Влияние различных факторов на длительное сохранение лаванды in vitro

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Проблемы современной науки.
ЕСТЕСТВЕННЫЕ И ТОЧНЫЕ НАУКИ ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ДЛИТЕЛЬНОЕ СОХРАНЕНИЕ ЛАВАНДЫ IN VITRO Егорова Наталья Алексеевна ГБУ РК «НИИ сельского хозяйства Крыма»
INFLUENCE OF VARIOUS FACTORS ON THE LONG-TERM PRESERVATION OF LAVENDER IN VITRO Yegorova N.A.
& quot-Scientific Research Institute of Agriculture of the Crimea"
Исследовано влияние разных факторов и режимов депонирования на морфогенез эксплантов лаванды с целью разработки методики создания коллекции in vitro. Материалом для исследований служила лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.) сорта Степная. В качестве эксплантов использовали меристемы и микрочеренки с одним узлом. Проанализировано влияние маннита и сахарозы в составе питательной среды МС, а также низкой положительной температуры на развитие различных типов эксплантов при длительном сохранении in vitro. Установлено, что культивирование при +260С микрочеренков на питательных средах с добавлением 2−8% маннита или 6−8% сахарозы вызывало угнетение их развития по сравнению с контрольной средой, а через 3−4 месяца культивирования — пожелтение и некроз эксплантов. Показана возможность депонирования лаванды в течение 10−12 месяцев при использовании в качестве эксплантов меристем, температуры +4°С (без освещения), питательной среды с 2% сахарозы.
Ключевые слова: Lavandula angustifolia, эксплант, меристема, депонирование in vitro.
The influence of different factors and regimes of preservation on the morphogenesis of lavender explants in order to develop the methods of creating a collection in vitro was investigated. The material for the study was lavender (Lavandula angustifolia Mill.) cultivar 'Stepnaya'. As explants were used meristems and mikrocuttings with one node. The influence of mannitol and sucrose (2−8%) in a MS nutrient medium and low positive temperature on the development of various types of explants during prolonged preservation in vitro was analyzed. It is found that the cultivation at +260С mikrocuttings on nutrient
3
Сборник научных трудов. Выпуск 19
media supplemented with 2−8% mannitol or 6−8% sucrose causes inhibition of their development as compared with the control medium, and after 3−4 months of cultivation — yellowing and necrosis of the explants. The possibility of lavender preservation during 10−12 months using meristem explants, temperature +4°С (without lighting), culture medium with 2% sucrose was shown.
Key words: Lavandula angustifolia, explant, meristem, preservation in
vitro.
Введение
Лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.) является одним из основных возделываемых на юге России эфиромасличных растений, которое содержит эфирное масло и комплекс других ценных биологически активных веществ. Родиной этого вечнозеленого полукустарника является Средиземноморье, а в настоящее время лаванда культивируется в Крыму, на Кавказе, в Средней Азии, во Франции, Марокко, Италии, Испании и других странах [12]. Лавандовое эфирное масло широко используется в парфюмерно-косметической и пищевой промышленности, в керамическом производстве. В медицине его применяют как ранозаживляющее, спазмолитическое и успокаивающее средство при ревматических, желудочных и других заболеваниях, а также в ароматерапии [4].
На современном этапе развития селекции для создания и ускоренного размножения новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе и для лаванды, эффективно использование новых подходов, основанных на комплексе методов биотехнологии растений. Одним из основных требований в селекции растений является наличие широкого спектра разнообразного генетического материала, как дикорастущих видов, так и полученных в результате традиционной селекции или биотехнологии новых форм. При создании сортов селекционеру необходимо иметь в коллекции разнообразные генотипы, которые можно использовать в качестве доноров ценных признаков. Однако в результате хозяйственной деятельности человека происходит постоянное сокращение естественных ареалов дикорастущих форм и видов растений, что приводит к их гибели. При этом возникает существенная проблема создания и сохранения генофонда высших растений. Традиционные приемы поддержания коллекций сортов и селекционных образцов находятся в тесной зависимости от условий окружающей среды и связаны со значительными финансовыми расходами. Альтернативным подходом сохранения генофонда высших растений являются биотехнологические методы, которые позволяют экономить посевные площади, а также упростить и удешевить трудоемкий процесс поддержания всего многообразия имеющихся дикорастущих и селекционных форм [2, 9].
4
Проблемы современной науки.
К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал в области хранения растений в условиях in vitro. В конечном итоге все способы содержания коллекций in vitro можно разделить на 3 категории: пересадочные коллекции или хранение в условиях нормального роста- депонированные коллекции, в которых растения находятся в условиях замедленного роста- криоконсервация растительного материала в жидком азоте [2, 9]. Достаточно эффективным и относительно простым
методическим подходом является депонирование коллекции, которое основано на возможности удлинения периода между пересадками биотехнологических объектов. Обычно, для поддержания нормального роста необходимо пассировать меристемные или каллусные культуры через 1−1,5 месяца. При использовании методов «минимального роста» для подавления роста культур применяют различные способы, которые позволяют удлинить период без пересадок до 12−24 месяцев. Снижение температуры культивирования (до +1 — +10 оС) — наиболее широко используемый способ. Выбор температуры определяется холодостойкостью растения. Например, для сохранения коллекции картофеля использовали температуру +9оС, тогда как для яблони +1оС [3, 8]. Другие приемы замедления роста тканей и органов in vitro основаны на добавлении в питательную среду осмотиков (маннита, сорбита, высоких концентраций сахарозы) или гормонов, ингибиторов роста (хлорхолинхлорида, абсцизовой кислоты и др.) [2, 10, 13]. Методики создания депонированных коллекций in vitro активно разрабатываются для многих дикорастущих видов, а также цветочно-декоративных и ценных сельскохозяйственных культур [1, 10, 11, 13, 19]. Однако сведения об исследованиях по созданию коллекций in vitro для лаванды в анализируемой литературе отсутствуют. Целью данной работы было исследование влияния разных факторов и приемов депонирования на развитие эксплантов лаванды в асептической культуре.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили ткани и органы лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) сорта Степная. В качестве первичных эксплантов использовали меристемы с одной парой листовых примордиев из пазушных почек растений закрытого грунта. Отрезки побегов стерилизовали с использованием 70% этанола и 50% препарата «Брадофен». При введении в культуру эксплантов, культивировании и приготовлении питательных сред применяли традиционные методики, принятые в работах по культуре ткани растений [7]. Для размножения полученные из меристем побеги разделяли на микрочеренки 5−7 мм с 1 узлом и парой листьев. Почки или микропобеги культивировали на ранее разработанной нами для микроразмножения лаванды модификации
5
Сборник научных трудов. Выпуск 19
питательной среды Мурасиге и Скуга (МС418) [5]. При исследовании длительного хранения лаванды использовали меристемы, изолированные из донорных растений, или сегменты стебля с 1 узлом, выделенные из полученных из меристем побегов (микрочеренки). Эти экспланты в разных вариантах опытов культивировали на среде МС418 с добавлением маннита или сахарозы (2−8%), а также в холодильной камере при +4оС без освещения. В контрольных вариантах, а также при анализе отрастания культур после холодового хранения культивирование осуществляли при +26оС, 70% влажности и 16-часовом фотопериоде с освещённостью 2−3 тыс. люкс.
В процессе исследований определяли число жизнеспособных эксплантов, длину побегов и их число, количество узлов на побеге, частоту множественного побегообразования. Коэффициент размножения (К.Р.) рассчитывали как количество микрочеренков, которое можно получить за 1 цикл выращивания, для этого среднее количество образующихся на экспланте побегов умножали на среднее число узлов на побеге. Все опыты проводили в 3-х кратной повторности, в каждом варианте анализировали не менее 20 эксплантов. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью традиционных методов статистического анализа с использованием пакета программ Microsoft Office (Excel 2003). На графиках представлены средние арифметические и доверительные интервалы.
Результаты и обсуждение
При разработке методов создания коллекций in vitro в качестве объектов для длительного хранения часто используются меристемы или полученные из них микропобеги, поэтому необходимым этапом такого рода исследований является создание методов клонального микроразмножения. В литературе имеются данные о различных аспектах микроразмножения некоторых видов лаванды — L. officinalis, L. dentata, L. angustifolia, L. viridis, L. vera, L. spica, L. pedunculata [14−18, 20, 21]. Ранее нами была разработана методика микроразмножения с использованием культуры изолированных меристем для ряда сортов и селекционных образцов L. angustifolia [5, 6].
Основной задачей данной работы был анализ разных режимов депонирования с целью разработки приемов создания коллекций in vitro. Проанализировано влияние разных концентраций маннита и сахарозы в питательной среде на развитие микрочеренков лаванды при обычном режиме выращивания (+26оС) в культуральной комнате. Выявлено, что у сорта Степная маннит в концентрации 2 и 4% ингибировал рост эксплантов. Количество развивающихся микрочеренков через 2 месяца культивирования при добавлении 4% маннита снизилось со 100% (в контроле) до 92,3%. При этом наблюдали уменьшение длины побегов и количества пар листьев в 3−4 раза по сравнению с контролем. Частота индукции дополнительных побегов снизилась с 68,5% (в контроле) до 33,3%. Следует отметить, что у 75−80%
6
Проблемы современной науки.
побегов наблюдали пожелтение верхушек и некроз нижних листьев. Увеличение концентрации этого осмотика до 6 и 8% привело к полной остановке развития и почернению основного числа микрочеренков. Увеличение продолжительности беспересадочного культивирования на средах с осмотиком (более 4-х месяцев) способствовало дальнейшему развитию некроза у эксплантов.
Установлено, что культивирование микрочеренков лаванды на питательной среде с высокими концентрациями сахарозы (6−8%) при +26оС вызывало угнетение их развития по сравнению с контрольной средой (2% сахарозы). Введение в среду 6% сахарозы привело к снижению длины побега и числа узлов на нем (до 2,5−3,0 раз), при этом побеги приобретали желто-бурую окраску. Повышение содержания сахарозы до 8% способствовало полной остановке развития микрочеренков, при этом экспланты имели бурую окраску или чернели и гибли. Полученные результаты свидетельствуют о недостаточной эффективности применения маннита и высоких доз сахарозы для замедления развития меристемных культур лаванды при их культивировании в обычных условиях культуральной комнаты при +26оС.
Поэтому в дальнейшем для разработки методов создания коллекций in vitro у лаванды мы использовали один из наиболее распространенных приемов — депонирование при +4оС, при этом культивирование проводили в холодильной камере без освещения. Анализировали эффективность применения в качестве эксплантов меристем (с парой листовых примордиев) и микрочеренков, а также питательных сред с добавлением 2 — 8% сахарозы. При анализе эксплантов в течение 2−12-ти месяцев депонирования было отмечено, что меристемы и микрочеренки постепенно становились этиолированными и развитие их значительно тормозилось. Количество жизнеспособных меристем через 6−10 месяцев было почти на уровне контроля, а через год выявлено 87% жизнеспособных меристем (рис. 1). Установлено, что у 12,5−13,3% меристем происходила индукция дополнительных почек. При использовании в качестве эксплантов микрочеренков наблюдали более значительное снижение жизнеспособности (рис. 2). Уже через 6 месяцев число жизнеспособных эксплантов не превышало 85%. Через 10 месяцев было отмечено 38,5% жизнеспособных светлых микрочеренков, которые начинали медленно развиваться, формируя побеги (в среднем 10,4−13,0 мм), у 40% которых происходило развитие адвентивных почек и побегов. После года хранения in vitro наблюдали некроз всех микрочеренков.
Использование в составе питательной среды высоких концентраций сахарозы у обоих типов эксплантов в большинстве вариантов опыта достоверно не влияло на жизнеспособность, за исключением варианта
7
Сборник научных трудов. Выпуск 19
хранения микрочеренков в течение 10 месяцев, в котором при 8% сахарозы наблюдали некроз 100% эксплантов. Необходимо отметить, что повышение содержания этого углевода способствовало снижению морфометрических показателей, потемнению побегов, что свидетельствует о нецелесообразности увеличения концентрации сахарозы в питательной
Рис. 1. — Влияние длительности хранения in vitro и концентрации сахарозы в питательной среде на количество жизнеспособных эксплантов меристем лаванды сорта Степная
0 2 4 б 10 12
Длительность хранения, месяц
Рис. 2. — Влияние длительности хранения in vitro и концентрации сахарозы в питательной среде на количество жизнеспособных эксплантов микрочеренков лаванды сорта Степная
8
Проблемы современной науки.
У различных видов растений для депонирования в качестве эксплантов используют почки, микропобеги, соматические зародыши, протокормы, а также питательные среды с повышенными концентрациями сахарозы или добавлением маннита, сорбита, хлорхолинхлорида [2, 10]. При этом часто снижают температуру культивирования до +1оС- +10оС [2] или +18оС [19], хотя у большинства видов используется хранение при +4−6оС [9, 11]. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности депонирования лаванды при +4оС (без освещения) в течение 10−12 месяцев. В экспериментах была выявлена более высокая жизнеспособность меристем сорта Степная по сравнению с микрочеренками при длительном хранении.
При разработке методики хранения in vitro очень важным является анализ развития эксплантов после их хранения и последующего выращивания в обычных условиях в культуральной комнате. Для этого часть хранившихся в холодильной камере объектов после определенного срока хранения пересаживали на свежую питательную среду МС418 с 2% сахарозы. В некоторых случаях при этом проводили микрочеренкование. Анализ отрастания культур после 10 и12 месяцев холодового хранения в первом пассаже показал снижение ряда морфометрических параметров развития по сравнению с контролем (Табл.). Большее угнетение наблюдали у эксплантов микрочеренков, у которых после 10 месяцев хранения развивалось не более 42,9% эксплантов, а после 12 месяцев депонирования микрочеренки были некротические, и их невозможно было использовать для дальнейшего культивирования. В то же время у эксплантов меристем после 10 месяцев было до 83,3%, а после 12 месяцев — до 32,5% жизнеспособных эксплантов. Лучшее развитие побегов наблюдали после хранения эксплантов на среде с 2% сахарозы. Из жизнеспособных эксплантов уже в 1-м пассаже после хранения получали нормальные зеленые побеги, достоверно не отличающиеся от контрольных по длине и способности к множественному побегообразованию. После 10-ти месяцев хранения у меристем наблюдали тенденцию к формированию большего числа адвентивных побегов (Табл.). В следующем, 2-м пассаже, после микрочеренкования побегов, развившихся из жизнеспособных микрочеренков, и, особенно, из меристем, происходило почти полное восстановление морфометрических показателей культур по сравнению с контролем.
Полученные данные позволили разработать методику длительного хранения лаванды in vitro, позволяющую поддерживать культуры до 10−12 месяцев, в которой рекомендуется проводить депонирование при +40С в холодильной камере без освещения, в качестве эксплантов использовать меристемы и культивировать их на питательной среде МС418 с 2% сахарозы. Однако длительность сохранения при этих условиях не
9
Сборник научных трудов. Выпуск 19
превышала 1 года, что свидетельствует о целесообразности продолжения наших исследований по оптимизации режимов культивирования и питательных сред с целью увеличения продолжительности беспересадочного сохранения лаванды в асептических условиях.
Таблица. Развитие меристем и микрочеренков лаванды после различной длительности хранения при +40С и переноса на свежую питательную среду (культивирование при +26°С)___________________
Длительно сть хранения, месяц Тип эксплан та Концентр ация сахарозы, % Количество жизнеспособ ных эксплантов, % Длина побега, мм Количест во узлов, шт Количество побегов, шт/ эксплант
Контроль микроч еренок 2 100 14,9±1,9 3,6±0,3 4,8±0,5
меристе ма 2 100 12,6±1,0 3,1±0,3 3,9±0,4
10 микроч еренок 2 42,9 15,3±1,5 3,2±0,4 6,0±1,0
6 27,3 11,1±1,1 1,5±0,4 2,0±0,6
меристе ма 2 83,3 16,8±1,8 2,5±0,4 6,0±0,9
6 66,7 15,7±1,6 2,2±0,3 7,7±1,1
12 меристе ма 2 32,5 10,2±1,0 1,6±0,4 2,4±0,6
6 8,7 3,4±0,5 0,8±0,3 1,1±0,3
Выводы.
Исследовано влияние разных режимов депонирования лаванды (Lavandula angustifolia) сорта Степная с целью разработки методики создания коллекций in vitro. Показано, что культивирование при +260С микрочеренков на питательных средах с добавлением маннита (2−8%) или высокими концентрациями сахарозы (6−8%) вызывало значительное угнетение их развития по сравнению с контрольной средой, а через 3−4 месяца культивирования — пожелтение и некроз эксплантов. Выявлены особенности развития двух типов эксплантов (меристем и микрочеренков) при хранении в течение 1 года при +40С в темноте на питательных средах с разными концентрациями сахарозы, а также при их дальнейшем выращивании после хранения в течение 2-х пассажей в культуральной комнате при +260С. Показана нецелесообразность увеличения в питательной среде МС концентрации сахарозы до 6−8% у обоих типов эксплантов, так как это приводило к снижению многих показателей развития меристемных
10
Проблемы современной науки.
культур. Сравнение 2-х типов эксплантов выявило преимущество использования для депонирования меристем, поскольку у них была большая длительность беспересадочного хранения и выше морфометрические параметры. Разработана методика длительного хранения лаванды, позволяющая поддерживать культуры до 10−12 месяцев (при количестве жизнеспособных эксплантов до 83%), в которой рекомендуется депонировать меристемы в темноте при +40С на среде МС418 с 2% сахарозы.
Список литературы:
1. Антонова О. Ю. Анализ генетической стабильности образцов картофеля, сохраняемых в условиях in vitro / О. Ю. Антонова, Э. В. Трускинов, Д. В. Фролова, Т. А. Гавриленко // Аграрная Россия. — 2004. — № 6. — С. 25−29.
2. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р. Г. Бутенко. — М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160с.
3. Джеймс Е. Хранение клеток в условиях низких температур // Биотехнология сельскохозяйственных растений / Е. Джеймс. -М. :Агропромиздат, 1987. — С. 153−175.
4. Дудченко Л. Ароматы здоровья / Л. Дудченко. — Киев: Глобус. -1997. — 152.
5. Егорова Н. А. Получение растений-регенерантов в каллусной культуре лаванды и их микроразмножение in vitro (методические рекомендации) / Н. А. Егорова. — Симферополь: ИЭЛР УААН, 2008. — 28 с.
6. Егорова Н. А. Клональное микроразмножение in vitro некоторых эфиромасличных растений / Н. А. Егорова, И. В. Ставцева, А. Г. Инюткина // Нау^ пращ ПФ «КАТУ» НАУ. — 2008. — В. 107. — с. 127−131.
7. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений/ Ф. Л. Калинин, В. В. Сарнацкая, В. Е. Полищук. — Киев: Наукова думка, 1980. — 488 с.
8. Матушкина О. В. Длительное хранение подвоев и сортов яблони и груши in vitro / О. В. Матушкина // Тез. докладов 9-й Межд конф.- Москва И Д ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 246−247.
9. Мельничук М. Д. Бютехнолопя рослин. Подручник / М. Д. Мельничук, Т. В. Новак, В. А. Кунах. — К. :Пол^рафКонсалтинг, 2003. — 52с.
10. Митрофанова И. В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур / И. В. Митрофанова. — К: Аграрна наука, 2011. — 344 с.
11. Молканова О. И. Методические основы сохранения и устойчивого воспроизводства генофонда растений в культуре in vitro / О. И. Молканова, О. Г. Васильева, Л. Н. Коновалова // Вестник Удмуртского университета. — 2015. — Т. 25, вып.2. — С. 95−100.
11
Сборник научных трудов. Выпуск 19
12. Назаренко Л. Г. Эфироносы юга Украины / Л. Г. Назаренко, А. В. Афонин. — Симферополь: Таврия, 2008. — 144 с.
13. Новикова Т. И. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro Центрального сибирского ботанического сада / Т. И. Новикова, А. Ю. Набиева, Т. В. Полубоярова // Вестник ВОГиС. — 2008. — т12, № 4. — с. 564−571.
14. Andrade L.B. The effect of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavander (Lavandula vera DC) / Andrade L. B, Echeverrigaray S., Fracaro F. [et al.] // Plant Cell Tissue Org. Cult. — 1999. — Vol. 56, № 2. — P. 79−83.
15. Chishti N. Rapid in vitro clonal propagation of Lavandula officinalis chaix a multipurpose plant of industrial impotance / Chishti N., Kaloo Z.A., Shawl A.S., Sultan Ph. // Pakistan J. of Biol. Sciences. — 2006. № 9. — P. 514−518.
16. Dias M.C. Rapid clonal multiplication of Lavandula viridis L’Her through in vitro axillary shoot proliferation / M.C. Dias, R. Almeida, A. Romano // Plant Cell Tissue Org. Cult. -2002. — Vol. 68, № 1. — P. 99−102.
17. Echeverrigaray S. Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants / S. Echeverrigaray, R. Basso, L.B. Andrade // Biol. Plantarum. — 2005. — Vol. 49, № 3. — P. 439−442.
18. Hamza A.M. Direct micropropagation of English lavender (Lavandula angustifolia Munstead) plant /A.M. Hamza, M.A.E.K. Omaima, M.M. Kasem // J. Plant Production, Mans. Univ. -2011. -Vol. 2, № 1. -P. 81−96.
19. Watt M.P. In vitro minimal growth storage of Saccharum spp. hybrid (genotype 88H0019) at two stages of direct somatic embryogennic regeneration / Watt M.P., Banasiak M., Reddy D. [et al.] // Plant Cell Tiss. Org. Cult. — 2009. -Vol. 96, № 3. — P. 263−271.
20. Xian Ri Li Micropropagation and RAPD analysis of somaclonal variants in Lavandula spica cv. Marino / Xian Ri Li, Eun-Soo Seong, Il-Seop Kim, Chang-Yeon Yu // Korean Journal of medicinal crop science. -1999. — Vol. 7, № 2. — P. 94−100.
21. Zuzarte M.R. Trichomes, essential oils and in vitro propagation of Lavandulapedunculata (Lamiaceae) / Zuzarte M.R., Dinis A.M., Cavaleiro C. [et al.] // Industrial Crops and Products. — 2010. — №. 32. — P. 580−587.
12

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой