлять экспрессией этого гена с помощью физических нагрузок и/или фармакологических воздействий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА альтернативный сплайсинг, альтернативный промотор, скелетная мышца, PGC-1a, экспрессия гена.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AICAR — 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-Р — D-рибофуранозил-5'- -монофосфат- AMPK — АМР-активируемая протеинкиназа- ATF — активирующий фактор транскрипции- CaMK — Са2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа- CREB — сАМР-чувствительный фактор транскрипции- ERR — рецептор, родственный рецептору эстрогена- HDAC — деацетилаза гистонов класса IIa- HIF — фактор, индуцируемый гипоксией- IGF-1 — инсулиноподобный фактор роста 1- MEF — стимулирующий фактор миоцитов- p38 MAPK — митоген-активируемая протеинкиназа p38- PGC — коактиватор PPARy- PKA — протеинкиназа A- PPAR — рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом- UCP — разобщающий белок- VEGFA — фактор роста эндотелия сосудов A- Vо2max — максимальная скорость потребления кислорода.
ВВЕДЕНИЕ
Скелетные мышцы составляют более 30% веса взрослого человека. Высокий уровень метаболической активности позволяет рассматривать скелетные мышцы как секреторный орган, активно влияющий на работу других органов [1]. Во время мышечной работы в скелетных мышцах многократно увеличивается кровоток, потребление кислорода и раз-
личных субстратов: глюкозы, жирных кислот и др. Одновременно в работающем мышечном волокне происходит выраженное накопление ионов кальция и различных метаболитов, может наблюдаться снижение энергетического заряда клетки и окислительно-восстановительного потенциала. В ответ на регулярные аэробные физические нагрузки в скелетных мышцах развиваются значительные адаптационные
изменения: увеличивается уровень капилляриза-ции, объемная плотность митохондрий и активность окислительных ферментов, повышается максимальная скорость потребления кислорода и способность выполнять длительную работу. По современным представлениям эти адаптационные изменения тесно связаны с функцией коактиваторов семейства PGC-1 (коактиваторы ядерного рецептора у, активируемого пролифераторами пероксисом (PPARG)). Это семейство состоит из белков PGC-1a, PGC-1P и родственного PGC коактиватора. Одному из этих белков — PGC-1a — принадлежит наиболее значимая роль в регуляции биогенеза митохондрий в скелетной мышце.
Важно отметить, что известно несколько изоформ PGC-1a [2, 3]. По-видимому, этим можно частично объяснить столь широкий спектр функциональных свойств PGC-1a. Именно поэтому в последнее десятилетие изучению функций PGC-1a, механизмов активации этого белка и особенностей регуляции экспрессии его гена посвящено большое количество исследований. В скелетной мышце представлено несколько изоформ PGC-1a, обладающих разными функциональными свойствами. В настоящем обзоре рассмотрена роль PGC-1a и особенности регуляции экспрессии различных его изоформ, прежде всего в скелетных мышцах, как в покое, так и во время восстановления после физических нагрузок.
ПОЛНОРАЗМЕРНЫЕ ИЗОФОРМЫ РвСИа
Функциональная роль PGC-1a
Во время и сразу после однократной аэробной нагрузки в скелетной мышце активируется ряд сигнальных киназ, таких, как АМР-зависимая протеин-киназа (АМРК), кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМК) и митоген-активируемая про-теинкиназа р38 МАРК [4], а также NAD-зависимая деацетилаза [5]. В результате этого увеличивается экспрессия гена PGC-1a (PPARGC1A) (см. ниже), а также происходит увеличение фосфорилирова-ния и снижение ацетилирования (т.е. активация) уже имеющегося в клетке белка PGC-1a (рис. 1). В скелетных мышцах грызунов [6, 7] и человека [8, 9] активированный PGC-1a переносится в ядро, где коактивирует целый ряд факторов транскрипции. По-видимому, вызванная физическими упражнениями активация PGC-1a может происходить и без увеличения его содержания в ядре. Так, в скелетных мышцах человека однократные аэробные нагрузки повышают содержание в ядре АМРКа2 [10] и фос-форилированной р38 МАРК [11]. Предполагается, что это может способствовать активации уже находящегося в ядре PGC-1a.
Активированный PGC-1a может участвовать в активации транскрипции своего собственного гена по механизму положительной обратной связи [12], а также в активации целого ряда факторов транскрипции, таких, как ядерный респираторный фактор (NRF)-1 и -2, эстроген-связанный рецептор (ERR) a, рецепторы, активируемые пролифераторами перок-сисом (PPAR) a и у. Активация этих белков инициирует экспрессию целого ряда генов, кодирующих белки, которые регулируют окислительные реакции и углеводно-жировой обмен [13−15]. С другой стороны, NRF-1 и NRF-2 увеличивают экспрессию генов митохондриальных факторов транскрипции, А (TFAM), В1 (TFB1M) и В2 (TFB2M). Эти факторы, в основном TFAM и TFB2M, поступают в митохондрии и инициируют экспрессию генов, кодируемых митохондриальной ДНК [16]. Помимо этого, показано, что PGC-1a может проникать в митохондрии, где образует комплекс с TFAM [7, 17, 18]. Предполагается, что это способствует инициации экспрессии мито-хондриальной ДНК (рис. 1). PGC-1a также может индуцировать экспрессию фактора роста сосудистого эндотелия, А (VEGFA) независимо от индуцируемого гипоксией фактора (HIF) 1a [19, 20]. Результаты последних работ показывают, что в скелетной мышце ангиогенез может регулироваться через PGC-1a-зависимую активацию макрофагов [21].
Таким образом, можно заключить, что аэробные физические нагрузки вызывают в скелетной мышце выраженное увеличение экспрессии гена PGC-1a, активацию уже существующего в клетке белка PGC-1a и изменение его внутриклеточной локализации. PGC-1a оказывает комплексное влияние на экспрессию целого ряда ядерных и митохондриальных генов, действуя как один из основных регуляторов биогенеза митохондрий, углеводно-жирового обмена, а также ангиогенеза в скелетной мышце (рис. 1).
Регуляция экспрессии гена PGC-1a с канонического промотора
Более 10 лет назад Puigserver и соавт. впервые клонировали ген PGC-1a мыши [22]. Затем был охарактеризован ген PGC-1a человека, состоящий из 13 экзонов и кодирующий белок из 798 аминокислотных остатков с расчетной массой около 91 кДа. В про-моторной области этого гена найдены два основных сайта инициации транскрипции, расположенные на 90 и 119 п.н. выше инициаторного кодона ATG [23]. В дальнейшем регуляция экспрессии с этого промотора (канонического, или проксимального) была изучена достаточно подробно (рис. 1).
Канонический промотор гена PGC-1a содержит два консервативных участка связывания с фактором транскрипции MEF2 (стимулирующий фак-
МЫШЕЧНАЯ АКТИВНОСТЬ
Рис. 1. Модель активации PGC-1a и регуляции экспрессии его гена с канонического и проксимального промотора. AMPK — AMP-активируемая протеинкиназа, ATF — активирующий транскрипционный фактор, CaMK — Са2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа, CREB — cAMP-чувствительный транскрипционный фактор, ERR — рецептор, родственный рецептору эстрогена, HDAC — деацетилаза гистонов класса IIa, MEF — стимулирующий фактор миоцитов, NRF — ядерный респираторный фактор, OXPHOS — гены, кодирующие белки, участвующие в реакциях окисления и фосфорилирования, p38 MAPK — митоген-активируемая протеинкиназа p38, PGC — коактиватор PPAR-гамма, PKA — протеинкиназа A, PPAR — рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом, SIRT1 — NAD-зависимая деацетилаза sirtuin-1, TFAM — митохондриальный транскрипционный фактор А, TFB1M — митохондриальный транскрипционный фактор В1, TFB2M — митохондриальный транскрипционный фактор В2, VEGFA — эндотелиальный фактор роста сосудов A, P2AR — Р2-адренорецептор
тор миоцитов 2) и CRE-участок связывания с CREB (сАМР-чувствительный фактор транскрипции) [23]. Результаты опытов на культуре клеток и на мышах [12, 24], а также на скелетных мышцах мышей in vivo [25] подтвердили, что факторы MEF2 и CREB важны для активации транскрипции гена PGC-1a.
Активированный белок PGC-1a может коакти-вировать MEF2, увеличивая тем самым экспрессию своего гена [11, 12]. Однократная велоэргометри-ческая нагрузка повышает содержание фосфори-лированной p38 MAPKThr180/Tyr182 в ядрах скелетной мышцы человека, а также его комплекса с MEF2 [11], что, по-видимому, активирует MEF2. Активность MEF2 ингибируется гистондеацетилазами класса IIa (HDAC) [26] и связана, главным образом, с HDAC5 [25]. Аэробные упражнения увеличивают содержание фосфорилированного HDAC5, что приводит к разрушению комплекса MEF2-HDAC5 и экспорту HDAC5 из ядра [11, 27]. Вызванное упражнениями фосфорилирование HDAC регулируется киназами CAMKII и AMPK [27], реагирующими на изменение внутримышечного содержания АМР и ионов кальция [28, 29], а активация CAMKII и AMPK положительно
связана с интенсивностью аэробных упражнений [4, 30−34].
Семейство факторов транскрипции CRE включает CREB и активирующий транскрипцию фактор (ATF)-2. Фосфорилирование CREBSeг133 и его последующая активация регулируются многими сигнальными киназами, в том числе САМК11 и АМРК [35,
36]. Вызванная однократной нагрузкой активация САМК11 и АМРК увеличивает уровень фосфорилирования фактора CREBSeг133, влияя тем самым на экспрессию с канонического промотора гена PGC-1a [4,
37], причем уровень фосфорилирования CREBSeг133 в позднем периоде восстановления зависит от интенсивности нагрузки [4].
Индуцируемая стрессом киназа р38 МАРК повышает экспрессию гена PGC-1a, фосфорилируя ATF-2Thг71 и активируя его [37−39]. На вызванную нагрузкой активацию р38 МАРК влияет множество факторов, включая кальций и активные формы кислорода [37, 39]. Аэробные упражнения независимо от их интенсивности повышают уровень фосфорили-рования р38 МАРК™80/Туг182 [4]. Более того, активация р38 МАРК™80/Туг182 может определяться систем-
ными факторами: уровень фосфорилирования p38 MAPK Thr18°/Tyr182 возрастает после аэробных упражнений даже в неактивных мышцах [40]. Тем не менее уровень фосфорилирования ATF-2Thr71 зависит от интенсивности аэробной нагрузки. Это может косвенно свидетельствовать о том, что вызванное нагрузкой фосфорилирование ATF-2Thr71 регулируется другими сигнальными путями [4].
Активация различных сигнальных киназ и их мишеней, HDAC, MEF2, ATF-2 и CREB, под действием упражнений усиливает транскрипционную активность промотора PGC-1a. При этом экспрессия гена PGC-1a линейно зависит от интенсивности аэробной нагрузки в диапазоне от умеренной до максимальной [4, 41−43].
Регуляция экспрессии изоформ PGC-1a с альтернативного промотора
Несколько лет назад две группы исследователей практически одновременно обнаружили в гене PGC-1a альтернативный промотор, активный в скелетной мышце человека, расположенный на 14 т.п.н. выше канонического (проксимального) промотора (рис. 2A) [2, 44]. В последующем в нервной ткани человека был описан еще один тканеспецифиче-ский альтернативный промотор, расположенный на 587 т.п.н. выше канонического, транскрипция с которого приводит к образованию нескольких изоформ PGC-1a [45]. Этот промотор не обладал выраженной активностью в скелетной мышце. Следует заметить, что тканеспецифичные изоформы PGC-1a найдены в печени (L-PGC-1a) [46]. Ниже будут рассмотрены особенности регуляции синтеза изоформ PGC-1a, главным образом, в скелетной мышце.
Влияние активации Р-адренорецепторов на экспрессию гена PGC-1a изучали с использованием Р2-агониста кленбутерола, и обнаружили выраженное увеличение экспрессии в скелетных мышцах мышей, тогда как у животных с нокаутом Р1-, Р2- и Р3-адренорецепторов подобный эффект отсутствовал. Показано, что Р2-блокаторы пропранолол и ICI 118 551 снижают увеличение экспрессии гена PGC-1a в скелетных мышцах после 45-минутной беговой нагрузки (15 м/мин) [47]. Эти результаты позволили предположить, что экспрессия PGC-1a, по крайней мере частично, регулируется через активацию Р-адренорецепторов. Одновременно обнаружили, что в скелетной мышце экспрессируются различные изоформы мРНК PGC-1a [2].
Установлено [2, 20, 44], что с альтернативного промотора, расположенного примерно на 14 т.п.н. выше канонического, с которого транскрибируется первый экзон (1a) в канонической изоформе, экспрессиру-ются новые транскрипты. В результате альтерна-
тивного сплайсинга продуктов, транскрибируемых с альтернативного промотора, образуются два варианта первого экзона: 1Ь и 1с. Эти транскрипты были названы PGC-1a-b и PGC-1a-c, а каноническая изо-форма обозначена как PGC-1a-а. Начиная со второго экзона, нуклеотидная последовательность всех трех изоформ была одинаковой. Аминокислотная последовательность, кодируемая первым экзоном, у изоформ PGC-1a-b и PGC-1a-c отличалась и была короче, чем у канонического варианта на 4 и 13 аминокислотных остатков соответственно (рис. 2А). В покое в скелетных мышцах мышей [2, 20, 48] и человека [49−51] содержание мРНК изоформ, экспрессирую-щихся с альтернативного промотора, много меньше, чем транскрибируемых с канонического промотора. Однако опубликованы также данные, согласно которым в скелетных мышцах мыши в покое мРНК PGC-1a-a, PGC-1a-Ъ и PGC-1a-c экспрессируются на сопоставимом уровне [52].
Новые изоформы оказались функционально активными. Для измерения активности изоформ культуру клеток НЕК 293 трансфицировали плаз-мидами, экспрессирующими различные рецепторы PPAR (а, б и у) и изоформы PGC-1a. Оказалось, что белки PGC-1a-b и PGC-1а-c активируют рецепторы так же, как PGC-1a-а [2]. Физиологическая значимость экспрессии с альтернативного промотора подтверждена в опытах на трансгенных мышах. Сверхэкспрессия PGC-1а-b и PGC-1а-c в скелетных мышцах трансгенных мышей привела к увеличению экспрессии генов, регулирующих биогенез митохондрий и жировой обмен [2]. В скелетных мышцах мышей, сверхэкспрессирующих PGC-1а-b, наблюдали также выраженное увеличение экспрессии генов-мишеней PGC-1a: цитохромоксидазы (СОХ) 2 и 4, генов-регуляторов жирового обмена (CD36, MCAD, СРТ1 и др.), гена фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) А, а также увеличение активности цитрат-синтазы (CS) — маркера митохондриальной плотности в ткани, и увеличение капиллярной плотности. Во время бега с возрастающей скоростью на бегущей дорожке трансгенные животные проявили большую работоспособность, большую максимальную скорость потребления кислорода С^о2), у них менее заметно выросло содержание лактата в крови. При этом доля окисляемых жиров у них была больше, чем у животных дикого типа [53].
Удалось выявить функциональные особенности разных изоформ PGC-1a. Так произвольный бег в беговом колесе [20] и бег умеренной интенсивности (15 м/мин, 45 мин) на бегущей дорожке [2] привели к выраженному увеличению экспрессии в скелетных мышцах мышей мРНК PGC-1a-Ъ и PGC-1a-c, экспрессия мРНК PGC-1a-a при этом не возросла.
Увеличение скорости бега до 20 и 30 м/мин привело к росту экспрессии мРНК PGC-la-Ъ в 20 и 33 раза соответственно [48]. Любопытно, что увеличение нагрузки лишь несколько увеличило (в 1.4 и 1.8 раза соответственно) содержание мРНК PGC-1a-a, транскрибируемой с канонического промотора. При этом после нагрузки уровень мРНК PGC-la-Ъ стал выше, чем PGC-la-a. Сходным было соотношение между мРНК PGC-la-Ъ и PGC-la-a в мышцах людей после аэробной нагрузки умеренной интенсивности длительностью 45−90 мин [49, 50]. В других тканях с высоким уровнем метаболической активности, как и в мышцах, наблюдались различия в экспрессии изоформ PGC-1a при воздействии различных физиологических стимулов. Например, в печени мышей после 21-часового голодания выраженно возрастала экспрессия только мРНК PGC-la-a. В буром жире мышей, выдержанных в течение нескольких часов при 4оС, увеличилась экспрессия только мРНК PGC-la-Ъ и PGC-la-c [2, 54].
Приведенные результаты позволили предположить, что в скелетных мышцах экспрессия с альтернативного промотора гена PGC-la регулируется через активацию в2-адренорецепторов [2, 20]. Это предположение было подтверждено в опытах с кленбутеролом, инъекции которого на несколько порядков увеличивали содержание в скелетных мышцах мышей мРНК PGC-la-Ъ и PGC-la-c (PGC-la-2 и PGC-la-3 в [20]), содержание мРНК PGC-la-a (PGC-la-l в [20]) при этом не менялось. Напротив, пропранолол и селективный ингибитор в2-адренорецепторов ICI 118 551 подавляли вызванное аэробной нагрузкой увеличение транскрипции мРНК изоформ PGC-1a с альтернативного промотора. С другой стороны, фармакологическая активация AMPK должна была привести к специфическому увеличению экспрессии PGC-la-a с канонического промотора. AMPK активировали с помощью 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-Р-0-рибофуранозил-5'--монофосфата (AICAR) [48]. Однако инъекция AICAR стимулировала в скелетных мышцах экспрессию гена PGC-la не только с канонического (примерно на 50%), но и с альтернативного (примерно на порядок) промоторов. По-видимому, это было связано с увеличением содержания адреналина (примерно на порядок) и но-радреналина (примерно на 30%) в крови и стимуляцией мышечных в 2-адренорецепторов под действием AICAR. С целью исключения системного влияния изолированную мышцу крысы инкубировали в AICAR, что вызвало увеличение экспрессии мРНК PGC-la-a (примерно на 50%) без изменения содержания мРНК PGC-la-Ъ. Это хорошо согласуется с более ранними результатами,
согласно которым AICAR не усиливает экспрессию с альтернативного промотора гена PGC-1a в миобла-стах С2С12 [44]. Напротив, форсколин — активатор аденилатциклазы, стимулирует экспрессию только с альтернативного промотора. Кроме того, добавление ионофора кальция и сверхэкспрессия главных участников кальциевой сигнализации — CaMKIV и фосфатазы кальцинейрина A, а также киназы p38 MAPK (MKK6) — приводит к увеличению экспрессии гена PGC-1a с альтернативного промотора. Трансфекция миобластов плазмидами, содержащими фрагмент альтернативного промотора (дикого типа либо мутантный), показала, что активация альтернативного промотора зависит от связывания CREB с CRE-участком. Сходные результаты получены при трансфекции m. tibialis anterior у мышей [20]. Как уже говорилось, CRE-связывающий сайт содержится не только в альтернативном промоторе, но и в каноническом. На сегодняшний день не ясно, почему фосфорилирование CREB при активации ?2-адренорецепторов приводит к увеличению экспрессии преимущественно с альтернативного промотора [48]. Канонический промотор PGC-1a содержит характерную для CRE-сайта палиндромную последовательность TGACGTCA, тогда как в альтернативном промоторе CRE-сайт не является полностью палиндромным из-за замены одного нуклеотида. Такой вариант CRE-участка способен связываться с CREB и необходим для транскрипции с альтернативного промотора. При этом сродство CREB к CRE-участку, содержащему замену, ниже, чем к палиндромной последовательности CRE-сайта в каноническом промоторе [44, 48].
Можно предположить, что в покое для обеспечения высокого (почти максимального) уровня экспрессии с канонического промотора гена PGC-1a достаточно небольшой концентрации фосфорилированного CREB- при значительном повышении концентрации этого белка транскрипция с канонического промотора несколько возрастает. Для существенного увеличения экспрессии с альтернативного промотора необходимо высокое содержание фосфорилированного CREB. Следовательно, альтернативный промотор может оказаться намного чувствительнее к изменению концентрации фосфорилированного CREB, что объясняет различия в регуляции транскрипции с двух промоторов в покое и после мышечной активности. Не исключена возможность регуляции транскрипции с альтернативного промотора другими факторами транскрипции, родственными CREB. Также показано, что специфические мышечные факторы MyoD и MRF4 могут трансактивировать альтернативный промотор, взаимодействуя с проксимальным мотивом E-box [44].
Таким образом, на основании экспериментов, проведенных на мышцах грызунов, предложена модель регуляции экспрессии изоформ PGC-1a в скелетных мышцах при аэробных упражнениях [20, 48]. Низкоинтенсивные аэробные нагрузки не вызывают активации АМРК, но стимулируют симпатическую нервную систему. Это приводит к активации Р2-адренорецепторов и протеинкиназы А, увеличению содержания сАМР и фосфорилирования CREBSeг133 (рис. 1). Возможность регуляции экспрессии гена PGC-1a без участия АМРК хорошо согласуется с тем, что при аэробных упражнениях умеренной интенсивности в мышцах людей не увеличивается уровень фосфорилирования АМРК™72 и экспрессии с канонического промотора, но при этом существенно возрастает экспрессия с альтернативного промотора [49, 50].
При интенсивности аэробных упражнений более 50−60% от Уо2тах в скелетных мышцах активируется АМРК [30, 31] и одновременно продолжает расти активность симпатической нервной системы. Последнее приводит к усилению активности Р2-адренорецепторов и дополнительной стимуляции экспрессии с альтернативного промотора гена PGC-1а. С другой стороны, активация АМРК приводит к инициации экспрессии с канонического промотора, что, по-видимому, происходит только при достаточно интенсивных аэробных физических нагрузках, вызывающих в мышцах выраженные метаболические изменения.
Необходимо отметить, что до сих пор не сформировано однозначное мнение о системе регуляции экспрессии гена PGC-1а в скелетных мышцах. Некоторые работы ставят под сомнение описанную выше модель. Определение уровня мРНК и белка PGC-1a в тканях крысы через 6 и 18 ч после инъекций кленбутерола или норадреналина [55] выявило заметное повышение этих показателей в бурой жировой ткани, но не в скелетных мышцах. Кленбутерол вызвал увеличение фосфорилирования CREBSeг133 в мышце, однако активность промотора гена PGC-1 а при этом не изменилась. Эти данные рассматриваются как аргумент против описанной модели. Отсутствие увеличения экспрессии мРНК PGC-1а в мышце обусловлено, по-видимому, использованием праймеров для экзонов 1а (прямой) и 2 (обратный), которые определяли экспрессию только с канонического промотора. Использованная для определения люциферазной активности плазмида содержала, очевидно, фрагмент канонического промотора PGC-1 а, что объясняет отсутствие повышения активности этого промотора в ответ на кленбутерол. Однако эти рассуждения не объясняют отсутствий в изменении уровня белка PGC-1a в скелетной мышце, поскольку
использовали антитела, которые должны были выявлять белковые продукты транскрипции с обоих промоторов.
Изучение эффектов AICAR и норадреналина на миобласты, выращенные из биоптатов скелетной мышцы человека, показало [49], что норадреналин вызывает увеличение экспрессии только мРНК PGC-1а-Ъ, что полностью согласуется с представленной выше моделью. Однако AICAR усиливает экспрессию не только с канонического промотора (мРНК PGC-1a-a), но и с альтернативного (мРНК PGC-la-Ъ), причем совместное использование AICAR и норадре-налина оказывало аддитивный эффект на экспрессию с альтернативного промотора. Сделан вывод, что AMPK является наиболее важным регулятором гена PGC-1a и может регулировать экспрессию с обоих промоторов. Возможность AMPK регулировать экспрессию гена PGC-1a с обеих промоторов недавно была показана в скелетных мышцах мышей [62]. Помимо этого, стоит упомянуть о возможности активации p38 MAPK с помощью адреналина [56], что теоретически способно влиять на регуляцию экспрессии гена PGC-1a с канонического промотора.
Таким образом, физические нагрузки различной интенсивности могут усиливать экспрессию PGC-1a с разных промоторов. В упомянутых выше работах подразумевалось, что экспрессируются полноразмерные изоформы, содержащие 13 экзо-нов. Впоследствии было показано, что в результате альтернативного сплайсинга могут образоваться мРНК, содержащие стоп-кодон после экзона 6, которые кодируют укороченные варианты белка PGC-1a. В большинстве рассмотренных работ использовали прямой праймер к одному из вариантов первого эк-зона (1a, 1b и 1c) и обратный — ко второму экзону, общему для всех изоформ, а на иммуноблоте оценивали изменение содержания только белка с мол. массой более 90 кДа, что соответствует полноразмерному белку. По-видимому, часть транскриптов PGC-1a в описанных работах кодировала полноразмерный белок, а часть — укороченный. Ниже будет показано, что эти два белка действительно имеют различные характеристики и функции, что вполне ожидаемо, поскольку в укороченном белке отсутствуют многие активные сайты, представленные в полноразмерном белке.
Не ясно, все ли мРНК PGC-1a могут транслироваться in vivo и есть ли различия в функциях продуктов трансляции. Получаемые изоформы белков должны отличаться лишь несколькими первыми аминокислотными остатками. Маловероятно, что эти отличия могут сильно повлиять на функциональные свойства полноразмерных или укороченных изоформ. Часто N-концевой фрагмент белка содер-
жит сигнальные последовательности, отвечающие за транспорт внутри клетки. По нашим неопубликованным данным изоформы PGC-1a не содержат типичных сигналов, регулирующих транспорт в ядро или в митохондрии. Отсутствие известных сигналов не исключает особенностей внутриклеточного распределения разных изоформ PGC-1a, но, по-видимому, эти различия несущественны. Важно отметить, что наличие разных промоторов свидетельствует о том, что экспрессия гена PGC-1a может регулироваться различными сигнальными путями, которые активируются разными физиологическими стимулами.
Укороченные изоформы PGC-1a
Исследуя адаптационный ответ скелетных мышц крыс на аэробные упражнения, Baar и соавт. [57] обнаружили на иммуноблоте помимо полноразмерного белка PGC-1a полосу, соответствующую белку ~34 кДа, что интерпретировали как присутствие укороченной изоформы PGC-1a. Впоследствии Zhang и соавт. [37] выявили в бурой жировой ткани мышей укороченную (N-truncated) NT-изоформу PGC-1a, которая образуется в результате альтернативного сплайсинга между экзонами 6 и 7 и содержит короткую вставку — экзон 7а с преждевременным стоп-кодоном (рис. 2B). Белок NT-PGC-1a детектируется на иммуноблоте в области 35−38 кДа, а в базе данных NCBI представлены мРНК человека (AB061325) и мыши (AB061324) [3], кодирующие белки из 271 и 270 аминокислотных остатков соответственно. Изоформа NT-PGC-1a теоретически может транскрибироваться как с проксимального (1a), так и с альтернативного (1b и 1c) промоторов [54], чем, по-видимому, объясняется присутствие нескольких полос на иммуноблоте в области 35−38 кДа [3]. Изоформы белка NT-PGC-1a обнаружены в головном мозге мышей, почках и сердечной мышце человека. При этом содержание мРНК и белка укороченных изоформ и полноразмерного PGC-1a было сопоставимым [3]. Позднее было показано, что в скелетных мышцах человека также экспрессируется мРНК NT-изоформ [52], составляющая значительную часть мРНК PGC-1a [50, 51].
NT-изоформы сохранили два необходимых домена PGC-1a: N-концевой, который рекрутирует SRC-1 и CREB-связывающий белок, и два LXXLL-подобных мотива, обеспечивающих взаимодействие с ядерными рецепторами. Сохранились некоторые сайты, фосфорилируемые p38 MAPK, PKA и AMPK. В то же время в NT-изоформах отсутствует С-концевой фрагмент, содержащий последовательность, регулирующую транспорт в ядро, лиганд-независимый PPARy-связывающий регион,
SR-богатый и RRM-домены, а также FOXO1, MEFC2 и TRAP220, С-концевой домен, регулирующий стабильность белка, и множество сайтов, участвующих в посттрансляционной модификации и регуляции белка (сайты фосфорилирования GSK-3?, AMPK, Akt, p38 MAPK, PKA, метилирования аргинина и ацетилирования лизина) [3, 58, 59]. Столь выраженные отличия от полноразмерных изоформ определяют уникальные свойства NT-изоформ.
Внутриклеточная локализация и стабильность
Молекулярные механизмы, регулирующие стабильность белка PGC-1a и его внутриклеточную локализацию, изучали еще до открытия NT-изоформ [60]. С этой целью в культуре кардиомиоцитов и в клетках COS-7 экспрессировали мутантные белки PGC-1а, у которых отсутствовали различные С-концевые фрагменты. Оказалось, что полноразмерный PGC-1а (аминокислотные остатки 1−797) — это коротко-живущий белок, локализованный преимущественно в ядре, тогда как укороченный белок (1−565) находится как в ядре, так и в цитоплазме, а мутантный белок, состоящий из 292 аминокислотных остатков, — преимущественно в цитоплазме. Удаление С-концевого фрагмента привело к выраженному увеличению стабильности белка PGC-1a. По-видимому, это связано со снижением уровня его убиквитиниро-вания [60, 61]. Результаты этих экспериментов хорошо соотносятся со свойствами открытых впоследствии NT-изоформ PGC-1a. Отсутствие С-концевого фрагмента делает NT-изоформы более устойчивыми к деградации по сравнению с полноразмерными PGC-1a [3, 58].
На клеточной линии CHO-K1 [3, 58], а позже на мышечных волокнах мыши [59] с помощью конфокальной микроскопии было показано, что NT-изоформы, в отличие от полноразмерных изоформ PGC-1a, локализованы преимущественно в цитоплазме (~90%). С помощью трансфекции различных NT-изоформ в клетки CHO-K1 установлено, что ци-топлазматическая локализация характерна для всех укороченных изоформ, синтезируемых как с канонического (NT-PGC-1a-a), так и с альтернативного промотора (NT-PGC-1a-b и NT-PGC-1a-c) [54]. Это свидетельствует о том, что локализация изоформ PGC-1a зависит прежде всего от С-концевого фрагмента, а не от N-концевой последовательности.
Локализация NT-изоформ в клетке регулируется различными белками. На мышечных волокнах [59] и на клетках CHO-K1 [58] показано, что лептомицин Б — специфический ингибитор экспортина 1 — белка, регулирующего ядерный экспорт, вызывает увеличение содержания NT-PGC-1a в ядре. По-видимому, низкое содержание NT-PGC-1a в ядре связано
А Экзон 1 Экзон2
PGC-1a-а М, А W D М С Б Q D Б V W Б D I Е С, А А Ь V G Е…
PGC-1а-b М L G L Б Б М D Б I L К С, А А Ь V G Е…
PGC-1а-c М L 1_ С, А А Ь V G Е…
PGC-1a-a PGC-1a-b PGC-1a-c NT-PGC-1a-a
NT-PGC-1а-c
1а 2
1а 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
-1МЦ-
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
-ЙККИМ^
67 89 10 11 12 13 6 7 8 9 10 11 12 13
3 4 5
3 4 5
6 7а*-7 8 9 10 1112 13
-
3 4 5 6 7а*-7 8 9 10 11 12 13
Экзон6 Экзон7
PGC-1а, …Т С, А С СА АА Т GAC С С С …
«.Б Р N D Р…
Экзон 6 Экзон 7а Экзон 7
…Т С, А С С, А АА Т Т Т G Т Т Т Т ТА Т АА АТ G Т GC САТ АТС ТТ С CAG Т GA ССС…
… S Р N L F L стоп
В
Рис. 2. А — различные изоформы PGC-1a мыши экспрессируются с канонического (PGC-1a-а) и альтернативного промотора (PGC-1a-b и PGC-1a-c) и кодируют разные аминокислотные последовательности в первом экзоне. Б — расположение экзонов (вертикальные линии) у различных изоформ PGC-1 а на геномной ДНК. Звездочкой обозначен стоп-кодон. В — нуклеотидная и аминокислотная последовательности между 6 и 7 экзонами полноразмерных (PGC-1a) и укороченных (NT-PGC-1а) изоформ
с тем, что скорость экспортин 1-зависимого экспорта из ядра превышает скорость диффузии в ядро [58]. Не исключена также возможность экспортин 1-независимого ядерного экспорта [59]. Активация опосредованной сАМР сигнализации увеличивает представленность NT-PGC-1a в ядерной фракции как мышечных волокон [59], так и клеток бурого жира [3]. Это предположительно связано с тем, что фосфорилирование NT-PGC-1a в положении 194, 241 и 256 с помощью РКА снижает экспортин 1-зависимый ядерный экспорт [58]. С другой стороны, по-видимому, существует р38 МАРК-зависимый механизм регуляции внутриклеточной локализации NT-PGC-1a. В клетках бурой жировой ткани увеличение содержания NT-PGC-1a в ядре, вызванное введением аналога сАМР (8-СРТ-сАМР), снижается при ингибировании р38 МАРК [3]. Однако следует
отметить, что ингибирование р38 МАРК приводило лишь к небольшому снижению прироста ядерной фракции NT-PGC-1a, тогда как ингибирование РКА полностью подавляло этот прирост. Это свидетельствует о ведущей роли Р-адренорецепции в регуляции внутриклеточной локализации NT-PGC-1a и согласуется с данными, согласно которым в культуре мышечных волокон ни AICAR-зависимая активация АМРК, ни вызванная электрической стимуляцией активация р38 МАРК не вызывают увеличения содержания NT-PGC-1а в ядре [59].
Регуляция экспрессии мРНК NT-изоформ
NT-изоформы образуются в результате трансляции мРНК PGC-1a, содержащей вставку со стоп-кодоном в рамке считывания, между экзонами 6 и 7. Экспрессия NT-изоформ может динамично регу-
лироваться под влиянием различных физиологических факторов. Например, аэробная физическая нагрузка приводит к сопоставимому увеличению экспрессии полноразмерных и NT-изоформ мРНК PGC-1a в мышцах мышей [62] и человека [50, 51]. При этом NT-изоформы могут экспрессироваться как с канонического, так и с альтернативного промотора [51, 62], а уровень их экспрессии, как и у полноразмерных изоформ, зависит от интенсивности нагрузки [62].
Можно предположить, что увеличение экспрессии как укороченных, так и полноразмерных изо-форм мРНК PGC-1a связано с активацией AMPK и Р-адренорецепции, а регуляторные механизмы, описанные для полноразмерных изоформ, справедливы для NT-изоформ. Действительно, в стимулированных AICAR мышечных миотубах возрастают уровни мРНК укороченных и полноразмерных изо-форм PGC-1a [51]. Инъекции как AICAR, так и клен-бутерола вызывают сопоставимое относительное увеличение экспрессии полноразмерных и укороченных изоформ в мышцах мыши [62]. С другой стороны, холодовая экспозиция (5 ч, 4оС) приводит к увеличению экспрессии мРНК NT-PGC-1a и полноразмерной PGC-1a (на ~15%) и их белков в буром жире мыши [3]. При этом при нормальной температуре (22оС) экспрессия происходит преимущественно с канонического промотора (мРНК NT-PGC-1a-a и PGC-1a-a). Холодовая экспозиция увеличивает преимущественно экспрессию с альтернативного промотора (мРНК NT-PGC-1a-b, NT-PGC-1a-c, PGC-1a-b и PGC-1a-c), что связано с активацией Р-адренорецепции [3, 54].
Недавно Thom и соавт. [63] показали, что сплайсинг мРНК PGC-1a между экзонами 6 и 7 может инициироваться гипоксией. Так, в культуре миоцитов скелетной мышцы, а также в миоцитах c подавленной активностью HIF-1 и -2 гипоксия (0. 5% O2, 16 ч) вызывала увеличение экспрессии только NT-изоформ. Это означает, что гипоксия индуцирует сплайсинг мРНК PGC-1a независимо от сигнальных путей HIF.
Таким образом, регуляция экспрессии гена PGC-1a с разных промоторов и регуляция сплайсинга — это независимые процессы. В заключение следует отметить, что до сих пор не ясно, все ли NT-изоформы могут транслироваться in vivo и существуют ли функциональные различия между этими изоформами.
Функциональная роль NT-изоформ
С помощью различных экспериментальных подходов in vitro было убедительно показано, что белок NT-PGC-1a обладает функциональной активностью, т. е. способен коактивировать различные ядерные рецепторы: PPARa и PPARy в СНО-К1-клетках
[3] и PPARa, PPARy и ERRa в клетках COS-1 [54]. Гиперэкспрессия NT-PGC-1a в клетках бурой жировой ткани (так же как и полноразмерных изоформ) увеличивает экспрессию мРНК UCP1 и CPT-1?, а также соотношение митохондриальной и ядерной ДНК, которое считается маркером активации биогенеза митохондрий [3].
Важно отметить, что функционально NT-изоформы PGC-1a значительно отличаются от полноразмерных изоформ. Экспрессия генов-мишеней PGC-1a и NT-PGC-1a может различаться. При сверхэкспрессии полноразмерного PGC-1a-a (PGC-1a-1 согласно [52]) в миотубах изменяется экспрессия 2002 генов, а тогда как NT-PGC-1a-b (PGC-1a-4, согласно [52]) влияет только на 519 генов. Причем одновременно эти изоформы влияют на экспрессию только 98 генов [52]. В адипоцитах бурой жировой ткани, экспрессирующих PGC-1a или NT-PGC-1a, наблюдается повышение экспрессии генов Cox7al и PPARa, однако увеличение экспрессии CPT-1?, UCP1, ERRa и Cox8b зависело только от NT-PGC-1a, а CytC — только от полноразмерного PGC-1a [58, 64].
Недавно появились данные, свидетельствующие о том, что в клетках скелетной мышцы NT-изоформы PGC-1a активируют преимущественно ангиогенез, тогда как полноразмерные изоформы влияют на биогенез митохондрий и ангиогенез [63]. Миотубы, полученные из миобластов PGC-1a-/-мыши, инфицировали аденовирусом, кодирующим NT-PGC-1a-a или PGC-1a-a. Это привело к сопоставимому повышению уровня мРНК этих изоформ. При этом уровень экспрессии генов-мишеней белка PGC-1a и их белковых продуктов был разным. В ми-отубах, экспрессирующих NT-PGC-1a-a, уровень мРНК генов-мишеней не изменился, а содержание митохондриальных белков, входящих в состав комплексов III и V, несколько повысилось, тогда как в клетках, экспрессирующих PGC-1a-a, эти показатели существенно выросли. Сходная картина обнаружена для скорости потребления кислорода клетками: увеличение этого показателя было найдено только после увеличения экспрессии PGC-1a-a. Напротив, NT-PGC-1a-a вызывал большее, чем PGC-1a-a, увеличение экспрессии гена VEGFA и активацию ангиогенеза. Эти результаты проверили в условиях in vivo с использованием трансгенных мышей со сверхэкспрессией одной из изо-форм NT-PGC-1a-b (PGC-1a4 в [63]) в скелетных мышцах. Экспрессия генов-регуляторов ангиогенеза (VEGFA, CD31, ANGPT2) у трансгенных животных была повышена по сравнению с контролем, они имели большую капиллярную плотность в m. tibialis anterior. Преимущественная активация ангиогенеза
NT-изоформами объясняется сохранностью в них мотива LXXLL, с помощью которого осуществляется взаимодействие с ERRa — одним из регуляторов экспрессии VEGFA [20, 63].
Получить животных с нокаутом NT-PGC-1a достаточно сложно, что не позволяет оценить влияние этой изоформы на фенотип и функции мышечной системы и целого организма. Тем не менее получены мыши [54, 65], у которых не экспрессируются полноразмерные изоформы PGC-1a, но синтезируется мутантный вариант, состоящий из первых 254 аминокислотных остатков. Этот белок всего лишь на несколько остатков короче нативного NT-PGC-1a и является его функциональным эквивалентом [54]. Показано [65], что у таких животных с нокаутом полноразмерной изоформы масса m. soleus — мышцы, состоящей преимущественно из волокон первого типа с высокими окислительными возможностями, была несколько меньше, чем у мышей дикого типа, а масса преимущественно гликолитической m. tibialis anterior осталась без изменений. Гистологический анализ не выявил заметных изменений в клетках скелетных мышц. Тем не менее в m. soleus (но не в m. tibialis anterior) объемная плотность митохондрий, базальная экспрессия генов-регуляторов биогенеза митохондрий, максимальная скорость стимулированного ADP дыхания митохондрий, а также время бега до отказа в тесте с возрастающей нагрузкой на бегущей дорожке и & quot-Уо2тах организмом у животных с нокаутом полноразмерной изоформы были значительно меньше, чем у животных дикого типа [65]. Любопытно, что у взрослых опытных животных экспозиция при 4оС вызывала снижение температуры тела, сопоставимое с контролем. По-видимому, это было связано с сохраненной способностью увеличивать экспрессию гена UCP1 в буром жире [54, 65, 66], регулируемой, возможно, по Twist-1-зависимому механизму. Показано, что фактор транскрипции Twist-1 — негативный регулятор полноразмерного PGC-1a, не влияет на активацию NT-PGC-1a [64].
Интересно сравнить результаты изучения мышей с нокаутом полноразмерного PGC-1a и мышей, у которых отсутствует активность белка PGC-1a (изменена нуклеотидная последовательность мРНК PGC-1a после экзона 2) во всем организме [67, 68] или только в скелетных мышцах [69, 70]. Размеры мышечных волокон, их состав и объемная плотность митохондрий у мышей с инактивированным PGC-1a остались такими же, как у животных дикого типа. Подобные результаты можно частично объяснить гиперактивностью, возникающей из-за выраженных нарушений в головном мозге этих мышей [67, 68]. С другой стороны, в скелетных мышцах животных с нокаутом была снижена доля окислительных во-
локон типа I как в преимущественно окислительных, так и в преимущественно гликолитических мышцах [69, 70]. При этом у всех опытных животных базаль-ная экспрессия генов-регуляторов биогенеза митохондрий была значительно ниже, чем у животных дикого типа как в смешанной (m. quadriceps femoris), так и в гликолитической (m. gastrocnemius) мышцах [67−70]. В отличие от мутантов, экспрессирую-щих укороченный PGC-1a, у животных с полным отсутствием активности белка PGC-1a снижалась температура тела при экспозиции на холоде [68], что можно объяснить подавлением экспрессии гена UCP1, регулируемой PGC-1a, в буром жире. Таким образом, сопоставляя результаты различных исследований, можно сделать вывод о существовании функциональных отличий между укороченными и полноразмерными изоформами PGC-1a.
До сих пор мы рассматривали влияние аэробных нагрузок на экспрессию изоформ PGC-1a. В большинстве работ использовали именно аэробные нагрузки, активирующие биогенез митохондрий и ан-гиогенез в скелетной мышце, поэтому взаимосвязь между PGC-1a и эффектами этих нагрузок представляется вполне логичной. Однако недавно Ruas и соавт. [52] показали, что одна из укороченных изоформ, NT-PGC-1a-b (PGC-1a4 согласно [52]), может регулировать миогенез. В миотубах, сверхэк-спрессирующих NT-PGC-1a-b, содержание мРНК IGF-1 и миогенных факторов Myf-5 и -6 было больше, а мРНК миостатина меньше, чем в контрольных клетках или клетках, сверхэкспрессирующих полноразмерный PGC-1a-a. В то же время увеличение экспрессии генов-регуляторов биогенеза митохондрий в этих миотубах было значительно менее выражено, чем в миотубах со сверхэкспрессией полноразмерного PGC-1a-a. Обнаружено, что NT-изоформа белка PGC-1a, как и его полноразмерный вариант, локализуется преимущественно в ядре, что не согласуется с полученными ранее результатами [58, 59]. Введение в скелетную мышцу мыши аденовирусного и плазмидного векторов, несущих NT-PGC-la-Ъ, привело к выраженному увеличению площади поперечного сечения мышечных волокон, а также массы мышц по сравнению с контролем. Любопытно отметить, что в случае электропора-ции скелетной мышцы плазмидами, кодирующими NT-PGC-1a-a, которая экспрессируется с канонического промотора, укороченный белок не был получен (несмотря на увеличение содержания мРНК). Сделан вывод, что N-концевая последовательность NT-PGC-1a-b обеспечивает накопление этого белка в клетке, тогда как NT-PGC-1a-a такой особенностью не обладает [52]. Этот вывод не согласуется с результатами работы, согласно которой в миоту-
бах, инфицированных аденовирусом, кодирующим NT-PGC-1a-a, повышено содержание укороченной изоформы белка [63]. Физиологические эффекты NT-PGC-1a-b изучали с использованием трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих эту изоформу. У трансгенных животных наблюдалось небольшое увеличение экспрессии мРНК VEGFA, EERa и мио-глобина, снижение экспрессии миостатина и отсутствие изменений в экспрессии мРНК IGF и генов, регулирующих биогенез митохондрий, по сравнению с контролем [52, 63]. При этом площадь поперечного сечения мышечных волокон, масса мышц, мышечная сила и время бега до отказа в тесте на бегущей дороге были несколько больше, чем у контрольных животных [52]. В этой работе не изучали влияние однократной нагрузки на изменение экспрессии мРНК NT-PGC-1a-b, но было показано, что базальный уровень экспрессии этого транскрипта в скелетных мышцах людей увеличивается после 8 недель силовых тренировок и не изменяется после 8 недель аэробных тренировок [52]. Следует отметить, что в этом исследовании для детекции NT-PGC-1a-b использовали праймеры, комплементарные экзонам 5 и 7а, которые могут выявлять не только NT-PGC-1a-b, но и NT-PGC-1a-a. Недавно показали, что однократные силовые упражнения, так же как и аэробные, увеличивают экспрессию обеих этих изоформ в скелетных мышцах человека [51], поэтому нет уверенности, что длительная силовая тренировка в исследовании Ruas и соавт. [52] привела к увеличению базальной экспрессии NT-PGC-1a-b, а не NT-PGC-1a-a.
Влияние изоформ PGC-1a на гипертрофию скелетных мышц оценивали на модели с удалением мышц-синергистов [71]. В гипертрофированных мышцах отмечено увеличение абсолютного уровня фосфорилирования мишеней mTORCl, экспрессии мРНК IGF-1 и снижение экспрессии мРНК мио-статина. При этом в гипертрофированных мышцах экспрессия изоформ PGC-1a с альтернативного (PGC-1a-b и NT-PGC-1a-b, праймеры к экзонам 1b и 2) и канонического (PGC-1a-a и NT-PGC-1a-a, праймеры к экзонам 1a и 2) промоторов оказалась сниженной, так же как содержание и активность ключевых митохондриальных белков и экспрессия генов-мишеней PGC-1a, регулирующих окислительные реакции и углеводно-жировой обмен. В скелетных мышцах мышей с нокаутом гена PGC-1a, как и у мышей дикого типа, в ответ на удаление синергистов наблюдалось сопоставимое увеличение объема мышц, абсолютного уровня фосфорилирования мишеней mTORCl, экспрессии мРНК IGF-1 и снижение экспрессии мРНК миостатина. Сделан вывод, что PGC-la не вовлечен в ремоде-лирование скелетной мышцы, вызванное хрониче-
ской нагрузкой. Этот вывод косвенно согласуется с тем, что в скелетных мышцах мышей экспрессия мРНК NT-PGC-1a-b регулируется теми же стимулами, что и полноразмерной изоформы PGC-1a-b, а именно, значительно возрастает при увеличении интенсивности аэробной нагрузки и при активации Р2-адренорецепторов с помощью кленбутерола [62]. Подводя итог сказанному, необходимо отметить, что механизмы регуляции синтеза белка в скелетной мышце различными изоформами PGC-1a не ясны и требуют дополнительных исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Белок-коактиватор PGC-1a является ключевым регулятором биогенеза митохондрий и углеводно-жирового обмена. Исследования in vitro и in vivo показывают, что в скелетных мышцах грызунов и человека могут экспрессироваться несколько изоформ мРНК PGC-1a, при этом паттерн их экспрессии может значительно изменяться после физических нагрузок. Это связано с тем, что в регуляции экспрессии с разных промоторов гена PGC-1a участвуют различные сигнальные каскады, активируемые разными физиологическими стимулами. По-видимому, экспрессия с канонического (проксимального) промотора регулируется, главным образом, через активацию AMPK, а с альтернативного — через Р2-адренорецепторы. Функциональные свойства белков, продуктов экспрессии с разных промоторов, скорее всего, не отличаются. Поэтому существование двух сигнальных путей, регулирующих экспрессию гена PGC-1a, предоставляет большие возможности для фармакологического воздействия на экспрессию этого гена. Это может иметь важное значение для лечения и профилактики различных заболеваний.
Все полноразмерные транскрипты, экспрессирую-щиеся как с канонического, так и с альтернативного промоторов, подвергаются сплайсингу. В результате этого синтезируются укороченные изоформы, свойства которых отличны от свойств полноразмерных изоформ. Укороченные изоформы значительно более устойчивы к деградации и преимущественно регулируют ангиогенез, тогда как полноразмерные изо-формы — преимущественно биогенез митохондрий. Опубликовано сообщение [52] о том, что укороченные изоформы, в отличие от полноразмерных, могут участвовать в регуляции миогенеза, но эти данные требуют дополнительной проверки. Можно заключить, что существование нескольких изоформ PGC-1а с широким спектром функциональных свойств расширяет способность организма адаптироваться к различным физиологическим воздействиям.
В регуляции экспрессии PGC-1a в скелетных мышцах человека остается много неясного. Изучение
особенностей регуляции экспрессии различных изо-форм и их функциональной роли может дать уникальную возможность целенаправленно влиять на экспрессию тех или иных изоформ с помощью физических упражнений и/или фармакологических средств. Такая возможность важна для больных
метаболическим синдромом, сахарным диабетом и, возможно, для спортсменов, тренирующих аэробные возможности. •
Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 14−15−768).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pedersen B.K., Febbraio M.A. // Nat. Rev. Endocrinol. 2012. V. 8. № 8. P. 457−465.
2. Miura S., Kai Y., Kamei Y., Ezaki O. // Endocrinology. 2008. V. 149. № 9. P. 4527−4533.
3. Zhang Y., Huypens P., Adamson A.W., Chang J.S., Henagan T.M., Boudreau A., Lenard N.R., Burk D., Klein J., Perwitz N., et al. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. № 47. P. 32 813−32 826.
4. Egan B., Carson B.P., Garcia-Roves P.M., Chibalin A.V., Sarsfield F.M., Barron N., McCaffrey N., Moyna N.M., Zierath J.R., O'-Gorman D.J. // J. Physiol. 2010. V. 588. № 10. P. 17 791 790.
5. Brenmoehl J., Hoeflich A. // Mitochondrion. 2013. V. 13. № 6. P. 755−761.
6. Wright D.C., Han D.H., Garcia-Roves P.M., Geiger P.C., Jones T.E., Holloszy J.O. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 1. P. 194−199.
7. Safdar A., Little J.P., Stokl A.J., Hettinga B.P., Akhtar M., Tarnopolsky M.A. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 12. P. 10 605−10 617.
8. Little J.P., Safdar A., Cermak N., Tarnopolsky M.A., Gibala M.J. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2010.
V. 298. № 4. P. R912-R917.
9. Little J.P., Safdar A., Bishop D., Tarnopolsky M.A., Gibala M.J. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2011. V. 300. № 6. P. R1303-R1310.
10. McGee S.L., Howlett K.F., Starkie R.L., Cameron-Smith D., Kemp B.E., Hargreaves M. // Diabetes. 2003. V. 52. № 4. P. 926−928.
11. McGee S.L., Hargreaves M. // Diabetes. 2004. V. 53. № 5. P. 1208−1214.
12. Handschin C., Rhee J., Lin J., Tarr P.T., Spiegelman B.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 12. P. 7111−7116.
13. Dumke C.L., Mark D.J., Angela M.E., Nieman D.C., Carmichael M.D., Quindry J.C., Travis T.N., Utter A.C., Gross Gowin S.J., Henson D.A., et al. // Eur. J. Appl. Physiol. 2009. V. 107. № 4. P. 419−427.
14. Olesen J., Kiilerich K., Pilegaard H. // Pflugers Arch. 2010. V. 460. № 1. P. 153−162.
15. Scarpulla R.C. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1147. P. 321 334.
16. Litonin D., Sologub M., Shi Y., Savkina M., Anikin M., Falkenberg M., Gustafsson C.M., Temiakov D. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 24. P. 18 129−18 133.
17. Smith B.K., Mukai K., Lally J.S., Maher A.C., Gurd B.J., Heigenhauser G.J., Spriet L.L., Holloway G.P. // J. Physiol. 2013. V. 591. № 6. P. 1551−1561.
18. Aquilano K., Vigilanza P., Baldelli S., Pagliei B., Rotilio G., Ciriolo M.R. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 28. P. 21 590−21 599.
19. Arany Z., Foo S.Y., Ma Y., Ruas J.L., Bommi-Reddy A., Girnun G., Cooper M., Laznik D., Chinsomboon J., Rangwala S.M., et al. // Nature. 2008. V. 451. № 7181. P. 1008−1012.
20. Chinsomboon J., Ruas J., Gupta R.K., Thom R., Shoag J., Rowe G.C., Sawada N., Raghuram S., Arany Z. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 50. P. 21 401−21 406.
21. Rowe G.C., Raghuram S., Jang C., Nagy J.A., Patten I.S., Goyal A., Chan M.C., Liu L.X., Jiang A., Spokes K.C., et al. // Circ. Res. 2014. V. 115. № 5. P. 504−517.
22. Puigserver P., Wu Z., Park C.W., Graves R., Wright M., Spiegelman B.M. // Cell. 1998. V. 92. № 6. P. 829−839.
23. Esterbauer H., Oberkofler H., Krempler F., Patsch W. // Genomics. 1999. V. 62. № 1. P. 98−102.
24. Czubryt M.P., McAnally J., Fishman G.I., Olson E.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 4. P. 1711−1716.
25. Akimoto T., Li P., Yan Z. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008. V. 295. № 1. P. C288-C292.
26. Lu J., McKinsey T.A., Nicol R.L., Olson E.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 8. P. 4070−4075.
27. McGee S.L., Fairlie E., Garnham A.P., Hargreaves M. // J. Physiol. 2009. V. 587. № 24. P. 5951−5958.
28. Hook S.S., Means A.R. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. V. 41. P. 471−505.
29. Corton J.M., Gillespie J.G., Hardie D.G. // Curr. Biol. 1994. V. 4. № 4. P. 315−324.
30. Chen Z.P., Stephens T.J., Murthy S., Canny B.J., Hargreaves M., Witters L.A., Kemp B.E., McConell G.K. // Diabetes. 2003. V. 52. № 9. P. 2205−2212.
31. Fujii N., Hayashi T., Hirshman M.F., Smith J.T., Habinowski S.A., Kaijser L., Mu J., Ljungqvist O., Birnbaum M.J., Witters L.A., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 273. № 3. P. 1150−1155.
32. Rose A.J., Kiens B., Richter E.A. // J. Physiol. 2006. V. 574. № 3. P. 889−903.
33. Sriwijitkamol A., Coletta D.K., Wajcberg E., Balbontin G.B., Reyna S.M., Barrientes J., Eagan P.A., Jenkinson C.P., Cer-sosimo E., DeFronzo R.A., et al. // Diabetes. 2007. V. 56. № 3. P. 836−848.
34. Rasmussen B.B., Winder W.W. // J. Appl. Physiol. 1997. V. 83. № 4. P. 1104−1109.
35. Shaywitz A.J., Greenberg M.E. // Annu. Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 821−861.
36. Thomson D.M., Herway S.T., Fillmore N., Kim H., Brown J.D., Barrow J.R., Winder W.W. // J. Appl. Physiol. 2008. V. 104. № 2. P. 429−438.
37. Zhang Y., Uguccioni G., Ljubicic V., Irrcher I., Iqbal S., Singh K., Ding S., Hood D.A. // Physiol. Rep. 2014. V. 2. e12008.
38. Akimoto T., Pohnert S.C., Li P., Zhang M., Gumbs C., Rosenberg P.B., Williams R.S., Yan Z. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 20. P. 19 587−19 593.
39. Wright D.C., Geiger P.C., Han D.H., Jones T.E., Holloszy J.O. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 26. P. 18 793−18 799.
40. Widegren U., Jiang X.J., Krook A., Chibalin A.V., Bjornholm M., Tally M., Roth R.A., Henriksson J., Wallberg-Henriksson H., Zierath J.R. // FASEB J. 1998. V. 12. № 13.
P. 1379−1389.
41. Nordsborg N.B., Lundby C., Leick L., Pilegaard H. // Med. Sci. Sports Exerc. 2010. V. 42. № 8. P. 1477−1484.
42. Popov D., Zinovkin R., Karger E., Tarasova O., Vinogradova O. // J. Sports Med. Phys. Fitness. 2014. V. 54. P. 362−369.
43. Edgett B.A., Foster W.S., Hankinson P.B., Simpson C.A., Little J.P., Graham R.B., Gurd B.J. // PLoS One. 2013. V. 8. № 8. e71623.
44. Yoshioka T., Inagaki K., Noguchi T., Sakai M., Ogawa W., Hosooka T., Iguchi H., Watanabe E., Matsuki Y., Hiramatsu R., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 381. № 4. P. 537−543.
45. Soyal S.M., Felder T.K., Auer S., Hahne P., Oberkofler H., Witting A., Paulmichl M., Landwehrmeyer G.B., Weydt P., Patsch W. // Hum. Mol. Genet. 2012. V. 21. № 15. P. 3461−3473.
46. Felder T.K., Soyal S.M., Oberkofler H., Hahne P., Auer S., Weiss R., Gadermaier G., Miller K., Krempler F., Esterbauer H., et al. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 50. P. 42 923−42 936.
47. Miura S., Kawanaka K., Kai Y., Tamura M., Goto M., Shiuchi T., Minokoshi Y., Ezaki O. // Endocrinology. 2007. V. 148. № 7.
P. 3441−3448.
48. Tadaishi M., Miura S., Kai Y., Kawasaki E., Koshinaka K., Kawanaka K., Nagata J., Oishi Y., Ezaki O. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2011. V. 300. № 2. P. E341-E349.
49. Norrbom J., Sallstedt E.K., Fischer H., Sundberg C.J., Rundqvist H., Gustafsson T. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2011. V. 301. № 6. P. E1092-E1098.
50. Popov D.V., Bachinin A.V., Lysenko E.A., Miller T.F., Vinogradova O.L. // J. Physiol. Sci. 2014. V. 64. № 5. P. 317−323.
51. Ydfors M., Fischer H., Mascher H., Blomstrand E., Norrbom J., Gustafsson T. // Physiol. Rep. 2013. V. 1. № 6. e00140.
52. Ruas J.L., White J.P., Rao R.R., Kleiner S., Brannan K.T., Harrison B.C., Greene N.P., Wu J., Estall J.L., Irving B.A., et al. // Cell. 2012. V. 151. № 6. P. 1319−1331.
53. Tadaishi M., Miura S., Kai Y., Kano Y., Oishi Y., Ezaki O. // PLoS One. 2011. V. 6. № 12. e28290.
54. Chang J.S., Fernand V., Zhang Y., Shin J., Jun H.J., Joshi Y., Gettys T.W. // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. № 12. P. 9100−9111.
55. Kim S.H., Asaka M., Higashida K., Takahashi Y., Holloszy J.O., Han D.H. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2013. V. 304. № 8. P. E844-E852.
56. Frier B.C., Wan Z., Williams D.B., Stefanson A.L., Wright D.C. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012. V. 302. № 12. P. C1772-C1779.
57. Baar K., Wende A.R., Jones T.E., Marison M., Nolte L.A., Chen M., Kelly D.P., Holloszy J.O. // FASEB J. 2002. V. 16. № 14. P. 1879−1886.
58. Chang J.S., Huypens P., Zhang Y., Black C., Kralli A., Gettys T.W. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 23. P. 18 039−18 050.
59. Shen T., Liu Y., Schneider M.F. // J. Biomed. Biotechnol. 2012. V. 2012. P. 989 263.
60. Sano M., Tokudome S., Shimizu N., Yoshikawa N., Ogawa C., Shirakawa K., Endo J., Katayama T., Yuasa S., Ieda M., et al. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 35. P. 25 970−25 980.
61. Olson B.L., Hock M.B., Ekholm-Reed S., Wohlschlegel J.A., Dev K.K., Kralli A., Reed S.I. // Genes Dev. 2008. V. 22. № 2. P. 252−264.
62. Wen X., Wu J., Chang J.S., Zhang P., Wang J., Zhang Y., Gettys T.W., ZhangY. // Biomed. Res. Int. 2014. V. 2014. e 402 175
63. Thom R., Rowe G.C., Jang C., Safdar A., Arany Z. // J. Biol. Chem. 2014. V. 289, P. 8810−8817.
64. Jun H.J., Gettys T.W., Chang J.S. // PPAR. Res. 2012. V. 2012. e320454.
65. Leone T.C., Lehman J.J., Finck B.N., Schaeffer P. J., Wende A.R., Boudina S., Courtois M., Wozniak D.F., Sambandam N., Bernal-Mizrachi C., et al. // PLoS Biol. 2005. V. 3. № 4. e101.
66. Jun H.J., Joshi Y., Patil Y., Noland R.C., Chang J.S. // Diabetes. 2014. V. 63. № 11. P. 3615−3625.
67. Arany Z., He H., Lin J., Hoyer K., Handschin C., Toka O., Ahmad F., Matsui T., Chin S., Wu P.H., et al. // Cell Metab. 2005. V. 1. № 4. P. 259−271.
68. Lin J., Wu P.H., Tarr P.T., Lindenberg K.S., St-Pierre J., Zhang C.Y., Mootha V.K., Jager S., Vianna C.R., Reznick R.M., et al. // Cell. 2004. V. 119. № 1. P. 121−135.
69. Handschin C., Choi C.S., Chin S., Kim S., Kawamori D., Kur-pad A.J., Neubauer N., Hu J., Mootha V.K., Kim Y.B., et al. // J. Clin. Invest. 2007. V. 117. № 11. P. 3463−3474.
70. Handschin C., Chin S., Li P., Liu F., Maratos-Flier E., LeBrasseur N.K., Yan Z., Spiegelman B.M. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 41. P. 30 014−30 021.
71. Perez-Schindler J., Summermatter S., Santos G., Zorzato F., Handschin C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 50. P. 20 314−20 319.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой