Липосомальная араноза не индуцирует аутофагию

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ АРАНОЗА НЕ ИНДУЦИРУЕТ.
15
УДК 615. 2/. 3:577. 352. 2:576. 36
Д. А. Афанасьева, М. А. Барышникова, Ю. А. Хоченкова, П. В. Голышко, Д. А. Хоченков, Е. В. Степанова, О.О. Рябая
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ АРАНОЗА НЕ ИНДУЦИРУЕТ АУТОФАГИЮ
ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина», Москва
Контактная информация
Барышникова Мария Анатольевна, к. фарм.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной
диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО
адрес: 115 478, Москва, Каширское ш., 24- тел. +7(499)324−10−65
e-mail: ma ba@mail. ru
Статья поступила 08. 11. 2014, принята к печати 24. 11. 2014.
Резюме
Ранее было показано, что араноза в лекарственной форме & quot-Лиофилизат для приготовления раствора для инъекций& quot- (араноза-лио) вызывает клеточную смерть за счет активации апоптоза через СБ95-рецептор в отличие от ее липосомальной лекарственной формы, механизм действия которой пока не изучен. Известно, что гибель опухолевых клеток под воздействием противоопухолевых препаратов может также проходить через активацию аутофагии.
Цель данной работы — определить влияние липосомальной лекарственной формы аранозы на аутофагию. Исследование проводили на клеточных линиях меланомы человека mel Mtp, mel Ibr, mel Kor, mel Z и mel Mtp clone X. Клетки инкубировали в течение 24 ч с аранозой-лио, либо с липосомальной аранозой в концентрации 450 мкг/мл, после чего проводили анализ экспрессии мРНК гена Beclin 1.
В результате на большинстве клеточных линий показано снижение экспрессии мРНК Beclin 1. Это может быть связано с тем, что липосомальная форма препарата вызывает гибель клеток по механизму внутреннего апоптоза, который подавляет аутофагию.
Ключевые слова: араноза, липосомы, аутофагия, клеточная гибель.
D.A. Afanasieva, M.A. Baryshnikova, Yu.A. Khochenkova, P.V. Golyshko,
D.A. Khochenkov, E.V. Stepanova, O.O. Ryabaya
THE LIPOSOMAL ARANOSA DOES NOT INDUCE AUTOPHAGY
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
Previous studies have shown that aranosa-lio initiate cell death by activation of CD95-receptor of apoptosis. The mechanism of liposomal aranosa action is still unknown.
Anticancer drugs may cause tumor cell death by the activation of autophagy.
The purpose of this study was to determine the influence of liposomal aranosa on autophagy.
The study was assessed on human melanoma cell lines mel Mtp, mel Ibr, mel Kor, mel Z and mel Mtp clone X. The cells were treated with aranosa-lio or liposomal aranosa at concentration 450 ^g/ml for 24 hours. The expression of autophagy were analyzed the expression of mRNA Beclin 1.
Expression of mRNA Beclin 1 was reduced on the majority of cell lines, which might be due to the fact that the liposomal form of the drug caused cell death by intrinsic apoptosis which is suppose to suppress autophagy.
Key words: aranosa, liposomes, autophagy, cell death.
Введение
Идентифицировано несколько вариантов программированной клеточной смерти, таких как внешний и внутренний апоптоз, регулируемый некроз, аутофагия, пироптоз и другие [8- 22- 28]. Среди них наиболее хорошо изучен апоптоз [1- 2- 25- 26- 30−35]. Лекарственные противоопухолевые препараты индуцируют апоптоз по внешнему механизму посредством взаимодействия с «рецепторами смерти» (CD95/Fas, TNF и др) или внутреннему с вовлечением митохондрий. Различные лекарственные формы одного и того же препарата могут индуцировать апоптоз путем активации различных сигнальных механизмов. Наиболее яркий пример — препараты в лекарственной форме лио-филизата для приготовления раствора для инъекций и в липосомальной лекарственной форме [6- 7]. При введении липосомальной лекарственной формы меняются фармакокинетика препарата, время
циркуляции в крови, механизмы взаимодействия и проникновения в клетку [5- 12- 14−17- 24].
Исследования последних лет показывают, что гибель опухолевых клеток, устойчивых к апоп-тозу, может пойти по пути активации неконтролируемой аутофагии [23]. Аутофагия представляет собой процесс, посредством которого самоликвидируются поврежденные органеллы клетки, внутриклеточные патогены, а также долгоживущие, аномальные или агрегированные белки. Основным механизмом процесса является формирование специализированных структур — аутофагосом.
Это двухмембранные липидные образования (пузырьки), которые захватывают органеллы или часть цитозоля, подлежащие разрушению, и расщепляют их с помощью гидролитических ферментов в аутолизосомах, которые образуются за счет слияния аутофагосом с лизосомами.
Влияние липосомальной лекарственной формы препарата на аутофагию еще не изучалось.
16
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ АРАНОЗА НЕ ИНДУЦИРУЕТ.
В связи с этим мы поставили задачу сравнить индукцию аутофагии двумя лекарственными формами противоопухолевого препарата аранозы — производного нитрозомочевины. Этот препарат используется для лечения меланомы и опухолей нейроэн-докринной природы [11- 19−21]. В лаборатории разработки лекарственных форм ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» получены две лекарственные формы аранозы — лиофилизат для приготовления раствора для инъекций (араноза-лио) и липосо-мальная [9- 18]. Ранее было показано, что липосо-мальная араноза не использует CD95/Fas-зависимый внешний путь апоптоза [3- 4- 6- 7- 10].
Целью настоящей работы стало определение влияния липосомальной аранозы на модуляцию аутофагию.
Материалы и методы
Клеточные линии
Использованы клеточные линии диссемини-рованной меланомы человека mel Z, mel Kor, mel Mtp, mel Ibr и Mel Mtp clone X, полученные в НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» [13- 29]. Клеточные линии культивировали на полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ТЭС, HyClone, США) — 2мМ/мл глутамина, 50мг/мл пенициллин-стрептомицина (ПанЭко, Россия) при 37 °C в атмосфере 5%-ного CO2.
Определение уровня экспрессии
мРНК Beclinl
Детекцию экспрессии мРНК Beclin l определяли с помощью ОТ-ПЦР. Для этого клеточные линии mel Z, mel Kor, mel Mtp, mel Ibr и Mel Mtp clone X сажали по 2* 105 клеток на лунку в дуплетах на 6-луночные планшеты в полной среде. Через сутки в лунки с клетками добавляли аранозу-лио в концентрации 450 мкг/мл и липосомальную арано-зу в той же концентрации, инкубировали в течение 24 часов, после чего снимали с планшетов и лизи-ровали, используя реагент TRIzol. Из лизата клеток выделяли тотальную РНК в системе хлороформ-изопропиловый спирт.
Обратную транскрипцию проводили в соответствии со стандартным протоколом [27]. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) по программам: 24 °C — 10 мин, 42 °C — 50 мин и 70 °C — 15 мин. Использовали праймеры для гена Beclinl F: 5'- - AAGACAGAGCGATGGTAG-3'- и R: 5'--CTGGGCTGTGGTAAGTAA-3'- (продукт 282 н.п.): для ?-Actin 5'--GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'- и 5'--CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'- (продукт 460 н.п.). Условия амплификации для Beclin l (26 циклов): предварительная обработка 94 °C 2 мин, денатурация ДНК 94 °C 30 с, отжиг праймеров 62 °C 30 с, элонгация 72 °C 1 мин- для ?-Actin (24 цикла): 94 °C 2 мин, 94 °C 20 с- 60 °C — 20 с- 72 °C -45 с. Продукты амплификации анализировали после электрофореза в 1,5% -ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий в стандартной концентрации. Уровень экспрессии Beclin l оценивали в относительных единицах оптической плотности (o.e.) с помощью программы «ImageJ» по отношению к уровню ?-Actin.
Результаты и обсуждение
Исследование было проведено на 5 клеточных линиях метастатической меланомы человека. В
предварительных исследованиях было показано, что клеточные линии mel Kor и mel Mtp имеют ген B-RAFWT& quot-дикого"- типа a mel Ibr и mel Z — мутант-ный статус B-RaF& quot-600. Клеточная сублиния mel MTP-cloneX на наличие мутаций в гене B-RAF не тестирована.
Анализ модуляции аутофагии проводили после инкубации клеток с препаратами в концентрации 450 мкг/мл в течение 24 ч по изменению количества мРНК гена Beclinl.
Предварительные результаты показали, что выживаемость клеток, инкубированных с аранозой-лио в концентрации 450 мкг/мл, составляет 5076%, тогда как при той же концентрации и инкубации с липосомальной аранозой выживает 3952% клеток (см. таблицу). Наличие мутаций в гене B-RAF не оказывало влияния на цитотоксичность аранозы в обеих лекарственных формах.
Для определения влияния двух лекарственных форм аранозы на процесс аутофагии проводили анализ экспрессии мРНК гена Beclin 1. Белок Beclin 1 (Atg6) стимулирует аутофагию, участвуя в инициации образования аутофагосом.
Базальный уровень мРНК Beclin 1 регистрировали в клетках 4 из 5 исследованных линий меланомы (mel Mtp, mel Ibr, mel Kor, mel Z), его величина варьировала от 0,19 до 0,49 o.e. Линия mel Mtp clone X имела минимальную базальную экспрессию мРНК Beclin 1 (рис. 1), и в дальнейшем не анализировалась.
Способность клеточных линий к индукции аутофагии оценивалась по соотношению уровня мРНК Beclin 1 в условиях 24-часовой инкубации с препаратами аранозы. При соотношении & gt- 1 клеточную линию оценивали как способную к индукции аутофагии.
Араноза-лио блокировала аутофагию на одной из четырех клеточных линий меланомы. Значимое снижение экспрессии гена Beclin 1 наблюдалось только на клеточной линии Mel Z. На клеточных линиях mel Mtp, mel Ibr араноза-лио вызывала статистически незначимую индукцию аутофагии в среднем на 0,1 o.e. (рис. 2, А и Б). Напротив, на клеточной линии mel Kor араноза-лио вызывала незначительное снижение аутофагии (рис. 2, В и Г).
Липосомальная араноза вдвое снижала экспрессию мРНК Beclin 1 по сравнению с контролем на 3 клеточных линиях mel Mtp, mel Z и mel Kor. Только на клетках mel Ibr была отмечена незначительная индукция аутофагии (рис. 2).
Таким образом, использование липосомальной аранозы подавляло аутофагию на клеточных линиях меланомы.
В настоящее время аутофагию большинством исследователей расценивают как стратегия защиты опухолевых клеток от гибели, вызываемой противоопухолевыми препаратами. Выступая в качестве основного механизма удаления поврежденных химиоп-репаратами органелл и белков, аутофагия рассматривается как один из важных путей выживаемости опухолевых клеток. Предполагается, что ее ингибирова-ние приведет к фатальным повреждениям в клетке, и, в конечном итоге, к массовой клеточной гибели.
Аутофагию и апоптоз часто наблюдают в одной клетке, в большей части случаев потому, что аутофагия предшествует ano птозу. Существует несколько молекулярных механизмов, обеспечивающих связь между аутофагией и апоптозом, так как часто они находятся под контролем множества общих сигнальных механизмов, они также могут взаимно регулировать друг друга.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ АРАНОЗА НЕ ИНДУЦИРУЕТ.
17
MelMip
контроль Араноз а-пио Липосомальная контроль Араноза,-л, но Липосомальная ар аыов, а араноз а
Рис. 1. Электрофореграмма изменения уровня ВесНп1 на клеточных линиях ме-ланомы под влиянием аранозы-лио и липосомальной аранозы.
Mel Mtp
0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
И
0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
Контроль Араноза-лио
Mel Kor
Липосомальная араноза
I
Контроль Араноза-лио
Липосомальная араноза
0,50 0,45 0,40 & lt-ц 0,35 ° 0,30 I 0,25
S 0,20
ш 0,15 0,10 0,05 0,00
Mel Mtp clone X
Контроль Араноза-лио Липосомальная
араноза
Mel Ibr
с. Е
S & quot-
к о)
?5 Ш
0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
Контроль
Араноза-лио Липосомальная араноза
0,50
0,45
0,40
Mel Z
I 0,50 j
а. 0,45 --
л 0,40 --
и о, а 0,35 --
X о 0,30 --
о ц с 0,25 --
с к и 0,20 --
m 0,15 --
01 0,10 --
S 0,05 --
с о 0,00 --
Контроль Араноза-лио Липосомальная
араноза
Рис. 2. Изменение экспрессии мРНК Beclin1 под влиянием Аранозы-лио и липосомальной аранозы на клеточных линиях mel Mtp (A), mel Ibr (Б), mel Kor (В), mel Z (Г) и mel Mtp clone X (Д)
Таблица
Модуляция аутофагии на клеточных линиях меланомы при инкубации с Аранозой-лио и липосомальной аранозой
Клеточная линия Статус B-RAF Араноза-лио Липосомальная араноза
Выживаемость клеток, % Изменение экспрессии Beclin 1 Выживаемость клеток, % Изменение экспрессии Beclin 1
Mel Kor B-RAFWT 50 0,9 41 0,6
Mel Mtp B-RAFWT 70 1,4 52 0,3
Mel Ibr B-RAFV600E 76 1,4 40 1,1
Mel Z B-RAFV600E 60 0,4 39 0,5

18 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЛИПОСОМАЛЬНАЯ АРАНОЗА НЕ ИНДУЦИРУЕТ…
Путем аутофагии может быть снижено коли- Заключение чество проапоптотических белков в цитоплазме клетки. На более поздних стадиях с помощью ау- Липосомы доставляют препарат в опухоле-тофагии разрушается эффекторная каспаза-8. Если вые клетки путем эндоцитоза, в результате чего не в клетках все-таки запускается апоптоз, в большин- происходит контакта противоопухолевого препара-стве случаев включаются механизмы ингибирова- та с клеточной мембраной, лекарственное вещество ния аутофагии. Считается, что это необходимо для высвобождается из липосомы внутри клетки. блокирования цитопротекторных функции аутофа- Снижение экспрессии мРНК Beclinl под гии при усилении апоптотических сигналов. Боль- действием липосомальной аранозы может быть шей частью механизмы блокирования включают связано с тем, что препарат вызывает гибель кле-каспаза-зависимое расщепление белков Atg3 и Be- ток, запуская внутренний путь апоптоза, который, в clinl. При определенных условиях активация апоп- свою очередь, подавляет аутофагию. тоза может сопровождаться усилением аутофагии. Изучение способности лизосомальных форм Таким образом, существует тонко регули- препаратов влиять на механизмы аутофагии требу-руемый диалог между аутофагией и апоптозом. ет дополнительного изучения. Молекулярные механизмы, которые контролируют решение запустить один или оба этих процесса в Исследование выполнено при финансовой ответ на специфические стимулы, остаются, в поддержке РФФИ в рамках научного проекта № большей степени, неизвестными. 12−04−33 257 мол, а вед. Литература 1. Барышников А. Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. — 2003. — Т. 4, № 3. — С. 127−30. 2. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // Российский онкологический журнал. — 1996. -№ 1. — С. 58. 3. БарышниковаМ.А., Грищенко Н. Б., Борова О. С. и др. Роль CD95/Fas рецептора в индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами // Российский биотерапевтическии журнал. — 2014. — Т. 13, № 3. — С. 3−8. 4. Барышникова М. А., Грищенко Н. Б., Полозкова А. П. Влияние лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13, № 1. — С. 64. 5. Барышникова М. А., Зангиева М., Барышников А. Ю. Взаимодействие липидных капсул с клеткой // Российский биотерапевтический журнал. — 2013. — Т. 12, № 1. — С. 11−5. 6. Грищенко Н. Б., Барышникова М. А., Полозкова А. П. и др. Липосомальные противоопухолевые препараты не используют CD95-зависимый сигнальный путь апоптоза // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13, № 1. — С. 37−42. 7. Грищенко Н. Б., Алъбассит Б., Барышникова М. А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13, № 1. — С. 49−54. 8. Ковалева О. В., ШитоваМ.С., Збаровская И. Б. Аутофагия: клеточная гибель или способ выживания? // Клиническая онкогематология. — 2014. — Т. 7, № 2. — С. 103−13. 9. Козеев С. Г., Барышникова М. А., Полозкова А. П., Оборотова Н. А. Разработка наноструктурированной лекарственной формы арано-зы//Российский биотерапевтический журнал. — 2012. — Т. 11, № 2. — С. 24. 10. Козеев С. Г., Барышникова М. А., Афанасьева Д. А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы // Российский биотерапевтический журнал. — 2012. — Т. 11, № 2. — С. 24. 11. Лихванцева В. Г., Оборотова Н. А., Когония Л. М. и др. Первый опыт применения аранозы в лечении увеальных меланом // Российский биотерапевтический журнал. — 2005. — Т. 4, № 3. — С. 34−9. 12. Матюшин А. А., БарышниковаМ.А., Барышников А. Ю., Караулов А. В. Липосомы: организм, опухоль, клетка // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. — 2013. — Т. 17, № 6. — С. 3−10. 13. Михайлова И. Н., Лукашина М. И., Барышников А. Ю. и др. Клеточные линии меланомы — основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. — 2005. — № 7. — С. 37−40. 14. Оборотова Н. А. Липосомальные лекарственные формы противоопухолевых препаратов (обзор) //Химико-фармацевтический журнал. — 2001. — Т. 35, № 5. — С. 30. 15. Оборотова Н. А., Барышников А. Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. — 2009. — Т. 121, № 5. — С. 464. 16. Оборотова Н. А. Направленная доставка противоопухолевых препаратов // Антибиотики и химиотерапия — 1991. — Т. 36, № 10. — С. 47. 17. Оборотова Н. А., Санарова Е. В. Роль новых фармацевтических технологий в повышении избирательности действия противоопухолевых препаратов// Российский химический журнал. — 2012. — № 3−4. — С. 33−40. 18. Оборотова Н. А., Лопатин П. В. 30 лет лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН // Российский биотерапевтический журнал. — 2004. — Т. 3, № 4. — С. 3−7. 19. Полозкова С. А., ОрелН.Ф., Маркович А. А., Горбунова В. А. Химиотерапия аранозой в монорежиме и в комбинации с другими препаратами метастатических нейроэндокринных опухолей // Российский биотерапевтический журнал. — 2012. — Т. 11, № 2. — С. 42. 20. Полозкова С. А., Горбунова Б. А., Орел Н. Ф., Маркович А. А. Клиническии опыт применения аранозы в режиме монотерапии и в комбинации с капецитабином, темозоломидом и доксорубицином при метастатических нейроэндокринных опухолях // Российский биотерапевтический журнал. — 2013. — Т. 12. — № 2. — С. 67. 21. Полозкова С. А., Степанова Е. В., Барышников А. Ю. и др. Экспрессия MGMT в опухолевой ткани при лечении пациентов с нейроэкте-дермальными опухолями режимами на основе аранозы // Российский биотерапевтический журнал. — 2013. — Т. 12, № 4. — С. 21−6. 22. Рыжов С. В., Новиков В. В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Российский биотерапевтический журнал. — 2002. -Т. 1, № 1. — С. 27−33. 23. Рябая О. О., Ць1гановаИ.Б., Сидорова Т. Н. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена B-RAF на способность клеток меланомы к аутофагии // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. — 2013. — № 3. — С. 68−72. 24. Толчева Е. В., Оборотова Н. А. Липосомы как транспортное средство для доставки биологически активных молекул // Российский биотерапевтический журнал. — 2006. — Т. 5, № 1. — С. 54−61. 25. Baryshnikov A. Yu., Polosukhina E.R. Tupitsin N.N. et al. CD95 (Fas/APO-1) antigen is a new prognostic marker of blast cells of acute lymphoblastic leukaemia patients / Book Editor (s): Kaspers, GJL- Pieters, R- Veerman, AJP. Drug Resistence in Leukemia and Lymphoma III Book Series: Advances in Experimental Medicine and Biology? 1999. — 457 — P. 251−8. 26. Baryshnikov A. Yu., Polosukhina E.R., Zabotina T.N. et al. FAS (APO-1/CD95) antigen: new activation marker for evaluation of the immune status // Russian Immunological J.- 1997. — 2(2). — P. 115. 27. Deng R., Li W., Guan Z. et al. Acetylcholinesterase expression mediated by c-Jun-NH2-terminal kinase pathway during anticancer drug-induced apoptosis // Oncogene. — 2006. — 25. — P. 7070−7. 28. Galuzzi L., Vitale I., Abrams J.M. et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012 // Cell Death Differ. — 2012. — 19(1). — P. 107−20. 29. Michailova I.N., Morozova L. Ph., Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines // Melanoma Research. -2008. — № 5. — P. 303−13. 30. Polosukhina E.R., Zabotina T.N., Shishkin Yu.V. et al. Studing of Fas (APO-1/CD95) antigen expression by flow cytometry with monoclonal antibodies IPO-4 // Experimental Oncology. — 1997. — 19(3). — P. 206−11. 31. Polosukhina E.R., Baryshnikov A. Yu., Shishkin Yu.V. et al. Expression of antigen CD95(Fas/APO-1) medisting apoptosis in hemoblastosis using monoclonal antibodies ICO-160 // Hematology and transfusiology. — 2000. — 45(4). — P. 3−6. 32. Sokolovskaya A.A., Zabotina T.N., Blokhin D. Yu. et al. CD95-dificient cells of Jurkat/A4 subline are resistant to drug-induced apoptosis // Experimental Oncology. — 2001. — 23(3). — P. 175−81. 33. Vartanian AA., Burova O.S., Stepanova E. V. et al. The involement of apoptosis in melanoma vasculoggenic mimicry // Melanoma Research. — 2007. — 11(1). — P. 1−8. 34. Vartanian A.A., Baryshnikov A. Yu. Crosstalk between apoptosis and antioxidants in melanoma vasculogenic mimicry // Advances in Experimental Medicine and Biology. — 2007. — 601. — P. 145−53. 35. Wong R.S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment // J/Exp Clin Cancer Res. — 2011. — 26.- P. 30−87.
№ 1/tom 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой