Удельное содержание ДНК в ядрах клеток и клеточная гетерогенность аденокарцином толстой кишки

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

u u/^A u V^^JU ^ u uz/u ОРИГ1НАЛЬН1 ДОСЛ1ДЖЕННЯ / ORIGINAL RESEARCHES
УДК 616. 345 — 006. 6: 616 — 091. 8
О. М. Грабовий1, С. А. Антонюк1, В. П. Сшьченко2, С. А. Воробей1, Т. М. Савчин1
Питомий вмкт ДНК у ядрах клггин i клiтинна гетерогеншсть аденокарцином товстоУ кишки
'-Нацюнальний шституту раку, м. Ки1 В, 2Нацюнальна медична академ1я шслядипломно! освгга iMeHi П. Л. Шупика, м. Ки1 В Ключовi слова: аденокарцинома товсто'-1 кишки, ДНК, клгтина гетерогеншсть.
Визначення властивостей i тонких мeханiзмiв патогенезу е безпосередньою умовою пiдвищeння ефективност боротьби з раком, у тому чи^ товсто1 кишки. З метою оцшювання гeтeрогeнностi клiтинного складу аденокарцином товсто1 кишки за питомим вмiстом ДНК у ядрах клгшн на матeрiалi 141 бюпсп або вилученому тд час оперативного втручання здшснили дослвдження за допомогою гiстологiчних, гiстохiмiчних, морфо- та денсюметричного, математичних метод1 В. Встановили, що в аденокарциномах товсто1 кишки з тдвищенням ступеня дедиференцтавання (G) ввдбуваеться збiльшeння вдаосно1 частки клгшн з ядрами, якi найбшьше вщповщають функцiонально активним, i навпаки. Це свщчить, що клiтинна гeтeрогeннiсть аденокарцином товсто1 кишки е не лшшною, а функцiею, що наближаеться до параболiчноl.
Удельное содержание ДНК в ядрах клеток и клеточная гетерогенность аденокарцином толстой кишки
А. Н. Грабовой, С. А. Антонюк, В. П. Сильченко, Е. А. Воробей, Т. М. Савчин
Определение свойств и тонких механизмов патогенеза является непосредственным условием повышения эффективности борьбы с раком, в том числе толстой кишки. С целью оценить гетерогенность клеточного состава аденокарцином толстой кишки по удельному содержанию ДНК в ядрах клеток на материале 141 биопсий или взятом в ходе оперативного вмешательства провели исследование с помощью гистологических, гистохимических, морфо- и денсиометрического, математических методов. Установлено, что в аденокарциномах толстой кишки по мере роста степени дедифференцировки (G) происходит увеличение относительной доли клеток с ядрами, которые наиболее соответствуют функционально активным, и наоборот. Это свидетельствует, что клеточная гетерогенность аденокарцином толстой кишки является не линейной, а функцией, приближающейся к параболической.
Ключевые слова: аденокарцинома толстой кишки, ДНК, клеточная гетерогенность.
Патология. — 2015. — № 1 (33). — С. 44−47
Specific cell'-s nuclei DNA content and cellular heterogeneity of colon adenocarcinoma
A. N. Grabovoy, S. A. Antoniuk, V. P. Silchenko, E. A. Vorobiei, T. M. Savchin
Definition of properties and fine pathogenesis mechanisms is a direct condition for improving the effectiveness of the fight against cancer, including colon cancer.
Aim. In order to assess the cellular composition heterogeneity of colon adenocarcinoma (AC) on the specific DNA content in the cells'- nuclei 141 biopsies were studied using histological, histochemical, morphological, densitometric and mathematical methods.
Methods and results. It was established that in AC with grade increase (G) there is an increase in the relative proportion of cells with nuclei which are most appropriate for functional activity and vice versa.
Conclusion. This suggests that AC cellular heterogeneity is not linear, and the function approximates to the parabolic one.
Key words: Large Intestine, Adenocarcinoma, DNA, Genetic Heterogeneity.
Pathologia. 2015- № 1 (33): 44−47
Змши шлькосп ДНК у ядрах клгган аденокарцином товсго! кишки (АК) е типовим явищем, яке пов'-язане передуам iз хромосомною нестабшьшстю, котра реалiзуеться в полшлощ! та анеуплощ! [1,5,7,9]. Виконано багато дослвджень щодо виявлення зв'-язку мiж вмктом ДНК (пло!дшстю) в ядрах пухлинних клгган i пстолопчним типом пухлини i передуам з И злояшсним потенщалом [1,9]. Даш щодо кшькосл ДНК у ядрах клгган i прогнозу при колоректальному раку дали шдгрунтя для формування уявлення про важливють цього показника, який не е абсолютним, що пов'-язано з мшливютю цього явища [7,9].
Наш спостереження [2] показали: середнш вмют ДНК у ядрах пухлинних клгган виявляеться найбшьшим у полшах та аденомах з осередками матгтзацд (фактич-но аденокарциноми в1). В АК iз пвдвищенням ступеня
дедиференщювання (в) ввдзначили його зменшення, як i зменшення виразносп гетерогенносп клиинного складу пухлин за щею ознакою. Крiм того, привернула увагу доволi значна варiабельнiсть оптично! щiльностi ядер пухлинних клiтин при визначенш в них вмiсту ДНК, що дало змогу припустити можливють використання цього показника для ощнювання клiтинного складу АК.
Мета роботи
Ощнити гетерогеннiсть клiтинного складу аденокарцином товсто! кишки за питомим вмютом ДНК у ядрах клгган.
Матерiали i методи досл1дження
Дослщження виконанi на матерiалi 141 бюпсш або вилученому при оперативному втручанш ввд пацiентiв з АК i доброяк1сними новоутвореннями: 11 — контроль, умовно нормальна кишка (К), полши та аденоми (В) —
© О. М. Грабовий, С. А. Антонюк, В. П. Стыченко, G. А. Воробей, Т. М. Савчин, 2015
Питомий вмгст ДНК у ядрах клпин i клiтинна reTeporeHHicTb аденокарцином товсто! кишки
16- АК G1 (G1) — 28- АК G2 (G2) — 73- АК G3 (G3) — 13. Пстолопчне типування пухлин здшснили з використан-ням рутинного забарвлення.
Матерiал фiксували в забуференому 10% формалiнi з pH 7,4 та ущшьнювали у парафiн iз застосуванням пс-тiопроцесора Histos-5 (Milestone, Italy). З парафшових блоков виготовляли зрiзи завтовшки 5 мкм за допомогою мжротома Microm НМ325 (Thermo Scientific, Germany). Зрiзи забарвлювали гематоксилшом для загального оцiнювання пухлини, галоцианш-хромовим галуном за Ейнарсоном (pH 1,62, 37 °C, 24 год) для виявлення вмiсту нукле! нових кислот (НК) [3,4]. Для кожного випадку час-тину зрiзiв обробляли РНКазою (MACHEREY-NAGEL GmbH & amp- Co. KG, Germany) для екстракци РНК [3].
Препарати вивчали та фотографували за допомогою мшроскопа Nikon Eclipse 80i з камерою DS-5SMc/L2 за стандартизованих умов, а зображення (збiльшення мiкроскопа *400, 1280*960 пiкселiв RGB) опрацьову-вали iз застосуванням системи аналiзу ImageJ 1,46. На зображеннях iз препаратiв, забарвлених галощанш-хро-мовим галуном, у 30 клтгинах кожно! пухлини визначали площу перетину ядра клiтини, питому та штегративну оптичну щiльнiсть ядра клггани, розраховували вмiст у ньому кшъкосп ДНК. Для визначення останнього як одиницю обрали вмют ДНК у ядрах лiмфоцитiв [2]. Клiтини кожно! пухлини ранжували за вмiстом ДНК в ядрг Отриману послiдовнiсть дшили на ранги iз кроком, що дорiвнював середньому вмiсту ДНК у ядрах лГмфо-цитiв: R1 — до 1, R2 — 1−2, R3 — 2−3 i т.д. Враховуючи, що клггани з рангом Р5 i бiльше становили менше шж 5%, а бiльшiсть середшх значень! хшх параметрiв, як1 визначали, мали р& gt-0,05, !х зводили в один ранг Р6+. За середшм вмГстом ДНК у ядрах клггани пухлин подшили на 3 пгдгрупи: D — середнш вмют ДНК у ядрах до 1,2, D+ - середнш вмют ДНК у ядрах вщ 1,2 до 2,5, T+ - середнш вмют ДНК понад 2,5 [1,2].
Статистичний аналiз виконали з використанням программного забезпечення IBM SPSS Statistics 22. Для коре-ляцшного аналiзу застосували метод рангово! кореляцп за Стрманом, оскшьки бшьшють величин не вгдповгда-ли нормальному закону розподшу, що визначили за допомогою одновибГркового тесту Колмогорова — Смiрнова. Для порГвняння вибГрок використовували H-критерш Крускала — Уоллеса та U-критерш Манна — УггаГ Для дослгджених пухлин (130) здшснили аналiз виживаносп за Каплан — Мейером з використанням лог-ранк тесту для оцшювання вГропдно! рГзнищ у групах Гз рГзною виживанiстю. Для регресшного аналГзу використовували метод Кокса.
Результати та Тх обговорення
КлГтинний склад (спектр) пухлин, яю дослвдили, визначили за вмютом ДНК у ядрах! хшх клгган. Вгн виявляе помГрний стушнь залежносп вГд ступеня ана-плазп. З пгдвищенням середнього значення пло! дносп пухлини вгдбуваеться змщення l! клгганного спектра до зростання вгдносно! кшькосп клгган зГ збшьшеним вмютом ДНК у ядрах [2]. СпостерГгали зменшення
середнього вмюту ДНК у ядрах А К Гз шдвищенням ступеня дедиференцшвання (G).
Подш клгган на групи з умовно нормальними ядрами (Nn) й п, ядра яких перебувають у сташ ткнозу (Np) чи зазнали хроматолГзу (Nl), здшснили за критерГями середньо! оптично! щшьносп, площГ перетину ядра та вмГстом у ньому ДНК. Для кожного R на основГ загально! вибГрки вирахували середш значення площГ перетину ядра та илькосп ДНК. На тдставГ цього обраховували Гндекс нормальносл ядра (Ni):
NDNAi ¦ NAreaR i (1)
N. =
NDNAr ¦ NArea
де Ni — Гндекс нормальносл ядра клггани-
NDNAi — вмют ДНК у ядрГ клггани-
NDNNr — середнш вмют ДНК у ранзГ R, до якого на-лежить клггана-
NAreai — площа перетину ядра клггани-
NAreaR — середне значення площГ перетину ядра в ранзГ R, до якого належить клггана.
Значення N, що вГдповГдали б нормальним ядрам, обраш нашвемшричним шляхом i встановлеш у межах 1,0±0,2. Для вибГрки клгган (для кожного випадку окремо) з нормальними показниками N, обрахували середне значення оптично! щшьносп ядра, середньо-квадратичне вгдхилення, на основГ цього — мшмальне та максимальне значення. Отже, це дало змогу розширити можливостГ N,. До групи клгган Nn включеш п, серед-ня оптична щшьнють ядер яких лежала у межах мГж мшмумом i максимумом (обрахували на попередньому еташ дослгдження). Ядра з щшьнютю понад нормальний дГапазон (вище максимуму) — до групи Np (зазнали тк-нозу — велика оптична щГльнють водночас Гз низькими показниками площГ перетину). Клггани з ядрами, яш мали оптичну щшьнють нижче мшГмального значення визначеного дГапазону, класифжоваш як Nl (зазнали хроматолГзу) (рис. 1). На основГ результапв для кожно! пухлини розрахували частки Nn, Np, Nl клгган.
ДНК, у.о.
-
2,0-
1. 0-
— N.
ОпТ. Ч^ЛЬНЮТЬ, у о 57. 50 ЗЭ. 44 ei. 36 93. 31 105.3 117.2 128.1 141.1 153. 0
40 45
Плсщэ ядра, мкм& quot- - -N.
Рис. 1. Розподш клгшн аденокарцином товсто! кишки у координатах юлькост ДНК (у.о.), площГ (мкм2) i середньо! оптично! щшьносп ядра (у.о.).
АналГз клгганного складу пухлин рГзного ступеня дедиференцГювання показав збГльшення вгдсотка клГтин з умовно нормальними ядрами (Nn) Гз пГдвищенням анаплазп (p& lt-0,01) (рис. 2).
О. М. Грабовий, С. А. Антонюк, В. П. Сыьченко, С. А. Воробей, Т. М. Савчин
Рис. 2. Збшьшення частки клгшн в аденокарцином1 товстш кишки з умовно нормальними ядрами (Ми) 1з тдвищенням ступеня дедиференцтавання. Стовпчики пстограми — емт-рично визначена частка Ыи клгшн у пухлиш.
Примтки: К — контроль, В — доброяюсш новоутворення, 01−02−03 — АК в1дпов1дного грейда.
Це збшьшення вщбуваеться за лопстичним законом (Я2=0,98), що найкраще описуеться функц1ею Гомпертца (Я2=0,99), тобто швидшсть зростання частки Ыи клгган (прирют) е р1зною в р1зш моменти захворювання (за умо-ви посилення анаплазп з часом юнування пухлини), що нагадуе криву росту популяцп. Кр1м того, лопстичний закон передбачае юнування певного межового значения щшьносп популяцп, до якого прямуе лопстична крива. У нашому випадку його значення становить 89,7%. Шсля його досягнення прир1ст популяцп, теоретично, не ввдбуваеться, 1 крива виходить на плато. Точшше ро-зумшня перебну хвороби (ввд !! шщаци та в перюди м1ж стад1ями розвитку) дасть можливють детально вивчити властивосп криво! та детальшше описувати в матема-тичнш форм1 основш моменти переб1гу захворювання, прогнозувати! хш наслщки.
Щодо частки Ыр клгган спостерпали зворотну за-лежнють: частка таких клгган у пухлиш знижуеться з1 збшьшенням в (р& lt-0,01) (рис. 3). Таке зниження ввдбу-ваеться експоненцшно (Я2=0,99). 45 п N. %
Рис. 3. Експоненцшне зниження вщсотка клгган з ядрами, що зазнали ткнозу (Ыр) у склад1 аденокарциноми товсто! кишки з1 збшьшенням 0. Стовпчики пстограми — емтрично визначена частка Ыр клгшн у пухлиш.
Примтки: К — контроль, В — доброяюсш новоутворення, 01−02−03 — АК в1дпов1дного грейда.
Шд час ощнювання Ы1 клгган у склад1 пухлин не виявили законом1рностей змш! хньо! кшькосл, що дае змогу розглядати! х появу як випадкове явище.
Анал1з клгганного складу у групах пухлин 1з р1зною середньою пло! дшстю показав наявшсть в1ропдно! р1знищ м1ж значеннями Ыи з1 збшьшенням тканинно! анаплази пухлини для Б+ (р& lt-0,01) 1 показниками Ыр (р& lt-0,01). Так, спостерпали пщвищення Ыи 1 зниження Ыр з1 збшьшенням 0. Однак таку законом1ршсть не визначили для дипло! дних пухлин (Б), де статистично в1рогщних результата не отримали. Це можна пояснити високою 1зоморфшстю пухлинних клгган ц1е! групи. Для групи Т+, де спостер1гали виражену кл1тинну ашзоморфш, також не отримали в1ропдно! р1знищ м1ж р1зними 0, хоча у грут простежуеться виразна тенденщя до збшьшення Ыи 1 зниження Ыр.
Анал1з виживаност1 за методом Каплана — Мейера не виявив И прямого зв'-язку з показниками питомо! оптично! щшьносп ядер за вм1стом ДНК 1 клгганним складом пухлини за щею ознакою.
Отже, дослщження показали, що з шдвищенням ступеня дедиференцшвання АК вадбуваеться збшьшення ввдносно! частки кл1тин з ядрами, що найбшьш вшповвдають функцюнально активним, а вшносна к1льк1сть клгган, ядра яких не вшповщають критер1ям житгездатносп, зменшуеться. Це збпаеться з характером змш клгганного спектра АК за вм1стом ДНК у ядрах пухлинних клгган, коли в АК 03, у пор1внянш з бшьш диференцшованими, вш звужуеться [2]. Наведене е прямим вщображенням концепци клонально! еволюци пухлин [6,10] 1 показуе поступове набуття дом1нування в АК клону (1в) з ефективними системами життезабезпечення 1, можливо, з1 стабшзованим геномом. З цих позицш клгганну гетерогеншсть [8] АК треба розглядати як не лшшну, а парабол1чну функцш. Вшповшно, на пев-ному етап1 розвитку (пухлинно! прогреси) виразн1сть гетерогенност1 досягае максимуму. Паралельно кло-нальна еволюц1я отримуе максимум субстрату для реал1зацп в1дбору, 1 з1 складу пухлини ел1м1нуються нежиттездатш морфофункц1ональн1 типи пухлин. По-ряд з тим 1з кл1тинного р1зномашття вид1ляються так1, що, маючи спотворений генотип (забезпечуе високу прол1феративну актившсть з1 збереженням систем життезабезпечення та втратою специф1чних функц1й 1нтегрування у тканинш комплекси), е основою для виникнення ст1йких клон1 В, як1 здатш до необмеженого 1снування.
Висновки
В аденокарциномах товсто! кишки з щдвищенням ступеня дедиференц1ювання (0) вщбуваеться зб1льшення в1дносно! частки кл1тин з ядрами, що найбшьше в1дпов1дають функцюнально активним 1 навпаки.
Ел1м1нац1я нежиттездатних морфофункц1ональних тип1 В пухлинних кл1тин в аденокарциномах товсто! кишки вщбуваеться одночасно з1 зростанням ступеня !! клгганно! гетерогенност1. Досягнення р1вноваги м1ж цими процесами е перюдом, п1сля якого в пухлиш починае зменшуватися р1вень кл1тинно! гетерогенност1. В1дпов1дно, кл1тинна гетерогеннють аденокарцином е не л1н1йною, а функщею, що наближаеться до парабол1чно!
?ББК 2306−8027 Пагологiя, 2015, № 1 (33)
Питомий вмгст ДНК у ядрах клггин i клiтинна reTeporeHHicTb аденокарцином товсто! кишки
Список лiтератури
1. Автандилов Г. Г. Диагностическая медицинская плоидо-метрия / Г. Г. Автандилов. — М.: Медицина, 2006. — 192 с.
2. Грабовий О. М. Втст нукле! нових кислот у ядрах клггин епiтелiальних пухлин товсто! кишки / О. М. Грабовий, С. А. Антонюк, ?.А. Воробей // Укра1нський морфолопч-ний альманах. — 2013. — № 1. — C. 73−76.
3. Лупа Х. Основы гистохимии: пер. с нем. / Х. Лупа. — М.: Мир, 1980. — 344 с.
4. Ташке К. Введение в количественную цито-гистологиче-скую морфологию: пер. с рум. / К. Ташке. — М.: Из. Акад. Соц. Респ. Румынии, 1980. — 192 с.
5. Davoli T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer / T. Davoli, T. de Lange // Ann. Rev Cell Dev. Biol. — 2011. — Vol. 27. — P. 585−610.
6. Greaves M. Clonal evolution in cancer / M. Greaves, C.C. Mal-ey // Nature. — 2012. — Vol. 481. — № 7381. — P. 306−313.
7. Holland A. Losing balance: the origin and impact of aneuploidy in cancer / A. Holland, D. Cleveland // EMBO. — 2012. -Vol. 13. — P. 501−514.
8. Cancer heterogeneity-a multifaceted view / F.D.S.E. Melo, L. Vermeulen, E. Fessler, J.P. Medema // EMBO reports. -2013. — Vol. 14(8). — P. 686−695.
9. Effects of Chromosomal Polyploidy on Survival of Colon Cancer Cells / S. Park, E. Choi, Y. Jang et al. // Korean J. Gastroenterol. — 2011. — Vol. 57(3). — P. 150−157.
10. Visvader J.E. Cells of origin in cancer / J.E. Visvader // Nature. — 2011. — Vol. 469(7330). — Р. 314−322.
References
1. Avtandilov, G. G. (2006). Diagnosticheskaya medicinskaya ploidometriya [Diagnostic medical ploidometry]. Moscow: Medicina. [in Russian].
2. Hrabovyi, O.M., Antoniuk, S. A, Vorobiei, Ye. A. (2013). Vmist nukleinovykh kyslot u yadrakh klityn epitelialnykh pukhlyn tovstoi kyshky [Nucleic acids contents in the colon epithelial tumor cells nuclei]. Ukrainskyi morfolohichnyi almanakh, 11(1), 73−76. [in Ukrainian].
3. Luppa, Kh. (1980) Osnovy khistokhimii [Basic histochemistry]. Moscow: Myr. [in Russian].
4. Tashke, K. (1980). Vvedenie v kolichestvennuyu cito-gisto-logicheskuyu morfologiyu. [Introduction to quantitative cyto-histological morphology]. Moscow. [in Russian].
5. Davoli, T., & amp- de Lange, T. (2011). The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 27, 585−610. doi: 10. 1146/ annurev-cellbio-92 910−154 234.
6. Greaves, M., & amp- Maley, C. C. (2012) Clonal evolution in cancer. Nature, 481(7381), 306−313. doi: 10. 1038/nature10762.
7. Holland, A., & amp- Cleveland, D. (2012) Losing balance: the origin and impact of aneuploidy in cancer. EMBO, 13, 501−514. doi: 10. 1038/embor. 2012. 55.
8. Melo, F. D. S. E., Vermeulen, L., Fessler, E., & amp- Medema, J. P. (2013) Cancer heterogeneity — a multifaceted view. EMBO, 14(8), 686−695. doi: 10. 1038/embor. 2013. 92.
9. Park, S., Choi, E., Jang, Y., Hong, S. H., Kim, I. H., & amp- Chang, D. K. (2011). Effects of Chromosomal Polyploidy on Survival of Colon Cancer Cells. Korean J. Gastroenterol., 57(3), 150−157. doi: 10. 4166/2011. 57.3. 150.
10. Visvader, J. E. (2011) Cells of origin in cancer. Nature, 469(7330), 314−322. doi: 10. 1038/nature09781.
BidoMocmi про aemopie:
Грабовий О. М., д. мед. н., професор, зав. науково-дослщного вщдшу патолопчно! анатоми, Нацюнальний? нститут раку, E-mail: agrabovoy@yandex. ru.
Антонюк С. А., м.н.с. н. -д. вщдшу патолопчно! анатоми, Нацюнальний? нститут раку.
Сшьченко В. П., д. мед. н., професор, зав. каф. патолопчно! та топограф1чно! анатоми, Нацюнальна медична академ1я шслядипломно! осв1ти 1меш П. Л. Шупика.
Воробей С. А., ст. лаборант з вищою освггою н. -д. вщдшу патолопчно! анатоми, Нацюнальний 1нститут раку. Савчин Т. М., дипломант н. -д. вщдшу патолопчно! анатом!!, Нацюнальний шститут раку. Сведения об авторах:
Грабовой А. Н., д. мед. н., профессор, зав. научно-исследовательским отделом патологической анатомии, Национальный институт рака, E-mail: agrabovoy@yandex. ru.
Антонюк С. А., м.н.с. н. -и. отдела патологической анатомии, Национальный институт рака.
Сильченко В. П., д. мед. н., профессор, зав. каф. патологической и топографической анатомии, Нацгональная медицинская академия последипломного образования имени П. Л. Шупика.
Воробей Е. А., ст. лаборант с высшим образованием н. -и. отдела патологической анатомии, Национальный институт рака. Савчин Т. М., дипломант н. -и. отдела патологической анатомии, Национальный институт рака. Information about authors:
Grabovoy A.N., MD, PhD, DScM, Professor, Head of The Research Department of Anatomical Pathology, Ukrainian National Cancer Institute, E-mail: agrabovoy@yandex. ru.
Antoniuk S.A., MD, Researcher of The Research Department of Anatomical Pathology, Ukrainian National Cancer Institute.
Silchenko V.P., MD, PhD, DScM, Professor, Head of the Department of Pathologic and Topographic Anatomy, Shupik National Medical Academy
of Postgraduate Education.
Vorobiei E.A., Senior researcher assistant of The Research Department of Anatomical Pathology, Ukrainian National Cancer Institute. Savchin T.M., Writer of a university degree thesis of The Research Department of Anatomical Pathology, Ukrainian National Cancer Institute.
Надшшла в редакщю 27. 03. 2015 р.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой