Использование ВЭЖХ-масс-спектрометрии в анализе биологически активных веществ из морских источников

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Экономические науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
В.И. Высоцкий*, В. Г. Рыбин, О.Ю. Слабко*, Г. А. Вербицкий*, Д. В. Куклев (ТИНРО-центр, * Институт химии и прикладной экологии ДВГУ)
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЭЖХ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В АНАЛИЗЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ МОРСКИХ ИСТОЧНИКОВ
Одним из наиболее активно развивающихся методов анализа биологически активных веществ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (Matissek, Wittkowski, 1990- Katz, 1996). Основное преимущество метода ВЭЖХ — возможность анализа широкого класса соединений без их предварительной модификации, что является необходимым шагом, например, при газовой хроматографии. В течение последних 20 лет метод ВЭЖХ стал применяться во многих областях химии, а для биохимиков ВЭЖХ — один из основных методов исследований. К настоящему времени жидкостные хроматографы оснащаются широким спектром детекторов, среди которых наибольшее распространение получили ультрафиолетовый, рефрактометрический и флюориметрический
(Christie, 1992).
В последнее время в практику химических и биохимических исследований все активнее вовлекается ВЭЖХ-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-MC) (Энгельгардт, 1980). Приборное оформление этого метода может быть различным. Основной проблемой в течение длительного времени было непосредственное соединение жидкостного хроматографа высокого давления с масс-спектрометром (масс-селективным детектором). Это объясняется тем, что количество элюента при ВЭЖХ так велико, что с ним не может справиться обычная вакуумная система. При скорости расхода элюента 1 мл/мин образуется (при нормальных условиях) 4 501 200 мл/мин пара, в то время как для современных масс-спектрометрических вакуумных систем допустимые количества (при нормальных условиях) составляют 1−20 мл/мин. Указанная проблема удовлетворительно решалась различными способами, например щелевой сепарацией паров, послеколоночным делением потока либо обогатительными системами (транспортный детектор) (Энгельгардт, 1980).
В настоящее время эта проблема успешно решается в приборно-реализованных инструментах, например Agilent 1100 MSD (& quot-Hewllet Packard& quot-, США). Принцип действия механизма отделения элюата от растворителя состоит в его распылении и обдуве азотом при высокой температуре (250−300 оС). Прибор комплектуется двумя типами ионизационных камер: для химической ионизации при атмосферном давлении
52
(ХИАД) и для электроспрея (ЭС). В первом случае (ХИАД) распыленный элюат в горячей азотной атмосфере попадает в зону коронного разряда, где ионизированные молекулы азота ионизируют молекулы растворителя элюата в газовой фазе, которые в свою очередь ионизируют молекулы анализируемого вещества (Wachs et al., 1991). Во втором случае (ЭС) распыленный элюат в горячей азотной атмосфере попадает в зону высокого потенциала, где происходят интенсивное дробление капелек при превышении релеевского радиуса плотности заряда и ионизация при столкновении молекул растворителя с анализируемым веществом (Gaskell, 1997). Образовавшиеся в обоих случаях ионы подаются на ионную оптику масс-спектрометра через капилляр с приложенным на него потенциалом (ионный сепаратор) и далее на квадруполь, где и происходит масс-детекция.
Применимость описанных методов мягкой ионизации в настоящее время активно изучается, однако, как правило, авторы статей и обзоров в научной литературе ограничиваются каким-либо одним классом соединений, например флавоноидами (Justesen et al., 1998) или экдистеро-идами (Bathori, 1998).
Целью настоящей работы было исследование применимости ВЭЖХ-МС к анализу широкого круга низкомолекулярных биорегуляторов, полученных из различных природных (в основном морских) объектов и из их производных. Основная часть аналитической работы выполнена в Научно-образовательном центре Института химии и прикладной экологии Дальневосточного государственного университета и Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (г. Владивосток).
Описание метода
Все эксперименты проводили на ВЭЖХ-МС системе Agilent MSD 1100 (& quot-Hewlett Packard& quot-, США) в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД).
Ток азота (газ-осушитель) составлял 6 л/мин при работе в режиме регистрации положительных ионов (ХИАД+) и 3 л/мин при работе в режиме регистрации отрицательных ионов (ХИАД-), температура азота 300 oC (в обоих случаях). Напряжение на капилляре в режиме регистрации положительных ионов 4000 В и 2500 В — при работе в режиме регистрации отрицательных ионов. Напряжение на фрагменторе 100 В (другое указывается в конкретном случае). Напряжение коронного разряда 2500 В. Диапазон регистрируемых m/z составлял от 180 до 1000, в зависимости от природы используемого растворителя, например, для метанола — от 105, для ацетонитрила — от 140, для пропанола-2 — от 180.
Детектор на диодной матрице работал в режиме регистрации поглощения при длинах волн от 200 до 700 нм с разрешением 2−4 нм.
В работе использовалась колонка Shim-Pack FLC-ODS (4,6×5,0 мм, 3 мкм, 5600 тт- & quot-Shimadzu"-, Япония) и водно-метанольные, водно-ацето-нитрильные и водно-изопропанольные смеси как подвижные фазы, при скорости потока 0,3−0,5 мл/мин и температуре колонки 55 oC.
Результаты ВЭЖХ-масс-спектрометрического исследования
Каротиноиды
Исследовались растительные каротиноиды и каротиноиды морского ежа Strongylocentrotus nudus.
а- и p-каротины из 100 г корней Daucus carota экстрагировали 500 мл гексана, как описано ранее (Khachik et al., 1988). Г ексановый экстракт сушили над безводным Na2SO4, упаривали в вакууме и очищали сухой остаток хроматографией на 10 г силикагеля (элюэнт — я-гексан). Фракции, содержащие каротиноиды, объединяли, концентрировали до объёма 5 мл в вакууме и аликвоту анализировали ВЭЖХ-МС.
Каротиноиды морского ежа Strongylocentrotus nudus извлекали по следующей методике. 980 мг липидов гонад морских ежей смешивали с 0,5 мл 10% -ного водного раствора KOH и 10 мл этилового спирта. Смесь кипятили с обратным холодильником до полного растворения липидов (если полного растворения не происходило, то добавляли еще 10 мл спирта и продолжали нагревание). После этого к раствору добавляли 10 мл спирта, 20 мл воды и 25 мл диэтилового эфира, тщательно перемешивали, после чего эфирный слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли 3 раза, эфирные фракции объединяли, сушили над безводным Na2SO4 и упаривали в вакууме. Получали 28 мг неомыляемой фракции, перерастворяли в 5 мл ацетонитрила и аликвоту анализировали ВЭЖХ-МС.
Длинная цепь сопряженных двойных связей способствует увеличению устойчивости ионизированной молекулы каротиноида, что можно наблюдать на масс-спектре эхиненона (рис. 1). Данный каротиноид, благодаря наличию кето-группы, легко образует устойчивый квазимолеку-лярный ион состава [M+H]+. Масс-спектр p-каротина отличался от спектра эхиненона не только значительно низкой относительной интенсивностью (50%) квазимолекулярного иона состава [M+H]+, но и значительно более слабым сигналом полного ионного тока (10 мА, по сравнению с эхиненоном — 250 мА), при том что площадь хроматографического пика p-каротина при детекции в УФ-диапазоне при длине волны 455 нм (область максимума поглощения p-каротина и эхиненона) была немного меньше (не более чем на 5%), чем у эхиненона. Этот факт свидетельствует о гораздо более слабой степени ионизации углеводородов по сравнению с их монокислородсодержащими аналогами. Мы полагаем, что при анализе природных смесей, содержащих широкий спектр каро-тиноидов, в том числе и углеводороды, необходимо учитывать факт слабой ионизации последних и для их точной идентификации в сложных смесях проводить дополнительную пробоподготовку, направленную на концентрирование именно углеводородных представителей каротиноидов.
551.4 [М + Н] +
100
Рис. 1. Масс-спектр эхиненона
F ig. 1. Mass-
spectrum of echinenone
U
O
X
o
¦**
400
¦**--------
700 mh
200
300
600
Масс-спектр эхиненона (рис. 1) регистрировался в режиме ХИАД (+) и характеризовался наличием основного сигнала иона [ M+H]+ (m/z 551), интенсивность которого составляла 100%, и сигналов ионов неизвестного происхождения с величиной m/z, большей, чем 551 с интенсивностью (5−10%). Масс-спектры а- и в-каротинов отличались от масс-спектра эхиненона сравнительно небольшой интенсивностью (около 50%) сигнала протонированного молекулярного иона m/z 537.
Жирные кислоты и их производные
Высокочистые препараты свободных жирных кислот (табл. 1), а также их метиловых эфиров и этаноламидов, полученные, как описано ранее (Модифицированные жирные кислоты, 1997), анализировались ВЭЖХ-МС с использованием подвижной фазы ацетонитрил-вода (80: 20) в режиме регистрации отрицательных ионов (свободные жирные кислоты) и положительных ионов (метиловые эфиры и этаноламиды).
Таблица 1
Основные ионы, наблюдаемые в масс-спектрах жирных кислот и их производных
Table 1
The primary ions observed in the mass-spectra of fatty acids and their derivatives
Полиненасыщенная жирная кислота Ионы с относительной интенсивностью Свободная кислота Метиловый эфир [m-h]- [m+h]+ 100% Этаноламид [m+h]+
18: 3ю3 277 293 322
18: 4ю6 275 291 320
18: 5ю3 273 289 318
20: 4ю6 303 319 348
20: 5w3 301 317 346
22: 5ю6 329 345 374
22: 6ю3 327 343 372
Примечание. 18: 3ю3 — а-линоленовая кислота. 18: 4ю6 — 32,62,92,122-октадекатетраеновая кислота (ОДТК). 18: 5ю3 — 32,62,92,122,152-октадека-пентаеновая кислота (ОДПК). 20: 4ю6 — 52,82,112,142-эйкозатетраеновая кислота, арахидоновая кислота (АК). 20: 5ю3 — 52,82,112,142,172-эйкозапентае-новая кислота (ЭПК). 22: 5ю6 — 42,72,102,132,162-докозапентаеновая кислота (ю6-ДПК). 22: 6ю3 — 42,72,102,132,162,192-докозагексаеновая кислота (ДГК).
Жирные кислоты и их производные имеют в своих структурах как электронно-донорные, так и электронно-акцепторные группы, что обусловливает образование не только положительных, но и отрицательных ионов в режиме ХИАД. Результаты проведенных исследований показали, что в случае наличия свободной карбоксильной группы акцепторный фактор превалирует над донорным, поэтому анализ данного класса соединений (карбоновые кислоты) предпочтительнее проводить в режиме регистрации отрицательных ионов. В случае ХИАД жирных кислот, модифицированных по карбоксильной группе (иод-лактоны, сложные эфиры, этаноламиды), происходит преимущественное образование положительных ионов состава [М+Н]+, что обусловливается доминированием донорного фактора над акцепторным. Это обстоятельство предопределяет проведение анализа указанных классов соединений в режиме регистрации положительных ионов.
Масс-спектры свободных жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [m-h]-, интенсивность которого во всех исследованных нами образцах составляла 100%, и сигнала иона [M-H-H2O]-, интенсивность которого составляла 10−20%. Масс-спектры метиловых эфиров жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [m+h]+, интенсивность которого составляла 100%, и сигнала с незначительной интенсивностью (5−10%) иона [M+H-MeOH]+. Масс-спектры этаноламидов жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H-H2O]+, интенсивность которого составляла 100%, и сигнала иона [m+h]+ интенсивностью 80−100%.
Масс-спектры иод-лактонов ЭПК и ДГК (см. примечание к табл. 1) регистрировались в режиме ХИАД (+) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H]+ и иона [M+H-HI]+. Причем в масс-спектре иод-лактона ЭПК (5-лактон) основной сигнал (интенсивность 100%) давал ион [M+H-HI]+, а интенсивность протонированного молекулярного иона составляла 40% (рис. 2) — в случае же иод-лактона ДГК (у-лактон) основным был сигнал протонированного молекулярного иона (интенсивность 100%), а интенсивность сигнала протонированного иона, образующегося в результате потери HI, составляла 45−50%.
Оксилипины
Исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу простаг-ландинов F2a, B, E полученных биосинтетически, как описано ранее (Бергельсон, Дятловицкая, 1982), и A2, выделенного из общего липидного экстракта коралла Plexaura homomalla (Brash et al., 1987), а также синтетически полученных смесей всех изомеров моногидрокси производных арахидоновой кислоты (а именно, 5-гидрокси-6Е, 82,112,142-эйкозатет-раеновой кислоты, 8-гидрокси-52,9Е, 112,142-эйкозатетраеновой кислоты, 9-гидрокси-52,7Е, 112,142-эйкозатетраеновой кислоты, 11-гидрокси-52,82,12Е, 142-эйкозатетраеновой кислоты, 12-гидрокси-52,82,10Е, 142-эйкозатетраеновой кислоты и 15-гидрокси-52,82,112,13Е-эйкозатетрае-новой кислоты, полученных из арахидоновой кислоты, как описано ранее) (Модифицированные жирные кислоты, 1997) и 15^)-гидроперокси-52,82,112,13Е-эйкозатетраеновой кислоты, полученной в результате ферментативного окисления арахидоновой кислоты соевой 15-липокси-геназой согласно описанной ранее методике (Куклев и др., 1995).
Оксилипины — оксигенированные производные полиненасыщенных жирных кислот. Наличие свободной карбоксильной группы, как и в случае с жирными кислотами, предопределяет преимущественное образование отрицательных ионов, поэтому масс-спектры всех оксилипинов регистрировались в режиме ХИАД (-) и характеризовались наличием основного сигнала иона [m-h]- и сигналов ионов общей формулы [M-n (H2O)-H]-, обусловленных дегидратацией квазимолекулярного иона [M-h]-, причем количество этих ионов (n) определялось количеством гидроксильных групп в молекуле. Интенсивность этих фрагментов обычно была выше 20%. В некоторых случаях мы наблюдали дополнительную потерю формульного элемента H2O (моногидрокси производные арахидоновой кислоты), которую мы связываем с возможностью дегидратации карбоксильной группы с образованием кетена. Интенсивность «ке-тенного» иона невелика и составляла обычно менее 10%. Масс-спектр простагландина A2 является хорошей иллюстрацией для представителей данного класса соединений и характеризуется наличием основного сигнала
56
иона [М-Н] т/z 333, интенсивность которого составляет 100%, а также сигнала иона [М-Н-Н20]- т/ъ 315, интенсивность которого — 35% (рис. 3).
Рис. 2. Масс-спектр иод-лактона эйкозапентаеновой кислоты Fig. 2. Mass-spectrum of eicosapentaenoic acid iodlactone
333.2 [M-H]'-
COOH
OH
320
Рис. 3. Масс-спектр простаг-лангдина A2
F ig. 3. Mass-sp ectrum o f prostaglandin A2
340
380
400
Альдегиды и их 2,4-динитрофенилгидразоны Нами исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу ряда 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов, образующихся в процессе автоокисления водно-жировых эмульсий, а именно: формальдегида, ацетальдегида, пропаналя, (2?)-4-гидрокси-2-ноненаля и (2?,^)-4-гидро-кси-2,6-нонадиеналя. Эти альдегиды были выделены из сложной смеси продуктов автоокисления жира сардины Sardinops melanosticta, как было описано ранее (Рыбин и др., 1999а, б).
57
Необходимость перевода альдегидов в 2,4-динитрофенилгидразо-ны при их анализе связана с трудностью и относительно низкой точностью определения альдегидов в сложных смесях оксигенированных углеводородов даже при использовании хроматографических методов (Рыбин и др., наст. сб., а). Большое разнообразие таких соединений, например, в сложных смесях продуктов автоокисления липидов обусловливает применение дериватизационных методов предварительного фракционирования. В случае 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов было показано (Svetlova et al., 1986- G oldring et al., 1993- Р ыбин и др., наст. сб., а), что компоненты исходной смеси продуктов окисления липидов обладают ВЭЖХ-подвижностью, значительно меньшей (для обращенно-фаз-ной хроматографии), чем 2,4-динитрофенилгидразоны альдегидов, присутствующих в такой смеси. Иными словами, проведение предварительного фракционирования в данном случае не является необходимым фактором. Следовательно, при использовании такого дериватизационно-го метода существенно возрастает точность анализа альдегидов, многочисленные представители которых являются высоколабильными соединениями.
Масс-спектры 2,4-динитрофенилгидразонов всех альдегидов (табл. 2) регистрировались в режиме ХИАД (-) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M-H]- и, в случае наличия в структуре гидразона свободной гидроксильной группы, сигналом иона [M-H-H2O]-, обусловленного дегидратацией (интенсивность около 20%). Так, например, в масс-спектре 2,4-динитрофенилгидразона (2?)-4-гидрокси-2-нонена-ля присутствует как сигнал иона [ M-H]- (m/z 335, интенсивность 100%), так и сигнал иона [M-H2O-H]- (m/z 317, интенсивность 15%) (рис. 4).
Таблица 2
Основные ионы, наблюдаемые в масс-спектрах 2,4-динитрофенилгидразонов
некоторых альдегидов
Table 2
The preliminary ions observed on mass-spectra of 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative of some aldehydes
Ион Формаль- Ацеталь- Пропа- (2Е)-4-гидрокси- (2E, 6Z)-4-гидрокси-дегид дегид наль 2-ноненаль 2,6-нонадиеналь
[M-H]- 209 223 235 335 333
[M-H-H0O]~ Нет Нет Нет___________317_______________315_______
юо —
80
О
X
ш
о 60
40
& quot-Ыу4
CWN
ОН
1-Н]- 335. 1
[М-Н-Н20]-
150
200
250
300
Р ис. 4. М асс-спектр 2,4-динитрофенилгидразона (2?)-4-гидрокси-2-ноненаля Fig. 4. Mass-spec-trum of 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative o f (2E)-4-hy droxy-2-nonenal
350
400
Стероиды
Исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу стероидов, а именно: тестостерону, андростерону, 17в-эстрадиолу и 20-гидрокси-экдизону. Тестостерон, андростерон, эстрадиол были приобретены у фирмы «Sigma» (США), 20-гидроксиэкдизон выделен самостоятельно (Рыбин и др., наст. сб., б).
При использовании метода ВЭЖХ для анализа соединений стероидной природы необходимо учитывать, что они могут значительно отличаться друг от друга по количеству гидроксильных групп (например, холестерин содержит одну гидроксильную группу, а 20-гидроксиэкдизон -шесть). Отмеченное обстоятельство делает практически невозможным проведение анализа биологических объектов на предмет содержания различных стероидов без проведения предварительного фракционирования компонентов исследуемых смесей, например, по их относительной полярности.
Масс-спектры стероидов регистрировались в режиме ХИАД (+) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H]+ и сигналами ионов [ M+H-n (H2O)]+, обусловленных дегидратацией (интенсивность около 40%). Причем в масс-спектре 17в-эстрадиола мы не наблюдали дегидратации, связанной с потерей фенольной гидроксильной группы, в масс-спектре 20-гидроксиэкдизона, содержащем 6 гидроксильных групп, мы не наблюдали сигнала иона с m/z 375, что, по-видимому, связано с трудностью дегидратации при С-14 атоме (третичная спиртовая группа). Наиболее интересным, с нашей точки зрения, является масс-спектр 20-гидроксиэкдизона (рис. 5), в котором мы наблюдали сигналы протони-рованного молекулярного иона [M+H]+ m/z 481 и ионов, образующихся при последовательной дегидратации: m/z 463 [M-(H2O)+H]+, m/z 445 [M-2(H2O)+H]+, m/z 427 [M-3(H2O)+H]+, m/z 409 [ M 4(H2O)+H]+ и m/z 391 [M-5(HO)+H]+.
Рис. 5. Масс-спектр 20-гидроксиэкдизона Fig. 5. Mass-spectrum of 20-hydroxyecdysone
Заключение
Оптимальные условия, предлагаемые нами для проведения анализа
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селек-
тивной детекцией пяти классов биологически активных соединений
59
липидной природы, выделенных из морских источников или полученных синтетически из субстратов морского происхождения, представлены в табл. 3.
Таблица 3
Условия ВЭЖХ-МС для анализа некоторых классов биологически активных веществ
Table 3
Conditions of HPLC-MS for analysis of the some classes of biologically active compounds
Условия МС-детекции
Условия ВЭЖХ (изократическое элюирование)
Класс Темпе- Заряд Напря-
соедине- Скорость ратура Режим реги- жение
ний Колонка Элюент потока, колон- иони- стри- фраг-
мл/мин ки, оС зации руемых менто-
ионов ра, В
Каротино- иды Shim-Pack FLC ODS (4,6×50,0 мм 3 мкм) Ацетонитрил 0,5 55 ХИАД + 100
Жирные кислоты и их производные То же Ацетонитрил- & quot- вода (80: 20) & quot- & quot- +, — 100
Оксили- пины Ацетонитрил- & quot- вода (80: 20) & quot- & quot- - 100
Альдегиды и их 2,4-динитро-фенилгид-разоны Ацетонитрил- & quot- вода (60: 40) 75
Стероиды Ацетонитрил- & quot- вода (20: 80) & quot- & quot- + 100
Эти условия применительно к данному методу анализа можно подразделить на хроматографические и масс-спектрометрические. Условия проведения ВЭЖХ при использовании одной колонки, температуры и одинакового расхода элюента различаются для разных классов соединений выбором подвижной фазы. Выбор условий проведения масс-спектрометрической детекции в режиме ХИАД зависит от преобладающего типа (заряда) ионов, образующихся при ионизации анализируемых соединений (режим регистрации, табл. 3), а также от степени устойчивости квазимолекулярных ионов (фрагментор, табл. 3).
Таким образом, нами продемонстрирована эффективность применения высокоэффективной жидкостной хроматографии — масс-спектромет-рии — при анализе разнообразных биологически активных веществ липидной природы и родственных соединений, а именно: каротиноидов, жирных кислот и их производных, оксилипинов, альдегидов и их 2,4-динит-рофенилгидразонов, стероидов.
Литература
Бергельсон Л. Д., Дятловицкая Э. В.
дов. — М.: Наука, 1982.
Препаративная биохимия липи-
Куклев Д. В., Когтева Г. С., Латышев Н. А., Безуглов В. В. Окисление октадекапентаеновой (18: 5n-3) кислоты соевой 15-липоксигеназой // Биоорган. химия. — 1995. — Т. 21, № 8. — С. 651−653.
Модифицированные жирные кислоты / Ред. Д. В. Куклев, В. В. Безуглов. — Владивосток, 1997. — 114 с.
Рыбин В. Г., Куклев Д. В., Машкин Д. С., Блинов Ю. Г. Определение (2?)-4-гидрокси-2-ноненаля в смесях продуктов окисления рыбных жиров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Наст. сб., а.
Рыбин В. Г., Зарембо Е. В., Куклев Д. В., Горовой П. Г. Идентификация 20-гидроксиэкдизона в гемолимфе Paralithodes camtschatica (Lithodidae) и соцветиях Serratula coronata var. Manshurica (Asteraceae) // Наст. сб., б.
Рыбин В. Г., Куклев Д. В., Бывальцева Т. М. и др. (2?)-4-гидрокси-2-ноненаль — активный компонент нового природного антимикробного препарата // Биоорган. химия. — 1999а. — Т. 25, № 9. — С. 716−720.
Рыбин В. Г., Куклев Д. В., Бывальцева Т. М. и др. (2?, 62)-4-гидро-кси-2,6-нонадиеналь — активный компонент антимикробного препарата // Изв. ТИНРО. — 1999б. — Т. 125. — С. 238−243.
Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. -М.: Наука, 1980. — 245 с.
Bathori M. Purification and characterisation of plant ecdysteroids of Silene species // Trends Anal. Chem. — 1998. — Vol. 17, № 6. — P. 372−383.
Brash A.R., Baertschi S.W., Ingram C.D., Harris T.M. On non-cy-clooxygenase prostaglandin synthesis in see whi p coral Plexaura homomalla // J. Biol. Chem. — 1987. — Vol. 262, № 33. — P. 15 829−15 839.
Christie W.W. Detectors for HPLC of lipids with special reference to evaporate light-scattering detection // Advances in Li pid Methodology (1) / Ed. W.W. Christie. — Ayr: The Oily Press, 1992. — P. 239−272.
Gaskell S.J. Electrospray: Princi ples & amp- Practice // J. Mass Spectrom. -1997. — Vol. 32. — P. 677−688.
Goldring C., Casini A.F., Maellaro E. et al. Determination of 4-hydrox-ynonenal by high-performance liq uid chromatography with electrochemical detection // Li pids. — 1993. — Vol. 28, № 2. — P. 141−145.
Justesen U., Knuthsen P., Leth T. Quantative analysis of flavonoids, flavones and flavonones in fruits, vegetables and beverages by HPLC with photodiode array and mass spectrometric detection // J. Chromatography. — 1998. -Vol. 799. — P. 101−110.
Katz E.D. High Performance Liq uid Chromatography / Eds J. Willey, S. Chichester. — England, 1996. — 522 p.
Khachik F., Beecher G.R., Lusby W.R. Separation and identification of carotenoids and carotenol fatty acids esters in some sq uash products by liq uid-chromatography. Isolation and characterization of carotenoida and related esters // J. Agricul. Food. Chem. — 1988. — Vol. 36, № 5. — P. 938−946.
Matissek R., Wittkowski R. HPLC in food control and research. — Tech-nomic Pbs. Basel, 1990. — 385 p.
Svetlova N.I., Sokolova L.I., Grigoryeva D.N., Golovnya R.V. Application of the universal eq uation for liq uid chromatography to the calculation of the retention parameters for 2,4-dinitrophenylhydrazone derivatives of carbonyl compounds // J. Chromatography. — 1986. — Vol. 364. — P. 203−207.
Wachs T., Conboy J.C., Garicia F., Henion J.D. Liq uid Chromatography-Mass Spectrometry and Related Techniq ues via Atmospheric Pressure Ionization // J. Chromatogr. Sci. — 1991. — Vol. 29. — P. 357−366.
Поступила в редакцию 18. 05. 2001 г.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой