Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

добровольное согласие на участие в опыте на основе полной информированности о методе и ходе проведения процедуры.
Зарегистрированные ЛДФ-граммы подвергали цифровой полосовой фильтрации на основе алгоритмов, реализующих непрерывное, адаптивное вейвлет-преобразование [1]. Фильтрацию осуществляли в 5 неперекрывающихся частотных диапазонах, колебания в которых обусловлены известными физиологическими процессами: 0. 006−0. 17 Гц — диапазон эндотелиальной активности (Е) — 0. 18−0. 05 — диапазон нейрогенной активности (К) — 0. 05−0. 15 Гц — диапазон миогенной активности (М) — 0. 20.4 Гц — диапазон респираторного ритма (Я) — 0. 8−1.5 Гц — диапазон кардиоритма © [4,5,7]. В зависимости от локализации источника модуляций эти ритмы делят на ритмы активной и пассивной модуляции. К ритмам активной модуляции относят колебания в диапазонах Е, К, и М, так как источником колебаний в этом случае являются гладкомышечные клетки сосудистой стенки. Ритмы пассивной модуляции обусловлены внешними процессами: дыханием (Я) и прохождением пульсовой волны ©. Степень пространственной синхронизации осцилляций кровотока в этих частотных диапазонах оценивали по значениям кросс-корреляционной функции. На рис. 1 представлены синхронные фрагменты оригинальных ЛДФ-грамм и выделенные частотные составляющие со значениями коэффициента кросс-корреляции.
і Группа 1 (n=13) і Группа 2 (n=12)
її
Е N М К С
частотные диапазоны
Рис. 2. Усредненные значения коэффициентов кросс-корреляции в анализируемых частотных диапазонах для сформированных групп (описание в тексте). Символом «*» указаны пары достоверно различающихся значений (критерий Манна — Уитни, р & lt- 0. 05).
Распределение значений коэффициентов кросс-корреляции не подчиняется нормальному закону, и на приведенных графиках и таблицах данные представлены как медианы и квартили.
Результаты. Была выдвинута гипотеза о существовании двух групп испытуемых с преимущественным доминированием центральных или локальных механизмов. На основании кластеризации методом К-средних значений коэффициентов кросскорреляции по всем 5 частотным диапазонам исходная совокупность испытуемых была поделена на 2 группы.
Таблица
Усредненные значения коэффициентов кросс-корреляции в анализируемых частотных диапазонах
Част. диап. Группа I (n = 13) Группа II (n = 12)
25% 1 медиана | 75% 25% 1 медиана | 75%
условная норма
E 0. 38 0. 48* 0. 57 0. 68 0. 74* 0. 80
N 0. 38 0. 54* 0. 61 0. 6(0. 63* 0. 77
M 0. 57 0. 62* 0. 68 0. 59 0. 66* 0. 74
R 0. 46 0. 55* 0. 64 0. 20 0. 28* 0. 31
C 0. 36 0. 47 0. 63 0. 26 0. 35 0. 53
тепловая проба
E 0. 17 0. 35* 0. 46 0. 19 0. 45* 0. 58
N 0. 18 0. 23* 0. 30 0. 23 0. 26* 0. 33
M 0. 26 0. 34* 0. 41 0. 22 0. 30* 0. 32
R 0. 16 0. 24* 0. 34 0. 10 0. 17* 0. 20
C 0. 24 0. 40 0. 47 0. 11 0. 18 0. 56
(0. 74) и N (0. 63) и в меньшей степени демонстрирует корреляцию в диапазонах R (0. 28) и C (0. 35). Синхронизация колебаний в диапазоне миогенной активности (M) достаточно высока и значимо не отличается (0. 62 и 0. 66 для групп I и II, соответственно).
Результаты анализа данных синхронизации ритмов в покое и при локальном воздействии (тепловая проба) представлены в табл. Для всех диапазонов, за исключением диапазона кардиоритма ©, наблюдается значительное уменьшение коэффициента кросс-корреляции. Десинхронизация частотных составляющих ЛДФ-грамм обусловлена активацией локальных механизмов регуляции кровотока вследствие нагревания участка кожи.
Традиционное разделение ритмических осцилляций в системе микроциркуляции кожи на активные и пассивные связано с локализацией источника модуляции. Принято считать, что колебания в диапазонах Е, N и M формируются непосредственно в микроциркуляторном русле и обусловлены спонтанными сокращениями гладкомышечных клеток сосудистой стенки (собственно вазомоции) и их модуляцией со стороны нервной системы и эндотелия. Напротив, респираторно-зависимые и пульсовые колебания (диапазоны R и C, соответственно) формируются за пределами микроциркуляторного русла и передаются пассивно. Однако обнаружено, что для диапазонов локальной регуляции, по крайней мере, у ряда испытуемых, характерна высокая пространственная синхронизация (& gt- 0. 7), которая свидетельствует о наличии центрального компонента регуляции. В данном случае централизация может быть опосредована как гуморальными факторами, так и влияниями нейрогенной природы. В то же время для колебаний центральной природы (R и C) синхронизация выражена слабее (& lt-0. 5). Это связано с эффектами амплитудной и фазовой модуляции этих колебаний низкочастотных (локальных) ритмов. Регуляция кровотока на уровне микроциркуляции идет по балансному принципу через взаимодействие местных и центральных механизмов. Синхронизация колебаний в диапазоне миогенной активности достаточно высока и примерно одинакова для обеих групп, что может говорить об автономной специфической природе центрального генеза этих механизмов контроля.
Особенности регуляции периферического кровотока (баланс локальной и центральной регуляции) имеют индивидуальную специфику. В состоянии покоя для испытуемых группы I характерны преимущественно регуляторные факторы локальной природы, а для группы II ведущую роль играют центральные механизмы регуляции. Эти особенности синхронизации флак-смоций отражают состояние регуляторных механизмов и могут быть использованы в диагностике микрососудистых нарушений.
Литература
Х. Танканаг А. В., Чемерис Н. К. // Мат-лы IV всерос. симп. «Применение лазерной допплеровской флоуметрии в медицинской практике».- 2002.- С. 28−39.
2. HayozD. et al. // Hypertension.- 1995.- Vol. 26.- Р. 20−25.
3. Kellogg D. L et al. /. // J Appl Physiol.- 2006.- Vol. 100. -Р. 1709−1718.
4. Kvandal P. et al.
Vol. 72.- Р. 120−127.
5. Kvandal P. et al.
Vol. 65.- P. 160−171.
6. Podgoreanu M.V. et al. / // Anesthesiology. -№ 5.- Р. 1110−1117.
1. Soder strom T. et al. /// Am J Physiol Heart Circ Physiol. -2003.- Vol. 284.- P. 1638−1646.
/ // Microvascular Research.- 2006./ // Microvascular Research.- 2003. 2002.- Vol. 97,
1. 0
0. 8
0. 6
0. 4
0. 2
0. 0
Затенены пары достоверно отличающихся значений для сформированных групп в состоянии покоя. Символом «*» указаны пары достоверно различающихся значений внутри сформированных групп для состояния покоя и термопробы (критерий Манна — Уитни, р & lt- 0. 05).
Усредненные значения коэффициентов кросс-корреляции в анализируемых диапазонах для сформированных групп представлены на рис. 2 и в табл. Группа I характеризуется относительно низким значением корреляции сигналов в диапазонах эндотелиальной (Е) (0. 48) и нейрогенной (К) активности (0. 54) и достаточно высокой корреляцией в диапазонах респираторного ритма (Я) (0. 55) и кардиоритма © (0. 47). Группа II характеризуется высокой степенью синхронизации сигналов в диапазонах Е
УДК 612. 112. 91. 085. 2
НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ
И.И. ДОЛГУШИН, Ю. С. АНДРЕЕВА, А.И. РЫЖКОВА*
Ключевые слова: фагоцитарная активность нейтрофилов
Нейтрофилы, благодаря высокой подвижности, способности легко передвигаться в тканях, наличию мощных бактерицидных и цитотоксических продуктов — рассматриваются как высокопрофессиональные «убийцы», составляющие «отряд быстрого
* Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Челябинской ГМА, 454 092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. Тел. (351)232−74−56
реагирования» в системе противоинфекционной защиты организма [3]. В тканях нейтрофилы осуществляют свои эффектор-ные функции, участвуя в антимикробных и воспалительных реакциях. Нейтрофильные гранулоциты «пожирают» возбудителей и обезвреживают их с помощью антимикробных белков.
В 2004 году ученые Института инфекционной биологии имени Макса Планка (Берлин, Германия), работающие под руководством Артуро Зыхлински (Arturo Zychlinsky), открыли и расшифровали еще один используемый нейтрофилами механизм уничтожения патогенов. Оказалось, что клетки формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов — нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs). Микроорганизмы попадают в эти ловушки и погибают в них. Механизм формирования этих сетей удалось расшифровать только в результате длительной работы по визуализации клеток и биохимических исследований. Взаимодействие с бактериями особым образом активизирует нейтрофил: при этом изменяется структура ядра и цитоплазматических гранул клетки. Ядерная мембрана разрушается, гранулы растворяются, и компоненты будущей ловушки распределяются по объему клетки. Далее клетка сокращается до тех пор, пока ее мембрана не лопнет, и быстро выбрасывает высокоактивную смесь наружу. Попав во внеклеточное пространство, содержимое клетки формирует своеобразную сеть, в которую и попадают бактерии[5]. Исследование эффекторных функций нейтрофильных гранулоцитов показало их функциональную гетерогенность по отношению к активирующим объектам [1]. Можно предположить, что в ответ на действие бактериальных агентов нейтрофил реагирует по-разному: либо фагоцитируя бактерию-активатор, либо секретируя в окружающее пространство бактерицидные компоненты своих гранул, либо формируя внеклеточные сети. Возникла необходимость поиска способа обнаружения нейтрофильных ловушек. Brinkmann V. и соавт. использовали сканирующую электронную микроскопию для визуализации образовавшихся структур [5]. Однако этот способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования, набора реактивов для приготовления препарата и аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии, и потому не может быть использован для экспресс-обнаружения и количественной оценки.
Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, нами был использован способ выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [4]. Однако данная реакция требовала фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине, для приготовления реактивов были задействованы агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждались в специальных условиях хранения. Постановка реакции проходила в 2 этапа и занимала ~2−2,5 часов. При соблюдении всех вышеперечисленных условий ядерное вещество окрашивалось в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции вели с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении Х1000. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения этой реакции, учет представлял определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удавалось рассмотреть тонкие вне-клеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтро-филов и, кроме того, не определялись бактерии-активаторы.
Учитывая, что акридиновый оранжевый окрашивает ядра нейтрофилов в зеленый цвет, нами был использован этот краситель для определения внеклеточно расположенных волокон нейтрофильных ДНК. Такой способ окраски обладал преимуществами: для окраски использовался всего лишь один реактив (акридиновый оранжевый) — учет вели с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей различать окрашиваемые структуры (ядра нейтрофилов окрашивали в ярко-зеленый цвет, цитоплазма клеток, сохранивших морфологию, не окрашивалась, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающими пространство, в 2−3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имели ярко-оранжевый цвет) — такой способ окраски позволяет качественно и количественно охарактеризовать это явление.
Определение образования нейтрофильных ловушек осуществляли следующим образом:
1) Взвесь нейтрофилов получали, используя 15,0 мл гепа-ринизированной (10−15 ЕД/мл гепарина фирмы «Гедеон-Рихтер»,
Hungery) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden- Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,0751,077, а нижнего — 1,093−1,095. Объем каждого градиента равнялся 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами появлялось кольцо гранулоцитов с чистотой 98−100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали стерильным физраствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и доводили до концентрации 5−106 клеток/мл [1,3].
2) Полученную взвесь клеток инкубировали при температуре +370С 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) (препарат «Колибактерин», ФГПУ «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp. (препарат «Лактобактерин сухой», фирма «ИмБио», г. Н. Новгород), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК — 10, ООО «Ормет», г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, содержащей 108 Lactobacterium spp., 106 Bifidobacterium spp., 103S. aureus, 103E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси ней-трофилов. Для контроля использовали взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях без активаторов [1].
3) Для окрашивания нейтрофильных ловушек использовали 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого [3].
4) Учет вели с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Ядра нейтрофилов окрашивались в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивалась, нейтрофильные ловушки были представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающими пространство, в 2−3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имели ярко-оранжевый цвет.
После такого способа окраски появилась возможность проведения количественной оценки образования ловушек, так как хорошо различима морфология нейтрофилов. Именно по этому признаку визуализируемые структуры нами были разделены на 3 группы: 1 группа объединяла клетки с сегментированным ядром, 2 группа включала клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе отнесли свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Вели подсчет 100 структур разных групп и определяя процентное содержание каждой морфологической единицы.
При использовании предлагаемого способа окраски можно оценивать активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, показатели попадания бактерий-активаторов в нейтрофильные ловушки, так как имеется хороший контраст между нейтрофилами, их ловушками, окрашенными в зеленый цвет и бактериями, окрашенными в оранжевый. Для этого рассчитывают: активность фагоцитоза — число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме- интенсивность фагоцитоза — число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку- число нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки на 100 подсчитанных структур- индекс нейтрофильной ловушки — число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 клетку.
Предлагаемым способом было окрашено 50 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль), и 4 группы по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp. или смесью бактерий соответственно. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке программам БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала — Уоллиса и Манна — Уитни. При проведении сравнений использовали поправку Бонферрони [2].
Результаты исследований см. в табл. 1 и 2. После выделения на градиентах фиколла-верографина нейтрофилы в 60% случаев имели сегментированное ядро, у 24% нейтрофилов -ядро не дифференцировалось и 16% структур были представлены ловушками. После взаимодействия с E. coli, S. aureus, Lactobacte-
rium spp. или смесью бактерий число ловушек и клеток с недифференцированным ядром значительно увеличивалось (табл. 1).
Фагоцитарная активность нейтрофилов с неизмененным
Таблица 1
Содержание разных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия с E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий (n=10),%
Показатели Нейтрофилы
НН АНБ АН S А^ АН смесью бактерий
Содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, % 39,89±б, 19 32,4G±3,38* 40,70±2,21* 28,4G±4,81* 3б, 33±б, 39
Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, % 24,11±3,47 31,3G±2,31* 32,9±4,72 37, Ю±3,83* 13,33±1,б3
Содержание ловушек, % 1б^±4,22 36,3G±3,89* 30,00±2,73* 34,50±4,50* 28,3±З, 1З*
УДК 611. 018. 25. 017.1. 086−055. 2
ВЛИЯНИЕ НЕПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМОФЛОРЫ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК НА СЕКРЕЦИЮ НЕЙТРОФИЛАМИ АНТИМИКРОБНЫХ ПРОДУКТОВ И ЦИТОКИНОВ
Е.А. МЕЗЕНЦЕВА, Ю.С. АНДРЕЕВА, И.И. ДОЛГУШИН, А.Ю. САВОЧКИНА, К.В. НИКУШКИНА, О.С. АБРАМОВСКИХ, Е.В. ПЛЕХАНОВА, М.А. СВИРИДОВ, С.И. МАРАЧЕВ,
А.И. РЫЖКОВА*
Ключевые слова: бактерицидные факторы, нейтрофилы
Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к НН- НН -неактивированных нейтрофилов- АНЕ — нейтрофилы, активированные E. coli (штамм М-17) — АЖ — нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 2G9) — АНЬ — нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.- АН смесью бактерий -нейтрофилы, активированные смесью бактерий
ядром была выше по отношению к E. coli, S. aureus и Lactobacte-rium spp., чем к микроорганизмам, находящихся в микстах (смесь бактерий), при этом поглотительная способность (интенсивность фагоцитоза) нейтрофилов максимально проявлялась по отношению к S. aureus. Индекс ловушки после взаимодействия нейтро-филов с E. coli, S. aureus и Lactobacterium spp достоверно превышал тот же показатель после активации смесью бактерий (табл. 2) и в 2−3 раза превосходил значение интенсивности фагоцитоза.
Таблица 2
Показатели фагоцитоза и содержание E. coli (штамм М-17),
S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. в нейтрофильных ловушках (n=10)
Показатели Активирующие агенты
E. coli S. aureus Lactobacterium spp. Смесь бактерий
Активность фагоцитоза,% 7б, 00±б, 49 * 843, 39* 34,3±4,3* 21,22±2,8З
Интенсивность фагоцитоза на 1 клетку, усл. ед 2,59±0,5б* 8,49±1,G8* 1,22±G, 4G 0,3б±0,05
Индекс нейтрофильной ловушки, усл. ед 11,32±1,18* 2,5б±0,5б* 0,93±0,21
Примечание* - достоверность различий показателей по отношению к
показателям нейтрофилов, активированных смесью бактерий
Нами предложен экспресс-метод обнаружения нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек с использованием акридинового оранжевого, позволяющий быстро обнаружить образующиеся структуры после активации нейтрофила и дать количественную характеристику явлению. Используя люминесцентную микроскопию, было обнаружено, что в ответ на действие бактериальных агентов нейтрофил формирует свои ловчие сети, при этом клетки, сохранившие морфологию (клетки с сегментированными ядрами) обладают выраженной способностью к фагоцитозу, однако, количество микроорганизмов, поглощенных нейтрофилом значительно уступает числу бактерий, задерживаемых в ловушках.
Литература
1Андреева Ю. С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: Дис… канд.м. наук .- Челябинск, 2GG3.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика.- М.: Практика, 1999.
3. Долгушин И. И. Нейтрофилы и гомеостаз.- Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2GG1.
4Меркулов ГА. Курс патогистологической техники. -МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 19Зб.
3. Brinkmann V. et al. // Sciense.- 2GG4.- Vol. 3G3.- P. 1332-
1З3З.
Микробицидная функция нейтрофилов заключается в поглощении и внутриклеточной переработке захваченного материала и в секреции антимикробных факторов и иммуно-тропных медиаторов за пределы клетки [2].
Цель — изучение спектра бактерицидных факторов (ли-зоцим, лактоферрин, оксид азота, миелопероксидаза, дефен-сины 1−3, БПИ) и провоспалительных цитокинов в супернатантах нейтрофилов периферической крови после их предварительного взаимодействия с частицами полистирольного латекса и взвесью контрольных штаммов микроорганизмов.
Материалы и методы. Для решения поставленной задачи нейтрофилы выделяли из периферической крови 20 здоровых женщин на двойном градиенте плотности фикол-ла-урографина (Pharmacia, Швеция- Шеринг, Германия). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075−1,077, нижнего — 1,093−1,095 (Wong L., 1975), доводили до концентрации 5×106 клеток/мл и использовали для получения секреторных продуктов. Выделение секреторных продуктов полиморфноядерных лейкоцитов проводили с помощью метода, разработанного И. И. Долгушиным с соавторами (1992). Для получения супернатантов неактивированных нейтрофилов (СНН) взвесь клеток (концентрация 5×106 клеток/мл) помещали в термостат при температуре +37°С на 30 минут. Для выделения супернатантов активированных нейтрофилов (САН) клетки инкубировали в тех же условиях в присутствии микросфер латекса (диаметр частиц 1,7 мкм) из расчета 50 частиц на один нейтр офил или активировали нейтрофилы 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17) (препарат «Колибактерин», ФГПУ & quot-НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp. (препарат «Лакто-бактерин сухой», фирма «ИмБио», г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат «Бифидумбактерин сухой», ЗАО «Экополис», г. Ковров), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК — 10, ООО «Ормет», г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смесью бактерий, состоящей из 108 КОЕ/мл Lactobacterium spp.+ 106 КОЕ/мл Bifidobacterium spp. + 102 КОЕ/мл S. aureus +102 КОЕ/мл Е. coli на 1 мл взвеси нейтрофилов. После инкубации клетки и частицы латекса удаляли путем центрифугирования при скорости 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», USA), полученные супернатанты использовали в опытах.
Определение оксида азота в супернатантах интактных и активированных контрольными штаммами микроорганизмов ней-трофилов проводили по содержанию нитратов и нитритов. Содержание нитратов определяли в виде нитритов по реакции Грисса, после восстановления их губчатым кадмием [5]. Активность пероксидазы определяли на основании фотометрической регистрации понижения концентрации индигокармина, который окислялся перекисью водорода в присутствии пероксидазы [5]. Для определения содержания лизоцима использовали широко распространенный нефелометрический метод [6].
Концентрацию дефенсинов, БПИ, лактоферрина в супернатантах активированых и интактных нейтрофилов определяли методом ИФА с помощью набора реагентов «HNP1−3», «BPI — 1» (HyCult biotechnology, Нидерланды) и «ЛАКТОФЕРРИН-стрип» (ЗАО Вектор-Бест, п. Кольцово). Для определения содержания ИЛ-1а, ИЛ-1р, РАИЛ, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а в супернатантах нейтрофилов использованы тест-системы для иммуноферментно-го анализа, произведенные ТОО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) [3,4,6]. Полученные результаты подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ
* Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, Челябинская ГМА, 454 092, г. Челябинск, Воровского, 64. Тел. (351)232−74−56

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой