Ингибитор клеточного белка р53 позитивно регулирует цитотоксичность онколитического вектора в клетках глиобластомы

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 616−006. 831−085. 2/. 3:578. 826:576. 533
И.В. Уласов1, Н.В. Каверина2, А.Ю. Барышников2 ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53 ПОЗИТИВНО РЕГУЛИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВЕКТОРА В КЛЕТКАХ ГЛИОБЛАСТОМЫ
1 Центр опухолей головного мозга, Шведский медицинский центр, Сиэтл, США 2ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им H.H. Блохина», Москва
Контактная информация
Уласов Илья Валентинович, к.б.н., ведущий сотрудник центра лечения опухолей головного мозга адрес: 550 17th Avenue, suite 570, Seattle, Wa, 98 122, USA- тел. +1−206−991−2053 e-mail: ulasov75@Yahoo. com
Статья поступила 03. 10. 2014, принята к печати 24. 11. 2014.
Резюме
Резистентность мультиформных глиобластом требует создания новых подходов для терапии опухолей головного мозга. Белок Р53 — один из главных клеточных онкогенов, чья экспрессия увеличена в 50% клеток глиобластом. Эффект ингибитора Р53 был изучен в присутствии онколитического аденовируса, и темодала, демонстрирующих противоопухолевый эффект на глиобластомных моделях. В клетках U87 глиобластомы человека мы обнаружили аддитивный эффект между ингибированием Р53, активностью аденовирусного вектора и противоопухолевой активностью алкилирующег о химиопрепарата темодал, выражающийся в увеличенной опухолевой токсичности. Оказалось, что ингибирование Р53 химическим реагентом PFTa вызывает активацию аутофагии, одного из вариантов клеточной смерти. Таким образом, данная терапевтическая комбинация может представлять один из возможных способов увеличения противоопухолевого эффекта онколитического вируса.
Ключевые слова: аденовирус, P53, аутофагия, пролиферация.
I.V. Ulasov1'-2, N.V. Kaverina2 andA. Yu. Baryshnikov2 SUPPRESSION OF CELLULAR P53 PROMOTES CYTOTOXICITY OF ONCOLYTIC VECTOR AT THE MODELS OF HUMAN GLIOBLASTOMA
1The Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Medial Center, Seattle, USA
2FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow, Russia
Abstract
Glioblastoma multiforme resistance requires a new approach for glioma therapy. Protein p53 is one of the main cellular oncogene, overexpressed in 50% of brain tumor cases. Impact of p53 attenuation was evaluated in the presence of oncolytic adenovirus and temodar, which exhibit anti-glioma effect using in vitro glioma models. Using U87 human glioma cells we observed an additive effect between alkilated chemotherapeutic agent temodar and oncolytic adenovirus which results into p53 inhibition. It occurs that attenuation of p53 using PFTa inhibitor, significantly prolongs cell death type II- autophagy and, therefore improves effect mediated by autophagy induced agents. In conclusion, combination of PFTa and temodar might represent a powerful therapeutic combination which sensibilises glioma cells to the infection with oncolytic vector.
Key words: adenovirus, p53, autophagy, proliferation.
Введение
Глиобластома является самой распространенной формой опухолей ЦНС [1- 2- 4]. В последние годы произошел существенный прогресс в понимании механизма резистентности глиом к текущей терапии. Так, недавние исследования, проведенные группой Galvin-Burgess, показали, что глиобластомы представляют собой гетерогенную популяцию клеток, имеющих различный фенотип [6]. Одной из таких фенотипических характеристик является активация генетических программ, регулирующих клеточные сигнальные пути, такие как ангиогенез и клеточное деление. Клеточный белок Р53 относится к группе белков, регулирующих клеточный гомеостаз [7].
Химиотерапия — один из видов противоопухолевой терапии, применяемой в лечении глиобластом. Несмотря на широкое применение, отсутствие селективности по отношению к опухолевым клеткам снижает эффективность терапевтических
интервенций и влияет на выживаемость пациентов. Похожая проблема ассоциирована с препаратом направленного действия против клеточного белка Р53. Оказалось, что, несмотря на сниженную способность химических ингибиторов белка Р53 проникать через гипоталамо-гипофизарный барьер, продолжительный курс химиотерапии с использованием Р53-ингибитора повышал противоопухолевый эффект.
Таким образом, ведется поиск новых терапевтических путей, повышающих эффективность химиотерапии и снижающих побочный токсический эффект по отношению к здоровым клеткам.
Комбинирование химиотерапии с терапией онколитическими векторами является одним из методов, который нашел свое экспериментальное подтверждение в противоопухолевой терапии. В настоящее время в мире созданы несколько прототипов генно-инженерных вакцин на основе ОН-ВИР, имеющих ограниченную репликацию в нормальных клетках, но способных вызывать клеточ-

26 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53…
ную смерть клеток-мишеней [S- 9]. Так, одной из было добавлено к каждой лунке для дальнейшей таких конструкций является вектор CRAd-s-pK7, инкубации. Спустя 4 ч после инкубации при 5% который эффективно инфицировал клетки глиобла- CO2 при +37 °C, к каждой лунке добавили G, l мл стом и вызывал токсичность, ассоциированную с ДМСО для ингибирования метаболической реак-развитием как апоптоза, так и аутофагии. Высокая ции и разрушения формазана активно делящимися продукция вирусных частиц инфицированной клет- клетками. кой способствовала терапевтическому эффекту на Оптическое поглощение было измерено при неопластических клетках. X 54G нм. Жизнеспособность клеток определяли по Целью настоящей работы являлось изуче- исключению красителя трипанового синего (Fisher ние терапевтического эффекта между онколитиче- Scientific США). ским вирусом, темодалом и ингибированием Р53. Цитологический метод Материалы и методы окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК Клетки и клеточные линии TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-Эмбриональные клетки почки эмбриона че- mediated dUTP nick end labeling) был произведен co-ловека HEK293, человеческие клетки глиобласто- гласно рекомендациям фирмы-производителя Roche мы NlG и US7, и клетки аденокарциномы человека (США) для набора In situ cell death Detection kit. A549 были получены из японской (Tokyo, Япония) и американской коллекции клеточных линий Анализ экспрессии белков (ATCC, Manassas, VA). с помощью вестерн блоттинга Клетки были выращены в Дульбеко модифи- Клетки, выращенные в 6-луночном планше-цированной среде Игла (DMEM- Life Technologies), те, были затем обработаны темодалом, инфициро-содержащей lG % ТЭС (фетальной бычьей сыво- ваны онколитическим вирусом CRAd-S-pK7 (5 ротки) -GIBCO-Life Technologies, США), 2 mM L- IU/мл), или в комбинации темодал-ОНВИР в при-глутамиш, lGG IU/мл пенициллиш, 5G IU/мл сутствии или отсутствии ингибитора PFTa. Через стрептомициш (Invitrogen, США). Клетки культи- 72 ч после начала эксперимента клетки были лизи-вировали при температуре +37 °С в присутствии рованы в буфере, содержащем 5GmM HEPES- G, l5 5% C02. M NaCl, G, 5%-ный Nonidet P-4G и смесь протеи- назных ингибиторов. Белковые фракции были ис-Реагенты следованы в lG %-ном ПААГ-геле и перенесены на Темодал (Temozolomide), ингибитор клеточ- поливинилидин дифлуорид мембрану (PVDF, Bio-ного Р53 (PFTalpha), 2%-ный водный раствор AO и Rad, США). Мембраны были проинкубированы с PI, l мг/мл были получены из компании Sigma- первичными антителами P53 (клон DO-l), ElA Aldrich (США). (клон M5S) и Актин (клон с-2), указанные антитела В качестве растворителя для темодара и ин- были получены из компании Santa Cruz Biotech-гибитора Р53 использовали ДМСО с целью полу- nology (Техас, США). чения lGG^M раствора темодала [lG] и 2GmM рас- Связанные первичные антитела были детек-твора PFTa (lGGG* раствор, [ll]). тированы со вторичными антителами, конъюгиро- ванными с пероксидазой хрена Santa Cruz Вирусные вектора Biotechnology (Техас, США). Детекция белковых Постоянно реплицирующийся компетентный фракций была произведена с помощью реакции аденовектор CRAd-S-pK7 был получен путем гомо- хемилюминесценции согласно инструкции (Bio-логической рекомбинации с SpeI-обработанной Rad, Hercules, Калифорния, США). плазмидой, кодирующей полноразмерный геном аденовируса, содержащего 7 аминокислотных ос- Определение клеточного деления татков полилизина, вклонированных в С- и аутофагии терминальный конец гена полноразмерного белка с помощью иммунофлуоцитометрии фибера типа 2 аденовирусов, с El-pSurvivin шаттл Анализ клеточного деления был проведен с плазмидой. Вирусная конструкция была получена использованием АО или PI. Клетки, обработанные путем трансфекции клеток HEK293 плазмидой. темодаром, инфицированные онколитическим ви-CRAd-S-pK7-BHpyc был наработан в клетках A549 русом CRAd-S-pK7 (5 IU/мл), или в комбинации и тестирован с использованием Adeno Titer X kit темодал-ОНВИР в присутствии или отсутствии (Clontech, Mountain View, Ca, USA). ингибитора PFTa были центрифугированы. Затем часть клеточного осадка была дважды Тест для определения пролиферации промыта в фосфатно-солевом буфере и зафиксиро-клеток (MTT-mecm) вана в 7G %-ном этаноле перед окраской PI (5G Опухолевые клетки культивировали при mg/мл) на 4 ч. Вторая часть осадка была окрашена температуре +37 °С в присутствии 5% С02 в среде раствором АО. ДМЕМ, содержащей 2 мМ L-глутамина и lG % ТЭС Анализ распределения клеток по фазам кле-(«Atlanta Bio», Atlanta, США). Клетки, достигшие точного деления был осуществлен с помощью про-логарифмической фазы роста, пассировали в плос- точной цитофлуориметрии. Данные была получены кодонные 96-луночные микропланшеты («Costar», после анализа lG GGG клеточных событий. США) по 5 GGG — 6 GGG клеток на лунку и инкубировали в указанных выше условиях в течение 24 ч Статистический анализ перед добавлением тестируемого вещества. Результаты представлены в виде стандартно-Для определения цитотоксичности клеточ- го значения ± стандартное отклонение. Статистиче-ные линии были инфицированы CRAd-S-pK7- ский анализ был выполнен с использованием теста вектором в разной множественности инфекции. Стьюдента (SPSS l3. G программа, Чикаго, Илли-Через 72 ч после инфекции 2GG микролитров нойс, США). Разница меньше G, G5 означала суще-МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Ственное различие.
№ l/том l4/2Gl5 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

Рис. 1. Вестерн блоттннг анализ экспрессии белка Р53 в клеточных лизатах и87 и N10 глиобластом человека в условиях нормального роста клеток и после облучения ионизирующим излучением.
Рис. 2. Влияние индукции клеточного белка P53 на клеточную токсичность:
Б — белковые фракции клеток глиомы человека U87, инфицированных ОНВИР, обработанных темодалом, или комбинацией ОНВИР+темодал, были проанализированы с помощью вестерн-блотта с антителами к Актину, P53 и аденовирусной области Е1А белка (клон М58).
Контроль
Темодар
ОБ
ОВ+Темодар
•jL
О §
111
0 к
? (c)
т S
1
J g1 75.7 s 14.3 g2/m 10. 0

g1 70s 4S- f1 g1 10. 2
s э.1 s 21. 3
g2/m 20 I g2/m as. о
I 11 ДМСО
tf g1 13.8 g1 62. 1
[1 s 16.4 JM- s 12. 9
g2/m69 7 g2/m25. 0
А Ы / ¦fck^
PFTa
ингибирование
Пропидиум Иодид (ДНК)
##
ДМСО?
ш!
12 3 4 #
PFTa
Ш
G1 S
G2/M
100!
о о
т
о ^
о
60
40-
20
1 2 3
1МСО ] PFTa
ж
*
I
1
1 ?11 ill i
Темодар OB ОВ+Темодар.
О
X
Jj
т

05
о с
о & lt-
ч-
о
чР
100 80 60 40 20
##
JMCO 1 PFTa
Г
л
#
*
-Л к
Теиодар О В ОВ+Темодар
Рис. 3. Ингибирование клеточного Р53 повышает чувствительность опухолевых клеток к терапии темодалом в комбинации с ОНВИР:
А — распределения клеточных популяций по фазам клеточного деления в присутствии ингибитора Р53- Б — график анализа клеточной пролиферации после обработки клеток ингибитором Р53 в присутствии ОНВИР и темодала, & quot- # & quot-и & quot-##"- р& lt-0,05- В — повышение уровня аутофагии в клетках после обработки ингибитором Р53 в присутствии ОНВИР и темодала-
Г — трипан+ клетки в образцах с ингибитором Р53, обработанных темодалом и ОНВИР. & quot-*"-, & quot-**"-, & quot-***"- р& lt-0,05 в сравнении с ДМСО обработанными образцами, & quot-#"- и & quot-##"- в сравнении с темодалом и ОНВИР обработанными образцами.
28
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53.
Результаты и обсуждение
Функциональная характеристика клеточного Р53
Эксперимент по индукции экспрессии белка Р53 в модификации [3- 12] проводили в частоте 020 Грей [3- 12]. Клетки были собраны для анализа экспрессии белка через 24 и 48 ч после облучения ионизирующей радиацией. На рис. 1 показано, что ионизирующее излучение увеличивало экспрессию Р53 только в клетках опухоли головного мозга N10, но не в клетках опухоли и87. Полученные результаты согласуются с данными литературы [3] и свидетельствуют об отсутствии в этих клетках Р53 & quot-дикого"- типа. В то же самое время, ионизирующее излучение вызывало индукцию Р53 в клетках N10, что свидетельствует о мутантном типе гена Р53. По данным литературы, увеличение Р53 в клетках гли-областом и87 не приводило к возрастанию белка Р21, для которого Р53 является индуцирующим регулятором клеточного деления [5].
Комбинация
терапевтических подходов вызывает активацию клеточного Р53 Наши предыдущие исследования показывают, что присутствие Р53 снижает эффективность виротерапии с использованием СЯА8-рК7 вектора [10]. Более того, наши недавние предварительные результаты позволяют предположить, что Р53 также негативно влияет на активность темодала, нашедшего широкое применение в клинической практике при лечении глиобластом человека. Поскольку наша рабочая гипотеза позволяет предположить, что экспрессия Р53 препятствует антигли-омному эффекту СКА^-рК7-вектора и темодала, мы ингибировали экспрессию Р53 в клетках глиоб-ластомы человека и87 с помощью химического ингибитора РБТа1рЬа.
Мы обрабатывали клетки, содержащие Р53 & quot-дикого типа& quot-, темодалом, или ОНВИР рК7, или их комбинацией (темодал+ОНВИР). Через 72 ч клетки окрашивали с помощью ТЦЫЕЬ и определяли число СЯА^-рК7-клеток по цитоплаз-матическому окрашиванию аденовирусных белков области Е1А (рис. 2А- см. вклейку). Оказалось, что комбинация темодал+ОНВИР существенно увеличивала количество поврежденных клеток глиобла-стомы по сравнению с обработкой темодалом или ОНВИР по отдельности.
Более того, высокий уровень токсичности соответствовал высокому уровню Р53 в этих клетках (рис. 2, Б).
Поскольку функциями клеточного белка Р53 являются транскрипционная регуляция клеточного цикла и контроль за клеточной реакцией на повреждение ДНК, мы предположили, что ингибирова-ние Р53 может усилить цитотоксическую реакцию в клетках глиобластомы и87.
Ингибирование Р53
повышает активность ОНВИР
и темодала
Как оказалось, в соответствии с нашей гипотезой ингибирование клеточного Р53 не нарушало деления клеток и87 (рис. 3, А). При этом оказалось, что ингибирование Р53 усиливало эффект темодала, ОНВИР и комбинации темодал+ОНВИР, что выражалось в накоплении клеток в состоянии С2- и М-фаз клеточного цикла (рис. 3, Б). Чтобы определить, привело ли нарушение клеточного деления ингибитором Р53 к клеточной смерти, мы пронализировали клетки в реакции клеточной пролиферации. Как оказалось, ингибирование Р53 также приводило к нарушению клеточной пролиферации.
По нашим данным, в среднем в 2−3 раза по отношению к клеткам, обработанным ДМСО, ингибирование Р53 усиливало активность темодала (с 25,2 до 55,8%), ОНВИР (с 18,2 до 49,4%) и их комбинации (с 24,1 до 63,8%, р& lt-0,05- рис. 3, Б).
По результатам наших исследований, увеличение клеточной токсичности при применении темодала привело к активации аутофагии. Поскольку активация аутофагии может служить как защитным механизмом, так и механизмом клеточной смерти, с целью детекции аутофагосом с двойной мембраной мы окрасили клетки с помощью акридина оранжевого. Как и ожидалось, ингибирование Р53 приводило к увеличению числа акридин+ клеток (рис. 3, В). Более того, результаты окрашивания трипановым синим показали, что ингибирование пролиферации клеток РБТа приводило к клеточной смерти (рис. 3, Г). В этом случае, увеличение аутофагии в клетках и87 также сопровождалось арестом клеточного деления и накоплением клеток в С2/М фазе клеточного цикла.
Заключение
Таким образом, впервые показано, что ингибирование клеточного белка Р53 увеличивает не только токсичность онколитического аденовируса и темодара, но терапевтический эффект их комбинации. Полученные данные подтверждают существенную роль белка Р53 в регуляции клеточного ответа на внешние стимулы и воздействие химиоп-репаратов в комбинации с аденовирусом.
Литература
1. Уласов И. В., Каверина Н. В., Кадагидзе З. Г., Барышников А. Ю. Антиглиомная аденовирусная виротерапня: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13, № 2. — С. 11−8.
2. Уласов И. В., Тусон А., Барышников А. Ю. Белок фибера аденовируса человека обеспечивает стабильность вирусных капсидов // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13, № 2. — С. 51−5.
3. Badie B., Goh C.S., Klaver J., Herweijer H., Boothman D.A. Combined radiation and p53 gene therapy of malignant glioma cells //Cancer Gene Ther. — 1999. — 6. — P. 155−62.
4. Bao S., Wu Q., McLendon R.E. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response // Nature. — 2006. — 444. — P. 756−60.
5. el-Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E. et al. WAF1 a potential mediator of p53 tumor suppression // Cell. — 1993. — 75. — P. 817−25.
6. Galvin-Burgess K.E., Travis E.D., Pierson K.E., Vivian J.L. TGF-beta-superfamily signaling regulates embryonic stem cell heterogeneity: self-renewal as a dynamic and regulated equilibrium // Stem Cells. — 2013. — 31. — P. 48−58.
7. Kremenetskaya O.S., LogachevaN.P., Baryshnikov A. Yu. et al. Distinct effects of various p53 mutants on differentiation and viability of human K562 leukemia cells // Oncology Research. — 1997. — 9. — P. 155−66
8. UlasovI.V., TylerM.A., RiveraA.A. et al. Evaluation of E1A double mutant oncolytic… // J Med Virol. — 2008. — 80. — P. 1595−603.
9. Ulasov I.V., Zhu Z.B., Tyler M.A. et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma // Hum Gene Ther. — 2007. — 18. — P. 589−602.
10. Ulasov I.V., Sonabend A.M., Nandi S. et al. Combination of adenoviral virotherapy and temozolomide chemotherapy eradicates malignant glioma through autophagic and apoptotic cell death in vivo // Br J Cancer. — 2009. — 100. — P. 1154−64.
11. Xu G.W., Mymryk J.S., Cairncross J.G. Pharmaceutical-mediated inactivation of p53 sensitizes U87MG glioma cells to BCNU and temozolomide // Int J Cancer. — 2005. — 116. — P. 187−92.
12. Yamashita K., Nakashima S., You F. et al. Overexpression of immediate early gene X-1 (IEX-1) enhances gamma-radiation-induced apoptosis of human glioma cell line, U87-MG. // Neuropathology. — 2009. — 29. — P. 20−4.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой