Патогенный потенциал Klebsiella spp. И Staphylococcus aureus при ассоциативном симбиозе у детей первого года жизни

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 579. 262
ПАТОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ KLEBSIELLA SPP. И STAPHYLOCOCCUS AUREUS ПРИ АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
1Бухарова Е.В., 1Долгих В.В., 1Попкова С.М., иРакова Е.Б., Шабанова Н. М., 1Немченко У.М., 1Иванова Е.И., 1Сердюк Л.В.
'-ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск,
e-mail: buxarowa. ekaterina@yandex. ru- 2ГБОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет МЗ РФ, Иркутск
В работе представлена микроэкологическая характеристика аутоштаммов Klebsiella spp. в кишечной микробиоте детей первого года жизни, а также результаты чувствительности к антибиотическим препаратам и к специфическим лечебным бактериофагам. Выделенные штаммы клебсиелл (n=100) характеризовались высоким уровнем чувствительности к антибиотикам и низкой чувствительностью к бактериофагам. Регистрация исследованных детерминант в ДНК аутоштаммов Klebsiella spp. (n=100) и Staphylococcus aureus (n=40), не относящихся к клиническим изолятам, свидетельствовала о циркуляции среди них факторов патогенности и, следовательно, о возможной этиологической роли в формировании дисбиотических процессов у детей раннего возраста.
Ключевые слова: Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, кишечная микробиота, ассоциативным симбиоз, гены патогенности
PATHOGENIC POTENTIAL OF KLEBSIELLA SPP. AND STAPHYLOCOCCUS
AUREUS IN ASSOCIATIVE SYMBIOSIS IN CHILDREN FIRST YEAR OF LIFE
1Bukharova E.V., 1Dolgikh V.V., 1Popkova S.M.,Rakova E.B., 1Shabanova N.M., 1Nemchenko U.M., 1Ivanova E.I., 1Serdyuk L.V.
'-Research Center of family health and human reproduction problems, Irkutsk, e-mail: buxarowa. ekaterina@yandex. ru-
2Institute of Biomedical Technology Irkutsk state medical university, Irkutsk
Microecological characteristics Klebsiella spp. strains as well as the results of the antibiotic and specific therapeutic bacteriophages sensitivity in infants intestinal microbiota were presented. Isolated Klebsiella strains (n = 100) were characterized by a high antibiotic and low bacteriophages sensitivities. Investigated determinants detection in DNA of non-clinical isolates of Klebsiella spp. (n = 100) and Staphylococcus aureus (n = 40) indicated to the circulation of these pathogenicity factors and their possible role in the dysbiotic disorders in infants.
Keywords: Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, intestinal microbiota, associative symbiosis, pathogenicity genes
Дисбиотические нарушения в настоящее время широко распространены в России и за рубежом. Особенно часто встречается дисбиоз кишечника, от которого, по данным различных исследователей, в той или иной степени страдает до 90% населения страны [1]. Самым многочисленным как по видовому разнообразию, так и в количественном отношении является ассоциативный симбиоз микробных сообществ толстого кишечника [3]. У детей первого года жизни с высокой частотой и в этиологически значимых количествах выделяются клебсиеллы и золотистый стафилококк, что делает этот возраст уязвимым для развития эндогенных гнойно-воспалительных процессов различной локализации [2]. Микробиоценоз кишечника характеризуется неустойчивостью, связанной с микробной сукцессией при формировании микробио-ты, особенностями иммунной системы, неадекватным иммунным ответом организма на заселение кишечника УПМ [1- 3]. Од-
нако мало изученными остаются вопросы, связанные с распространенностью и взаимодействием генетических маркеров патогенности среди клебсиелл и стафилококков, персистирующих совместно в кишечном биотопе. Низкая эффективность эмпирического использования антибиотиков в сочетании с их побочным иммуносупрес-сивным эффектом приводит к подавлению нормальной микрофлоры кишечника и последующим формированием дисбиозов. Среди альтернативных антимикробных препаратов особый интерес представляют бактериофаги. В то время как антибиотики воздействуют на широкий спектр бактерий, в том числе и на нормальную микрофлору, бактериофаги обладают выраженной специфичностью [6].
Цель исследования. Оценить патогенный потенциал аутоштаммов Klebsiella spp. в ассоциации со Staphylococcus aureus, изолированных от детей первого года жизни с дисбиозами кишечника посредством де-
текции генетических детерминант патоген-ности.
Материалы и методы исследования
Были исследованы копрологические пробы 100 детей первого года жизни, у которых на основании микробиологических критериев был установлен дисбиоз кишечника с индикацией клебсиелл в диагностически значимых концентрациях (& gt-104 КОЕ/г) [8]. Исследуемая выборка была разделена на две группы: группа 1 — 60 детей, у которых аутоштам-мы клебсиелл выделялись в монокультуре- группа 2 — 40 детей, у которых клебсиеллы вегетировали в ассоциации с золотистым стафилококком. Анти-биотикорезистентность клебсиелл определяли диско-диффузионным методом [7]. Использовались антибиотические препараты (АБП) следующих групп: ?-лактамы (амоксициллин, цефтазидим, ампициллин, цефотаксим), аминогликозиды (амикацин), хинолоны (норфлоксацин). Фагочувствительность определялась к коммерческим препаратам бактериофагов -«очищенному фагу клебсиелл пневмонии», «очищенному бактериофагу клебсиелл поливалентному» и «пиобактериофагу поливалентному» («Секстафаг») производства НПО «Микроген» г. Пермь. Тестирование проводилось согласно [4]. Бактериологический анализ содержимого толстой кишки производили согласно [8] и в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями. Выделенные микроорганизмы идентифицировали общепринятыми методами [1]. Всего для ПЦР детекции факторов патогенности использовали 140 проб, где в группе 1 были типи-рованы 60 проб с Klebsiella spp., а в группе 2 — по 40 проб Klebsiella spp. и Staphylococcus aureus. Для выделения ДНК бактерий из культуральной среды использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-В» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Типи-рование проводили с шестью парами праймеров [2], отобранных согласно рекомендациям [5- 9- 10].
Для ПЦР-амплификации использовали коммерческий набор AmpliSens-200−1 (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР проводили с ДНК-матрицы (3 мкл), прямого и обратного праймеров (1 мкл). ДНК амплифицировали в соответствии с протоколом [2]. Электрофорез ПЦР-фрагментов ДНК клебсиелл проводили с использованием 1,0%-го агарозного геля в 1% трис-ацетатном буфере в течение 60 мин при 100 В, окрашивали бромистым этидием (1%) и просматривали с помощью УФ-просвечивания. Выделенные гены были идентифицированы и определены на основе размера фрагмента ДНК продукта [2] при его соответствии с длиной маркерного фрагмента. Исследования проводились в течение 2012−2014 гг. Для статистической обработки результатов использовали Excel из пакета MS Office 2003.
Результаты исследования и их обсуждение
В обследованной группе детей первого года жизни Klebsiella spp. была выделена в 60% случаев, в том числе в ассоциации с золотистым стафилококком — в 40%. Также был выявлен микроэкологический дисбаланс, который характеризовался дефицитом бифидобактерий (63,1±4,8), лактобацилл (6,8±2,5), нормальной кишечной палочки (11,7±3,2) на фоне высокой плотности бактерий рода Klebsiella (& gt-104 КОЕ/г). В мазках 60% аутоштаммов клебсиелл имели плотную полисахаридную капсулу, которая способствовала усилению гидрофобности клеточной стенки и препятствует проникновению фагов и АБП в клетку. Клебсиеллы чаще встречались в ассоциациях с Enterococcus spp. (78,6±4,1), Staphylococcus aureus (40,8±4,9) — реже — с E. coli со слабой ферментативной активностью (26,2±4,4), Clostridium spp. (25,2±4,3) и грибами рода Candida (15,5±3,6). Далее по частоте убывания регистрировались E. coli с гемолитической активностью (13,6±3,4), коагулазонегативные виды стафилококка (4,9±2,2), Proteus spp. (3,0±1,7), Enterobacter spp. (2,0±1,4), Citrobacter frendii (2,0±1,4).
Установлено, что исследуемые штаммы клебсиелл (n=100) были чувствительны практически ко всем тестируемым антибиотикам. Процент штаммов чувствительных к ?-лактамным антибиотикам составлял 85±3,5% (цефтазидим), 83±3,8% (амоксициллин), 89±3,1% (цефотаксим). Исключение составил ампициллин, к которому были резистентны 70±4,5% штаммов. Полученные данные подтверждают факт природной устойчивости клебсиелл к ампициллину. Также был высок процент штаммов чувствительных к амикацину и норфлоксацину (по 92±2,7% случаев соответственно).
Результаты чувствительности штаммов Klebsiella spp. (n=156) к коммерческим препаратам бактериофагов представлены в табл. 1.
Таблица 1
Характеристика чувствительности аутоштаммов Klebsiella spp к бактериофагам, (%)
Активность бактериофага Бактериофаг поливалентный (n=50) Бактериофаг клебсиелл пневмоний (n=50) Бактериофаг Секста (n=56)
0−1×66,0±6,7 76,0±6,0 59,0±6,6
2×24,0±6,0 16,0±5,1 39,2±6,5
3−4×10,0±4,2 8,0±3,8 1,8±1,7
Примечание. 0−1х — штамм нечувствителен- 2х — не более 50 отдельных негативных колоний- 3х — полусливной лизис со вторичным ростом- 4х — сливной лизис.
У аутоштаммов клебсиелл наблюдалась слабая чувствительность (0−1х) к бактериофагу поливалентному, фагу клебсиелл пневмоний и «Секстафагу» (66,0, 76,0 и 59,0% штаммов соответственно). Средний уровень чувствительности (2х) штаммов клебсиелл регистрировался в 24,0% случаев к бактериофагу поливалентному- в 40% случаев к бактериофагу «Секста», что более, чем в два раза превышало частоту встречаемости штаммов, чувствительных к фагу клеб-сиелл пневмоний (16,0% случаев). Высокий уровень чувствительности (3−4х) наблюдался у 10,0% штаммов Klebsiella spp. к бактериофагу поливалентному, у 8,0% штаммов к бактериофагу клебсиелл пневмоний, и всего лишь в 1,8% случаев к «Секстафагу». Таким образом, в целом региональные штаммы клебсиелл характеризовались низким уровнем чувствительности к специфическим лечебным бактериофагам, что могло быть одной из основных причин низкой эффективности терапии используемыми в настоящее время коммерческими бактериофагами.
Был произведён скрининг изолятов Klebsiella spp. на наличие нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности mag A,
Ген mag A у клебсиелл был обнаружен только в сочетании с геном uge (2,5%) второй группы детей, что свидетельствовало о редкой встречаемости штаммов способных продуцировать слизистую субстанцию повышенной вязкости. Сочетания генов uge+kfu регистрировались примерно на одном уровне в обеих группах (8,3% и 12,5% случаев соответственно). Сочетания генов uge+bfp были выявлены в образцах клеб-
uge, kfu, bfp, stx 1, stx 2 [2- 5- 9- 10]. В ау-тоштаммах клебсиелл обеих групп частота встречаемости гена uge, кодирующего уридин-дифосфат-галактозо-4-эпимеразу и оказывающего существенное влияние на вирулентность, регистрировалась в 28,3% и 22,5% случаев соответственно. Также этот ген был обнаружен у стафилококка в ассоциации с Klebsiella spp. в 12,5% случаев. Ген kfu, кодирующий систему поглощения железа, не был зарегистрирован у штаммов клебсиелл 1 группы, в то время как у аутош-таммов клебсиелл, вегетирующих совместно с золотистым стафилококком (группа 2) — выявлялся с одинаковой частотой как у клебсиелл, так и у золотистого стафилококка (2,5% случаев соответственно). Ген bfp, кодирующий связывание пилей, был выявлен не только у клебсиелл обеих групп (6,7 и 2,5% случаев соответственно), но и у S. aureus в 15% случаев, что говорит о высоком адгезивном потенциале ассоциации клебсиелл и золотистого стафилококка. У детей второй группы в 15% случаев был выявлен ген stx 1, что почти в три раза меньше чем у образцов клебсиелл в монокультуре (6,7%). Ген stx 2 был обнаружен только в 3,3% случаев у образцов клебсиелл в монокультуре (табл. 2).
сиелл как в монокультуре (16,7%), так и в образцах клебсиелл в ассоциации (10,0%). Также данное сочетание генов патогенности было выявлено в 5,0% случаев у золотистого стафилококка. Сочетание генов uge+stx 1 были зарегистрированы только в образцах клебсиелл обеих групп почти с одинаковой частотой (11,7 и 12,5%), также как и сочетание генов bfp+stx 1 (1,7 и 2,5% случаев соответственно) (табл. 3).
Таблица 2
Характеристика изолятов Klebsiella spp. по признаку детекции генов патогенности
Гены патогенности 1 Группа 2 Группа
Клебсиелла в монокультуре (n=60) Клебсиелла в ассоциации с S. aureus (n=40) S. aureus (n=40)
mag A 0 0 0
uge 17/28,3±5,8 9/22,5±6,6 5/12,5±5,2
kfu 0 ½, 5±2,5 ½, 5±2,5
bfp 4/6,7±3,2 ½, 5±2,5 6/15,0±5,6
stx 1 4/6,7±3,2 6/15±5,6 0
stx 2 2/3,3±2,3 0 0
Примечание. Количество изолятов / частота встречаемости, (%).
Таблица 3
Парные сочетания генов патогенности, %
Двойные сочетания генов Группа 1 Группа 2
Клебсиелла в монокультуре (n=60) Клебсиелла в ассоциации с золотистым стафилококком (n=40) Золотистый стафилококк (n=40)
mag A+uge 0 ½, 5±2,4 0
uge+kfu 5/8,3±3,6 5/12,5±5,2 0
uge+bfp 10/16,7±4,8 4/10,0±4,7 2/5,0±3,4
uge+stx 1 7/11,7±4,1 5/12,5±5,2 0
bfp+stx 1 1/1,7±1,6 ½, 5±2,4 0
Примечание. Количество изолятов / частота встречаемости, (%).
Сочетания трех и более генов патоген- новном, в образцах клебсиелл в монокуль-ности встречались достаточно часто, и в ос- туре (табл. 4).
Таблица 4
Сочетания трех и более генов патогенности, %
Группа 1 Группа 2
Тройные сочетания генов Клебсиелла в монокультуре (п=60) Клебсиелла в ассоциации с золотистым стафилококком (n=40) Золотистый стафилококк (n=40)
uge+kfu+stx 1 2/3,3±2,3 3/7,5±4,1 0
uge+bfp+stx 1 0 ½, 5±2,4 0
bfp+stx 1+stx 2 1/1,7±1,6 0 0
uge+kfu+bfp 2/3,3±2,3 0 0
uge+kfu+bfp+stx 1 1/1,7±1,6 0 0
Примечание. Количество изолятов / частота встречаемости, (%).
скими, а вегетирующих в кишечнике детей в качестве составляющей аллохтонной микробиоты, может быть сосредоточен достаточно заметный патогенный потенциал. Выявление генов патогенности у штаммов Klebsiella spp. в ассоциации со S. aureus различной степени вирулентности показало увеличение частоты встречаемости искомых ампликонов. Следовательно, в результате взаимоадаптации микросимбионтов происходило увеличение численности особей, в генотипе которых локализованы uge, kfu, mag A, bfp, stx 1, stx 2 гены и их сочетания, что явилось свидетельством их взаимного влияния на способность реализации патогенного потенциала в условиях ассоциативного симбиоза. А взаимовлияние ассоциативных симбионтов приводит к селекции и накоплению вирулентных вариантов в бактериальной популяции, которые могут быть этиологически ассоциированными с заболеваниями кишечного тракта.
Решение вопроса о роли клебсиелл с набором генов патогенности, а также их
Наиболее часто у клебсиелл, вегетирующих в составе исследуемых ассоциаций, регистрировалось сочетание генов uge+kfu+stx 1 (7,5%). У образцов клеб-сиелл первой группы были выявлены сочетания четырех генов патогенности uge+kfu+bfp+stx 1 (1,7%).
Заключение
У детей первого года жизни, в кишечном биотопе которых регистрировалась высокая популяционная плотность клебсиелл, вегетировали штаммы с наличием генов патогенности. Исследуемые аутоштаммы клебсиелл (п=100) были чувствительны практически ко всем тестируемым антибиотикам разных групп. Региональные штаммы клебсиелл характеризовались низким уровнем чувствительности к специфическим лечебным бактериофагам, что может быть одной из основных причин низкой эффективности терапии используемыми в настоящее время коммерческими бактериофагами.
Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что среди штаммов клебсиелл, не являющихся клиниче-
ассоциаций с золотистым стафилококком, с высокой частотой встречающихся в кишечнике детей первого года жизни, требует пристального внимания учёных и клиницистов и необходимости дальнейшего изучения.
Список литературы
1. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. — М.: ГЭОТАР-медиа, 2007. — С. 18−27.
2. Бухарова Е. В. Детекция некоторых генетических маркеров факторов патогенности в аутоштаммах Klebsiella spp. у детей первого года жизни / Е. В. Бухарова, С. М. Попкова, Е. Б. Ракова, Ю. П. Джиоев, Е. И. Иванова, Н. М. Шабанова, УМ. Немченко // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. — 2014. -№ 2 (96). — С. 58−62.
3. Бухарин О. В. Инфекция — модельная система ассоциативного симбиоза // Журнал микробиологии. — 2009. -№ 1. — С. 83−86.
4. Голубева И. В. Энтеробактерии: Руководство для врачей — М.: Медицина, 1985. — C. 241−303.
5. Иванова Е. И. Выявление генов патогенности, кодирующих способность к токсинообразованию, у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей / Е. И. Иванова, С. М. Попкова, Ю. П. Джиоев, Е. Б. Ракова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. — 2013. — № 2(90), Ч. 2. -С. 111−114.
6. Красильников И. В. Препараты бактериофагов: краткий обзор современного состояния и перспектив развития / И. В. Красильников, К. А. Лыско, Е. В. Отрашевская, А. К. Лобастова // Сибирский медицинский журнал. — 2011. -Т. 26. — № 2 (2). — C. 33−37.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2. 1890−04.
8. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» / ОСТ 91 500. 11. 0004−2003. Приказ М З РФ № 231 от 09. 06. 2003. — 70 с.
9. Aher T., Roy A., Kumar P. Molecular detection of virulence genes associated with pathogenicity of Klebsiella spp. isolated from the respiratory tract of apparently healthy as well as sick goats // Israel Journal of Veterinary Medicine. — 2012. -Vol. 67, № 4. — Р. 249−252.
10. Regue M., Hita B., Pique A. Gene uge is essential for K. pneumoniae virulence // Infect. Immun. — 2004. — Р. 54−61.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой