Гидролитические ферменты, кодируемые геномом термоалкалофильной бактерии Thermosyntropha lipolytica

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 579. 25
ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, КОДИРУЕМЫЕ ГЕНОМОМ ТЕРМОАЛКАЛОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ THERMOSYNTROPHA LIPOLYTICA Марданов А. В., Белецкий А. В., Равин Н. В.
ФГБУНЦентр «Биоинженерия» Российской академии наук, Москва, e-mail: nravin@mail. ru
Термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, выделенная из щелочного озера Бого-рия в Кении, способна расщеплять триглицериды и утилизировать жирные кислоты в симбиотическом син-трофном сообществе с метаногенными археями. В отсутствие симбионтов эта бактерия может сбраживать некоторые белковые субстраты. В результате определения полной нуклеотидной последовательности генома T. lipolytica идентифицирован набор гидролитических ферментов этой бактерии. Анализ аминокислотных последовательностей позволил идентифицировать ферменты, содержащие N-концевые сигнальные последовательности, которые могут обеспечивать секрецию из клетки в окружающую среду. Среди этих ферментов обнаружены протеазы различных типов, липазы и гликозил-гидролазы. Наличие этих секретируемых гидро-лаз объясняет способность T. lipolytica расти на белковых субстратах и липидах и свидетельствует о том, что эта бактерия может также обладать способностью использовать для роста и некоторые полисахариды. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.
Ключевые слова: бактерия, геном, протеаза, липаза, термоалкалофил
HYDROLYTIC ENZYMES ENCODED IN THE GENOME OF THERMOALKALIPHILIC BACTERIUM THERMOSYNTROPHA LIPOLYTICA Mardanov A.V., Beletskiy A.V., Ravin N.V.
Centre «Bioengineering» of the Russian academy of sciences, Moscow, e-mail: nravin@mail. ru
Thermophylic anaerobic bacterium Thermosyntropha lipolytica, isolated from a soda Lake Bogoria, Kenya, is able to hydrolyse triglycerides and untilizeon the liberated fatty acids in a syntrophic symbiotic association with a methanogenic archaeon. In the absence of syntrophic partner this bacterium is able to grow by fermentation on some proteinaceous substrates. Upon sequencing of the complete genome of T. lipolytica we identified a set of hydrolytic enzymes of this bacterium. Analysis of predicted amino acid sequences allowed to identify enzymes containing N-terminal signal sequences responsible for secretion of these enzymes out of the cell to the external medium. Proteases of different families, lipases and glycosyl hydrolases were found among these secreted enzymes. The presence of secreted hydrolases of these classes could explain the ability of T. lipolytica to grow on proteinaceous substrates and lipids, and suggest that this bacterium may be able to utilize some polysaccharides. Identified hydrolytic enzymes, active at high temperatures under alkaline conditions, may be used in different areas of industrial biotechnology.
Keywords: bacteria, genome, protease, lipase, thermoalkaliphile
Объектом исследования являет-
ся термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, которая была выделена из щелочного озера Богория в Кении [9]. Этот относящийся к порядку Clostridiales микроорганизм растет в широком диапазоне температур от 52 до 70 °C при щелочных значения pH (7,15−9,5). В чистой культуре эта бактерия может расти на различных белковых субстратах (дрожжевой экстракт, триптон, мясной экстракт и др.), а также кротонате [9]. Основным продуктом сбраживания этих субстратов является ацетат. Слабый рост наблюдался также на пирувате, рибозе и ксилозе [9]. Особенностью T. lypolitica является способность расщеплять триглицериды (напр. растительного масла) и утилизировать жирные кислоты при росте в синтрофном симбиотическом сообществе с метаногенной археей (род Methanobacterium). В природе синтрофный метаболизм является важной промежуточной стадией в анаэробной конверсии био-
полимеров, таких как полисахариды, белки и липиды до углекислого газа и метана [8]. В реакциях метаногенеза архея использует водород и поддерживает его концентрацию на очень низком уровне, делающим сбраживание жирных кислот энергетически выгодным для T. lipolytica [9]. Синтрофный рост на липидах обеспечивается за счет липаз, секретируемых из клетки в окружающую среду [7]. При росте в отсутствии синтроф-ного партнера липазы также синтезируются и секретируются из клетки, однако в этих условиях T lipolytica не способна использовать жирные кислоты и, следовательно, расти на липидах.
Способность микроорганизма использовать в качестве субстратов для роста сложные полимерные субстраты (белки, липиды, полисахариды и др.), которые не могут транспортироваться в клетку без предварительного расщепления, определяется наличием у него соответствующих гидролитических ферментов, секретируемых
из клетки в окружающую среду. Идентифицировать такие ферменты можно в результате выделения, очистки и биохимической характеристики «внеклеточных» белков с последующим определением N-концевой аминокислотной последовательности белка и кодирующего его гена. Однако, помимо сложности и трудоемкости этих операций, немаловажным является тот факт, что далеко не все ферментативные активности, закодированные в геноме, экспрессируются при лабораторном культивировании микроорганизма, и подавляющее большинство их остается неизвестным исследователям. В последнее десятилетие в мировой практике расширилось применение нового подхода к поиску ферментов — определение полной геномной последовательности микроорганизма, позволяющее идентифицировать не какой-то один, а большую часть его ферментов (в оптимальном варианте — все) в результате анализа нуклеотидной последовательности. Ферменты, кодируемые идентифицированными генами, могут быть затем клонированы и экспрессированы в стандартных бактериях-про-дуцентах, таких как Escherichia coli. Таким образом, анализ геномных данных позволяет предсказать пути метаболизма микроорганизма и потенциальные субстраты для его роста, неизвестные из результатов его микробиологической характеристики в лабораторных условиях.
Цель исследования: идентифицировать в результате расшифровки геномной последовательности и охарактеризовать биоин-формационными методами секретируемые гидролитические ферменты, кодируемые геномом T. lipolytica.
Материалы и методы исследования
Штамм T. lipolytica был выделен В. А. Светличным из щелочного озера Богория в Кении [9] и предоставлен нам для проведения данной работы. Нуклеотидная последовательность генома этой бактерии была определена нами методом пиросеквенирования на геномном анализаторе GS FLX [1]. Поиск открытых рамок считывания, способных кодировать белки, осуществляли с помощью программы GeneMark [4]. Для предсказания функций белков соответствующие аминокислотные последовательности сравнивали с базой данных NCBI с помощью BLASTP. Анализ аминокислотных последовательностей белков с целью идентификации N-концевых сигнальных последовательностей проводили с помощью программы SignalP v. 3.0 для грамположительных бактерий [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Поиск гомологов белковых продуктов, предсказанных открытых рамок считывания, кодируемых в геномных последовательностях T. lipolytica по базе данных NCBI по-
зволил идентифицировать гидролитические ферменты различных классов. Для изучения путей метаболизма T. lipolytica и возможности использования этой бактерией различных полимерных субстратов интерес представляют ферменты, секретируемые из клетки в окружающую среду. Для поиска таких ферментов с использованием программы SignalP 3.0 был проведен анализ того, содержат ли аминокислотные последовательности кодируемых белков N-концевые сигнальные последовательности, необходимые для секреции из клетки. Список гидролитических ферментов, в которых были идентифицированы такие сигнальные последовательности, приведен в таблице.
Наибольшую долю среди потенциально секретируемых гидролаз составляют про-теолитические ферменты различных типов, что согласуется с возможностью роста T. lipolytica на белковых субстратах. Отметим, что не все пептидазы, содержащие сигнальные пептиды, обязательно участвуют в деградации присутствующих в среде белков, некоторые из них могут обеспечивать процессинг собственных белков клетки.
В гидролизе внеклеточных белков, вероятно, ключевую роль играет продукт гена
1588, Tlip_1588. Этот фермент является се-
риновой протеазой семейства S8/S53, аналогом субтилизина. Его гомологи кодируются в геномах многих протеолитических термофильных бактерий и архей (напр. пиролизин в Pyrococcus furiosus DSM3638), некоторые их них функционально охарактеризованы.
Ближайшие гомологи Tlip_____1588 найдены
в геномах родственных T. lipolytica термофильных фирмикут родов Thermaerobacter, Thermincola и Tepidanaerobacter. Аминокислотная последовательность протеазы
Tlip_1588 содержит три копии SLH домена
(S-layer domain, pfam00395) в N-концевой области и каталитический домен первого субсемейства пептидаз семейства S8 (Peptidase S8 family domain, subfamily 1). Многие функционально охарактеризованные гомологи Tlip___1588 активны при вы-
соких температурах в присутствии денатурирующих агентов [2] и рассматриваются в качестве перспективных ферментов для биотехнологического применения.
Важную роль в гидролизе белковых субстратов вне клетки может также играть Tlip_1807. Это сериновая протеаза, относя-
щаяся к трипсиноподобным ферментам. Она содержит С-концевой PDZ домен, вовлеченный в белок-белковые взаимодействия и обеспечивающий распознавание суб-
страта. Аналогичную доменную структуру («трипсиновый» домен и PZD домен) имеет трипсиноподобная протеаза Tlip_2148.
Гидролитические ферменты T. lipolytica, содержащие N-концевые сигнальные последовательности
Ген Предсказанная функция белка Размер белка (ао.) Длина сигнального пептида (а.о.) Вероятность наличия сигнального пептида
Протеолитические ферменты
6s Пептидаза семейства М23 В 385 32 1. 000
б9 Серинования пептидаза семейства 841, процес-сируящая С-конец белков 372 23 0. 915
292 Пептидаза семейства М23 В 287 26 0. 997
1204 Карбоксипептидаза семейства М14 466 26 1. 000
1317 Сигнальная пептидаза, сериновая пептидаза семейства 849 (класс С1рР) 298 28 0. 999
1588 Сериновая протеаза семейства 88/853 1051 26 1. 000
1728 Карбоксипептидаза серинового типа 376 31 0. 981
1807 Сериновая протеаза, трипсин 359 24 0. 966
2037 Пептидаза семейства М50 237 38 1. 000
2038 Металлоэндопептидаза 190 28 0. 999
2148 Пептидаза семейства 81/86, хемотрипсин 382 45 0. 861
2235 Пептидаза семейства М48 311 39 0. 640
2258 Карбоксипептидаза серинового типа 384 30 1. 000
Липолитические ферменты
786 Липаза 478 28 1. 000
1200 Липаза 523 31 0. 999
Ферменты, участвующие в гидролизе полисахаридов
937 Гликозил гидролаза семейства GH18 270 25 1. 000
1727 Полисахарид деацетилаза 242 30 0. 818
2341 Полисахарид деацетилаза 247 36 0. 998
Функции остальных протеаз, последовательности которых содержат сигнальные пептиды, либо неясны, либо связаны
с клеточным метаболизмом. Так, Tlip__0069
относится к С-концевым пептидазам, которые участвуют в деградации некорректно синтезированных белков и защите от теплового и осмотического стресса.
Tlip_1204 — карбоксипептидаза семейства
М14, гомологичные ей ферменты участвуют в процессах споруляции. Tlip____1317 —
сингнальная пептидаза, обеспечиваю-
щая процессинг сигнальных пептидов.
Tlip_2037 — металлопротеаза семейства
М50, представители которого также принимают участие в споруляции.
Внеклеточный гидролиз липидов по всей вероятности обеспечивается двумя липазами, кодируемыми генами Tlip_0788
и Tlip_1200. Ранее из T. lipolytica были
выделены и функционально охарактеризованы две липазы, проявлявшие максимум активности при температуре около 96 °C и рН 9,5 [7], однако соответствующие гены не были идентифицированы. Недавно мы клонировали, экспрессировали в E. coli и функционально охарактеризовали рекомбинантную липазу, являющуюся
продуктом гена Tlip_07SS [1]. Было уста-
новлено, что эта липаза способна осуществлять гидролиз триацилглицеридов, в том числе растительных масел, на которых T. lipolytica способна расти в ассоциации с метаногенными археями.
Лишь три «внеклеточных» фермента могут принимать участие в процессах утилизации полисахаридов. Это гликозил-ги-дролаза семейства GH1S, включающего хитиназы II типа [б], и две полисахарид де-ацетилазы, возможно, обладающие хитин-деацетилазной активностью. Возможность роста T. lipolytica на хитине не была исследована, однако известно, что этот полимер в больших количествах имеется в содовых озерах, являясь компонентом панциря обитающих в них креветок рода Artemia [5]. Отсутствие других секретируемых глико-зил-гидролаз согласуется с неспособностью T. lipolytica расти на полисахаридных субстратах [9].
Выводы
Геном термоалкалофильной бактерии T. lipolytica кодирует набор гидролитических ферментов, которые могут секрети-роваться из клетки в окружающую среду.
Идентифицированные протеазы различных типов и липазы обеспечивают использование T. lipolytica белковых субстратов и липидов соответственно. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.
Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 — 2013 годы, государственный контракт П479).
Список литературы
1. Гумеров В. М., Марданов А. В., Колосов П. М., Ра-вин Н. В. Выделение и характеристика липазы из термоал-калофильной бактерии Thermosyntropha lipolytica // Прикладная биохимия и микробиология. — 2012. — Т. 4S. — № 4. -С. 376−382.
2. Antranikian G., Vorgias C.E., Bertoldo C. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalysts // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. — 2005. -Vol. 9б. — P. 219−2б2.
3. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S.J. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. — 2004. — Vol. 340(4). — P. 783−795.
4. Besemer J., Borodovsky M. GeneMark: web software for gene finding in prokaryotes, eukaryotes and viruses // Nucleic Acids Res. — 2005. — Vol. 33. — P. 451−454.
5. Gooday G. The ecology of chitin degradation. In: Marshall K. (ed) Advances in microbial ecology. — 1990 — Plenum Press, New York. — P. 387−430.
6. Karlsson M., Stenlid J. (2008) Evolution of family 18 glycoside hydrolases: diversity, domain structures and phylogenetic relationships // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. — 2009. -Vol. 16 (3^). — P. 20S-223.
7. Salameh M.A., Wiegel J. Purification and characterization of two highly thermophilic alkaline lipases from Ther-mosyntropha lipolytica // Appl. Environ. Microbiol. — 2007. -Vol. 73(23). — P. 7725−7731.
8. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in meth-anogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 1997. -Vol. б1. — P. 2б2−280.
9. Svetlitshnyi V., Rainey F., Wiegel J. Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, anaerobic, alkalitoler-
ant, thermophilic bacterium utilizing short and long chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum // Int. J. Syst. Bacteriol. — 199б. — Vol. 4б. — P. 1131−1137.
References
1. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Kolosov P.M., Ravin N.V. Vydelenie i kharakteristika lipazy iz termoalkalofil’nojj bakterii Thermosyntropha lipolytica // Prikladnaja biokhimija i mikrobiologija. 20i2. T. 4S, no. 4. pp. 376−382.
2. Antranikian G., Vorgias C.E., Bertoldo C. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalysts // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2005 Vol. 9б, pp. 219−2б2.
3. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S.J. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004 Vol. 340(4), pp. 783−795.
4. Besemer J., Borodovsky M. GeneMark: web software for gene finding in prokaryotes, eukaryotes and viruses // Nucleic Acids Res. 2005 Vol. 33, pp. 451−454.
5. Gooday G. The ecology of chitin degradation. In: Marshall K. (ed) Advances in microbial ecology. 1990 Plenum Press, New York, pp. 387−430.
6. Karlsson M., Stenlid J. (2008) Evolution of family 18 glycoside hydrolases: diversity, domain structures and phylogenetic relationships // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2009 Vol. 1б (3−4), pp. 208−223.
7. Salameh M.A., Wiegel J. Purification and characterization of two highly thermophilic alkaline lipases from Ther-mosyntropha lipolytica // Appl. Environ. Microbiol. 2007 Vol. 73(23), pp. 7725−7731.
8. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in meth-anogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997 Vol. б1, pp. 2б2−280.
9. Svetlitshnyi V., Rainey F., Wiegel J. Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, anaerobic, alkalitolerant, thermophilic bacterium utilizing short and long chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum // Int. J. Syst. Bacteriol. 199б. Vol. 4б. pp. 1131−1137.
Рецензенты:
Бонч-Осмоловская Е.А., д.б.н., зам. директора по научной работе ФГБУН Института микробиологии им. С. Н. Виноградского Российской академии наук, г. Москва-
Замчук Л. А., д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБУН Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, г. Москва.
Работа поступила в редакцию 07. 11. 2012.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой