Бактериологическая схема детекции Bordetella bronchiseptica с использованием специфических бактериофагов

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДИ 619: 579. 62
10. 18 286/1816−4501−2015−4-73−77
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ДЕТЕКЦИИ BORDETELLA BRONCHISEPTICA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ
Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
Богданов Ильгизар Исмаилович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
ФГБОУ В О Ульяновская ГСХА
432 017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, тел.: 8(8422)55−95−47, e-mail: vet_yulia@mail. ru
Ключевые слова: Bordetella bronchiseptica, индикация, бактериологическая схема, фаги, идентификация.
В статье представлены материалы по разработке новых схем бактериологической индикации и идентификации бактерий вида Bordetella bronchiseptica. Авторами предложены усовершенствованные схемы с применением разработанной дифференциально-диагностической среды, селективной добавки и биопрепарата, содержащего фаги бактерий Bordetella bronchiseptica.
Введение
Сложность лабораторной диагностики бордетеллеза, его распространённость среди животных актуализируют поиск и разработку схем, пригодных для быстрой и точной индикации и идентификации возбудителя.
Истинная заболеваемость бордетел-лезом домашних животных (кошки, собаки, грызуны) значительно выше за счет частого протекания инфекции в атипичных формах (латентная, абортивная, носительство). Трудности клинической диагностики инфекции на ранних стадиях заболевания или его проведение на поздних сроках, а также после продолжительного лечения антибиотиками, отсутствие обследования кашляющих более 1−2 недель взрослых животных приводит к низкому проценту выявляемое™ возбудителя бордетеллёза. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10 — 20% [1, 2].
Современные экспрессные, высокочувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики крайне необходимы в связи с эпизоотологической возможностью межвидовой передачи возбудителя среди животных (собаки, кошки, свиньи, грызуны) и эпидемиологическим значением в инфи-
цировании людей [3−13].
Метод фа годна гностики широко используется в лабораторной практике для идентификации различных видов микроорганизмов. Фагоидентификация возбудителей инфекций основана на учете лизиса выделяемых культур, вызванного фагом с известным диапазоном действия. Феномен лизиса является основой для использования фага в диагностических целях. Следовательно, бактериофаг представляет собой инструмент, устанавливающий видовую принадлежность микроорганизма, выделенного из исследуемого материала при помощи бактериологического метода.
В настоящее время проба с бактериофагами, в силу их специфичности и избирательности действия, является надёжным методом детекции возбудителей инфекций животных и человека из доступных рядовой лаборатории [14,15,16].
В связи с этим, целью нашего исследования явилась разработка новых бактериологических схем детекции, бактерий вида Bordetella bronchiseptica.
Объекты и методы исследований
Работа выполнена на базе научно-исследовательского инновационного центра
Рис. 1 — Схемы бактериологической детекции бактерий вида B. bronchiseptica, где: а —
разработанная нами схема № 1- б-схема, изложенная в МУК 4.2. 2317−08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикоз-ных бактерий» [1 ]
микробиологии и биотехнологии (НИИЦ-МиБ) ФГБОУ В О Ульяновская ГСХА.
Объектами исследований были 5 ре-ференс-штаммов B. bronchiseptica, 3 штамма
B. pertusis, 1 штамм B. parapertusis, 2П рефе-ренс-штаммов близкородственных бактерий из музейной коллекции кафедры. Использовали тонзиллитные и назофагингеальные мазки от животных, искусственно контами-нированные индикаторными штаммами концентрации 105 — IC^m.к. в 1 мл. Пробы предварительно исследовали бактериологическим методом на отсутствие B. bronchiseptica.
В работе использовали общепринятые микробиологические методы, а также авторские усовершенствованные методики [2−17].
Нами были апробированы схемы бак-
териологической детекции B. bronchiseptica в сравнении с изложенной в МУК 4.2. 2317−08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» [1].
Результаты исследований
На первом этапе экспериментальной работы испытания проводили на лабораторных штаммах. Схема № 1 включала следующие исследования (рис. 1).
1- е сутки: исследуемый материал высевали на 2 чашки с дифференциально-диагностической средой без и с селективной добавкой. Инкубировали 24−48 ч в термостате при температуре 36−37°С до появления визуально различимых колоний.
2- 3-е сутки: отбирали не менее 3-х ха-
Рис. 2 — Схемы бактериологической детекции бактерий вида B. bronchiseptica, где: а — разработанная схема № 2- б — разработанная схема № 1
рактерных колоний бирюзового цвета. Проводили микроскопию окрашенных по Граму мазков с выявлением грамотрицательных мелких коккобацилл, равномерно располагающихся в мазке одиночно, по парам или короткими цепочками. Гемолитическую активность устанавливали на стекле микрометодом. Для выделения чистой культуры и наращивания бактериальной массы отсеивали колонии в МПБ и на МПА. Учитывали предварительный результат. При отсутствии подозрительных колоний продолжали культивирование.
3−4-е сутки исследования: изучали чистую культуру, проводили микроскопию, экспресс-тесты на цитраты и нитритредуктазу. Учитывали окончательный результат.
В результате многократных испытаний установили, что проведение бактериологического анализа по общепринятой
схеме занимает 72−120 ч, тогда как проведение исследования по предлагаемой нами схеме N°l-49−98 4. При использовании разработанной дифференциально-диагностической среды и селективной добавки сокращается количество биохимических идентификационных тестов. Усовершенствованный метод определения гемолитической активности ускоряет анализ. Испытанные схемы показали 100% специфичность по отношении к бактериям B. bronchiseptica.
Следующим этапом исследований явилось включение в разработанную схему № 1 метода «стекающая капля» с нанесением специфичных бактериофагов на газон роста культуры — схема № 2 (рис. 2).
Посев материала проводили на разработанную нами питательную среду, с инкубацией в течение 20−24 ч при 36−379С. При на-
линии визуально различимых однотипных колоний поводили микроскопию с окраской по Граму и отсев на МПБ с культивацией 18 ч при 36−375С. Для фагоидентификации на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3−4 капли суточной бульонной культуры исследуемых образцов. Культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Газоны подсушивали 15−20 мин в термостате. Чашку Петри делили на сектора и на поверхность культуры пипеткой наносили каплю биопрепарата с бактериофагами. В качестве контроля наносили стерильный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли. Выдерживали образцы в боксе 15−20 мин для подсушивания, затем культивировали в термостате при 36−379С в течение 18 ч.
Наличие зоны лизиса на сплошном газоне роста культуры в месте нанесения фагов указывало на принадлежность исследуемого штамма к бактериям вида B. bronchiseptica. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне культуры. При наличии отрицательных и сомнительных результатов фагоидентификации проводили дополнительные биохимические тесты.
В результате проведенных исследований установили, что продолжительность анализа при включении в схему «метода стекающей капли» сокращается до 60 ч, при меньшем расходе питательных сред, реактивов, лабораторной посуды.
Испытание схем на близкородственных тест-штаммах во всех экспериментах показало отрицательный результат.
Установили, что аналитическая чувствительность разработанной бактериологической схемы с использованием дифференциальнодиагностической среды с селективной добавкой и схемы, изложенной в МУК 4.2. 2317−08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий», составляет 104 м.к. /мл, схемы с использованием бактериофагов -103 м.к. /мл.
Выводы
Усовершенствованная схема бактериологической детекции бактерий вида
B. bronchiseptica с использованием фагоидентификации включает взятие биоматериала на разработанную дифференциально-диагностическую среду с селективной добавкой и
без неё с культивированием 24 ч при 36−379С, отбор не менее 3-х характерных колоний бирюзового цвета, микроскопию мазков, окрашенных по Граму, подтверждение методом «стекающей капли» со специфическими бактериофагами. В сомнительных случаях схему дополняют биохимическими тестами. Гемолиз проводят экспресс-методом на стекле в течение 15−30 мин.
Разработанная схема позволяет идентифицировать возбудителя бордетеллёза в течение 60 ч, тогда как продолжительность исследований по традиционной схеме детекции бактерий вида B. bronchiseptica составляет 72−120 ч.
Библиографический список
1. Методические указания «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий». МУК 4.2. 2317−08.
— М. — 2008.
2. Методические рекомендации «Инфекции дыхательных путей. Диагностика коклюша и паракоклюша». МР 3.1.2. 0072−13.
— М. — 2013.
3. Васильев, Д. А. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Вог-detella bronchiseptica / Д. А. Васильев, Ю. Б. Васильева, Е. Н. Семанина // Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». -Ульяновск: УГСХА им. П. А. Столыпина. — 2013. — T.I. — С. 28−32.
4. Васильев, Д. А. Технология конструирования диагностического биопрепарата на основе бактериофагов Bordetella bronchiseptica и перспективы его применения / Д. А. Васильев, Ю. Б. Васильева, Е. Н. Семанина // Материалы Международной научнопрактической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». — Ульяновск: УГСХА им. П. А. Столыпина. — 2013. — T. II. — С. 99−104.
5. Васильева, Ю. Б. Изучение аналитической чувствительности и диагностической эффективности тест-системы индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica / Ю. Б. Васильева, А. В. Мастиленко, Д.А. Васи-
льев, Р. Р. Бадаев, С. В. Мерчина, И.Г. Швиден-ко, А. С. Скорик // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — С. 596.
6. Васильева, Ю. Б. Биопрепараты для детекции бактерий Bordetella bronchiseptica / Ю. Б. Васильева, Д. А. Васильев, А.В. Масти-ленко, Д. Г. Сверкалова // Инфекция и иммунитет. — 2014. -№ S. — С. 70−71.
7. Актуальные вопросы лабораторной диагностики бордетеллёза животных и брон-хосептикоза людей/Ю.Б. Васильева, Д. А. Васильев, А. В. Мастиленко, Д. Г. Сверкалова // Инфекция и иммунитет. 2014. — N° S. — С. 70.
8. Ломакин, А. А. Чувствительность к антимикробным средствам бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А. А. Ломакин, А. В. Мастиленко, Ю. Б. Васильева // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии: материалы 1-ой Международной заочной научно-практической конференции. — Ульяновск: УлГПУ. — 2014. — С. 144 147.
9. Комплексный биопрепарат на основе фагов / А. Г. Семанин, Е. И. Суркова, А. С. Скорик, Ю. Б. Васильева, Н. А. Феоктистова, А. Н. Пирюшова, Н. Р. Уралов // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии: материалы 1-ой Международной заочной научно-практической конференции. — Ульяновск: УлГПУ. — 2014. — С. 79−82.
10. Проблемы лабораторной диагностики бордетеллёза животных и пути их решения / Ю. Б. Васильева, А. В. Мастиленко, А. Г. Семанин, А. С. Скорик, Е. И. Суркова // Аграрная наука — сельскому хозяйству: сборник статей IX-й Международной научно-практической конференции. — Барнаул: РИО АГАУ. -2014. -С. 257−259.
11. Наборы для детекции бактерий вида В. bronchiseptica / Ю. Б. Васильева, А. В. Мастиленко, Д. А. Васильев, А. Г. Семанин, Е. И. Суркова, А. С. Скорик, А. Н. Пирюшова, Н. Р. Уралов // Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных: матери-
алы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИ-ИВВиМ,-2014. -С. 48−53.
12. Алгоритмы использования тестсистемы индикации и идентификации бактерий В. bronchiseptica / Ю. Б. Васильева, А. В. Мастиленко, Д. А. Васильев, Р. Р. Бадаев, С. В. Мерчина, И. Г. Швиденко, Е. И. Суркова // Современные проблемы науки и образования. -2014. -С. 606.
13. Vasylyeva, Yu.В. Selection of the complex of microbiological tests for Bordetella bronchiseptica typing / Yu.B. Vasylyeva // Вестник Орловского государственного аграрного университета. — 2013. — Т. 43. — N° 4. — С. 44−46.
14. Феоктистова, Н. А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов бактерий Bacillussubtilis / Н. А. Феоктистова // В книге: «Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека». — Ульяновск, 2013. — С. 186−197.
15. Биоиндикация бактерий Bacillus ту-coides в объектах санитарного надзора / Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин, Н. А. Феоктистова, М. А. Лыдина, А. И. Калдыркаев, В. А. Макеев, И. Г. Швиденко // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2013. — № 3 (23). — С. 52−56.
16. Распространение Bacillus cereus и Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н. А. Феоктистова, А. И. Калдыркаев, Д А Васильев, С. Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2014. — N° 1 (25). — С. 68−76.
17. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин, А. В. Алешкин, Н. А. Феоктистова,
С. В. Мерчина, В. В. Батраков, М. А. Юдина, В. А. Макеев, Н. А. Романова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2012. — N° 3. — С. 69−73.

Показать Свернуть
Заполнить форму текущей работой