Модуляция экспрессии CD38 в клетках головного мозга ретиноевой кислотой

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

© САЛМИНА А.Б., МАЛИНОВСКАЯ Н.А., ОКУНЕВА О.С., ЗЫКОВА Л. Д., ЮДИН Г. В., ЛАЛЕТИН Д.И., ФРОЛОВА О.А., ФУРСОВ М.А., ФУРСОВА А. А.
МОДУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СБ38 В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТОЙ
А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева, Л. Д. Зыкова, Г. В. Юдин, Д. И. Лалетин, О. А. Фролова, М. А. Фурсов, А.А. Фурсова
Кафедра биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии- руководитель — д.м.н., проф. А.Б. Салмина- Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор — д.м.н. ,
проф. И. П. Артюхов.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента Р Ф (МД-2826. 2007. 7).
Резюме. Представлены данные экспериментального исследования особенностей экспрессии € 038 в ткани головного мозга крыс, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение, и ее регуляции модуляторами метаболизма эндогенной ретиноевой кислоты или препаратом экзогенной ретиноевой кислоты. Обсуждается возможность использования обнаруженного эффекта при разработке фармакологического метода нейропротекции.
Ключевые слова: € 038, ретиноевая кислота, экспрессия.
По данным экспертов ВОЗ, до 65−80% патологии нервной системы у детей связано с перинатальным поражением головного мозга. В 35−40% случаев заболевания нервной системы приводят к инвалидизации и дезадаптации детей, частота перинатальной патологии в общей популяции продолжает расти [1, 3]. Заболеваемость новорожденных в период с 1990 по 2002 гг. увеличилась в 2,3 раза преимущественно за счет внутриутробной гипоксии и асфиксии при рождении (с 61,9%о в 1991 г. до 170,9%о в 2002 г. — в 2,8 раза) (http: //www. euro. who. int/document/Mediacentre/fs0305r. pdf). В патогенезе гипоксически-ишемического перинатального поражения ЦНС ключевые события развиваются стадийно. Каждый этап характеризуется определенными клеточно-молекулярными событиями: нарушение
электровозбудимости нейронов, окислительный стресс, микроциркуляторные расстройства, гиперпродукция цитокинов, изменение секреции и рецепции нейротрансмиттеров, развитие апоптоза и некроза [17]. Направленная регуляция каждого из этих процессов составляет основу современной стратегии нейропротекции при перинатальном поражении ЦНС.
СБ38 — бифункциональный фермент, экспрессирующийся в различных клетках млекопитающих, в том числе электровозбудимых, его ферментативная активность контролируется многими факторами, в частности, структурой каталитического центра и сохранностью сульфгидрильных остатков цистеина в его пределах, уровнем внутриклеточных АТФ и НАДН, внутриклеточной локализацией фермента (плазматическая мембрана, митохондриальная мембрана, ядерная мембрана, цитозоль), конформационной пластичностью и способностью формировать димеры в мембране для эффективного транспорта продукта реакции, действием лигандов [9, 16].
СБ38 экспрессируют как нейроны, так и астроциты. В ЦНС активность АДФ-рибозилциклазы обнаруживается уже в периоде эмбрионального развития млекопитающих [6] и прогрессивно увеличивается в постнатальном периоде. Ранее нами [2] было показано, что экспрессия и активность СБ38
изменяются в динамике раннего постнатального периода развития головного мозга, и эти процессы нарушаются в результате перенесенного перинатального гипоксически-ишемического повреждения.
Известно, что в клетках различной природы экспрессия CD38 регулируется ретиноевой кислотой, трийодтиронином, эстрогенами, глутаматом, интерлейкинами, а продукция циклической АДФ-рибозы -гормонами/нейротрансмиттерами, оксидом азота, цинком, НАДН. Ранее было показано, что в клетках нейрональной природы активность фермента регулируется за счет активации мускариновых ацетилхолиновых рецепторов [10, 11]. Анализ литературных данных дает право сделать вывод о том, что в пролиферирующих клетках экспрессия CD38 регулируется преимущественно дифференцировочными агентами (например, ретиноевая кислота стимулирует экспрессию фермента в гемопоэтических клетках), а в постмитотических клетках — агентами, регулирующими их функциональную активность специфическим образом (например, в центральной нервной системе — нейротрансмиттерами, нейростероидами), а также модуляторами активности НАД-гликогидролаз (например, никотинамидом). Стимуляция экспрессии CD38 на астроцитах зарегистрирована при нейрон-глиальных взаимоотношениях, в частности, за счет действия глутамата [4].
Ретиноевая кислота (РК) является одним из мощных агентов, регулирующих процессы морфогенеза в нервной системе, в частности, индуцирующих нейрональную дифференцировку в специфических популяциях клеток головного мозга (например, стволовых клетках гиппокампа или субвентрикулярной зоны) [12, 20]. Под контролем
ретиноидов находится экспрессия значительного количества генов в клетках нейрональной и глиальной природы, в частности, кодирующих белки-транспортеры, дофамингидроксилазу, декарбоксилазу глутаминовой кислоты, рецепторы, сопряженные с Gp, ионотропные рецепторы, некоторые ионные каналы, белки цитоскелета, внутриклеточные сигнальные молекулы, фактор роста нервов, молекулы, ассоциированные с нейродегенерацией [13].
Ретиноевая кислота принадлежит к категории регуляторных эндогенных молекул, продуцируемых астроглией [13]. Синтез ретиноевой кислоты осуществляется за счет фермента ретинальдегиддегидрогеназы, причем транзиторная высокая экспрессия некоторых изоформ этого фермента ассоциирована в раннем постнатальном периоде с колонизацией некоторых отделов мозга нейрональными предшественниками и с созреванием отдельных частей коры головного мозга [18]. Метаболизм ретинола до ретинальдегида и ретиноевой кислоты контролируется ферментом, вовлеченным в биотрансформацию этанола — алкогольдегидрогеназой (АДГ). Алкогольдегидрогеназа ответствененна за удаление избытка ретинола за счет его трансформации в РК. Коль скоро АДГ может использовать этанол или ретинол как субстрат, этанол действует как конкурентный ингибитор АДГ-катализируемого окисления ретинола, блокируя тем самым один из эффективный путей эндогенного синтеза ретиноевой кислоты [7, 14].
Целью работы явилось изучение влияние ретиноевой кислоты на экспрессию CD38 в клетках коры головного мозга в раннем постнатальном периоде в физиологических условиях и после перенесенного перинатального гипоксически-ишемического поражения центральной нервной системы.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на белых беспородных новорожденных крысятах (n=51).
Моделирование гипоксически-ишемического перинатального поражения головного мозга осуществлялось по методу J. Rice [15] на 7 сутки постнатального развития выполнена экстравазальная окклюзия правой общей сонной артерии с последующим помещением крысят в атмосферу с низким содержанием кислорода (8%) под общей анестезией. Забор материала для исследования (головной мозг) производили через 8 ч., 72 ч и 10 суток после операции (7, 10 и 17 сутки постнатального развития, соответственно — P7, P10, P17), а также в отсроченный период (3, 4, 5 и 6 недели после поражения
головного мозга). Контрольную группу составили ложно-оперированные животные. Все экспериментальные исследования производились с соблюдением правил гуманного обращения с животными.
Детекция CD38 в клетках головного мозга осуществлялась в замороженных фиксированных срезах головного мозга по стандартному протоколу иммуногистохимического исследования с использованием антител к CD38 («Сорбент», Москва). В силу наличия высокой гомологии CD38 человека, крысы и мыши, мы использовали антитела к антигену человеческого происхождения. После инкубации срезов с первичными антителами (1: 50, 2 часа при температуре 37оС) и вторичными FITC-мечеными анти-мышиными антителами (1: 200, 1 час при температуре 4оС) визуализация комплекса «антиген-антитело» осуществлялась при люминесцентной микроскопии (увеличение х900) с подсчетом относительного количества клеток, экспрессирующих антиген в мембранной или примембранной области или в цитоплазме диффузно.
Статистический анализ полученных результатов включал методы статистического описания и проверки статистических гипотез. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. При условии соответствия нормальному закону распределения оценку достоверности различий осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и Т-теста. Для показателей, не имеющих нормального распределения, использовались методы непараметрической статистики (различия количественных показателей между двумя группами оценивалась по критерию Колмогорова-Смирнова).
Результаты и обсуждение
Анализ количества CD38+ клеток в препаратах головного мозга крысят контрольной и опытной подгрупп продемонстрировал, что характер экспрессии CD38 меняется после гипоксически-ишемического поражения ЦНС. В контрольной группе животных уровень экспрессии CD38 сохраняется стабильным в период с 7 суток постнатального периода
(4,4±0,9%) до 17 суток жизни (3,6±0,5%) (табл. 1). Возраст крысят с 28 по 35 сутки развития обращает на себя внимание тем, что количество СБ38-экспрессирующих клеток нейрональной и глиальной природы в этот период достоверно уменьшается до 1,1±0,5% (р=0,001 в сравнении с подгруппами Р7″, Р7, Р10, Р17). После этого спада экспрессия СБ38 клетками головного мозга вновь возвращается (р& lt-0,005 в сравнении с подгруппами Р28 и Р35) к стабильным исходным значениям на 42 и 49 сутки (4,6±0,5% и 4,2±0,5%, соответственно) (табл. 2).
Перенесенное перинатальное поражение головного мозга привело к достоверному снижению экспрессии фермента в первые 4 часа после поражения (2,9±0,7%, р=0,04 по сравнению с контрольным значением), с последующим статистически значимым повышением этого показателя к 8 часам после перинатальной гипоксии/ишемии до 7,7±1% (р=0,001 по сравнению с контрольным значением, 7 сутки постнатального развития) (рис. 1). Повышенная экспрессия СБ38 клетками головного мозга сохранялась до 10 суток постнатального развития, соответствующим 72-м часам после перенесенного поражения ЦНС, а далее регистрировалось достоверное снижение относительного количества СБ38+ клеток (р=0,001 по сравнению с подгруппами Р7 и Р10) к 17 суткам жизни крысят и далее к 28 суткам развития (3 неделям после гипоксии/ишемии головного мозга) (р=0,025 по сравнению с подгруппой Р17). На 4-ой неделе после поражения ЦНС, иными словами, к 35 суткам постнатального периода, вновь регистрируется нарастание относительного количества СБ38-экспрессирующих клеток головного мозга, продолжающееся до 42−49 суток постнатального периода (табл. 3). Итак, перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ткани головного мозга приводит к статистически значимому усилению экспрессии СБ38 в клетках нейрональной и глиальной природы через 72 часа после перенесенного повреждения.
Для оценки модулирующего эффекта ретиноевой кислоты на экспрессию СБ38 мы осуществляли введение препарата ретиноевой кислоты (аП-й'-а^-
retinoic acid, Sigma) в конечной концентрации 2G мг/кг массы совместно с этанолом для подавления эндогенного синтеза ретиноевой кислоты (за счет конкурентного ингибирования этанолом АДГ-опосредованного окисления ретинола) внутрибрюшинно, 1 раз в сутки, 2 дня до или после гипоксически-ишемического поражения головного мозга, а также введение этанола (G, 1 мл внутрибрюшинно, 1 раз в сутки, 2 дня до или после поражения). Коль скоро максимальной степени выраженности изменение экспрессии CD38 в ткани головного мозга было зарегистрировано нами через 72 часа после перенесенного повреждения, мы оценивали эффект ретиноевой кислоты на 1G сутки постнатального развития.
Мы обнаружили, что комбинация «ретиноевая кислота+этанол» и этанол изолированно достоверно снижают экспрессию CD38 в клетках головного мозга, при этом ретиноевая кислота в комбинации с этанолом проявляет больший эффект при введении в организм животного после ишемии, а этанол был одинаково эффективен при введении до и после гипоксически-ишемического поражения головного мозга (рис. 2). Наши данные
свидетельствуют о том, что подавление АДГ-опосредованного метаболизма эндогенного ретинола до ретиноевой кислоты вызывает достоверное снижение экспрессии CD38 в клетках коры головного мозга, в то время как введение на этом фоне экзогенной ретиноевой кислоты частично сокращает степень снижения экспрессии CD38 этанолом. Интересно, что на фоне значительного числа публикаций о нейротоксическом эффекте этанола, например, [8], существуют данные о нейропротективной его активности, опосредованной модуляцией механизмов НМДА-ассоциированной нейротоксичности [5], НАДФН-оксидаза-регулируемой продукции свободных радикалов [19]. Дополнительные исследования необходимы для изучения механизмов участия синтезируемой в ткани головного мозга ретиноевой кислоты в регуляции экспрессии CD38.
Полученные нами ранее данные подтверждают то, что увеличение экспрессии и активности CD38 в клетках коры головного мозга после
перенесенного перинатального гипоксически-ишемического поражения отражает механизмы активации клеток астроглиальной природы, что является как компонентом патогенеза повреждения ткани, так и важной составляющей процесса нейрорепарации [2]. В этом контексте действие агентов, влияющих на процессы, сопряженные с биологическими эффектами ретиноевой кислоты, открывает новые возможности для направленной фармакологической модуляции активности и экспрессии фермента, определяющего характер и степень активации/повреждения клеток нейрональной и/или астроглиальной природы.
Таким образом, перинатальное гипоксически-ишемическое поражение сопровождает увеличением экспрессии CD38 в клетках коры головного мозга in vivo.
Модуляция экспрессии CD38 в клетках коры головного мозга после перенесенного гипоксически-ишемического поражения достигается применением этанола как ингибитора конверсии ретинола в ретиноевую кислоту или экзогенной ретиноевой кислоты, что подтверждает роль эндогенных ретиноидов в регуляции экспрессии гена, кодирующего CD38, в ткани головного мозга.
MODULATION OF CD38 EXPRESSION IN BRAIN CELLS WITH RETINOIC ACID
A.B. Salmina, N.A. Malinovskaya, O.S. Okuneva, L.D. Zykova, G.V. Yudin, D.I. Laletin, O.A. Frolova, M.A. Fursov, AA. Fursova
Department of Biochemistry, Medical, Pharmaceutical and Toxicological Chemistry, Research Institute of Molecular Medicine & amp- Pathobiochemistry, Krasnoyarsk state medical university named in honour of prof. V.F. Voino-
Yasenetskij
We have studied CD38 expression in rat brain after perinatal hypoxic-ischemic injury. We found regulation of CD38 by modulators of metabolism of endogenous retinoic acid or by exogenous retinoic acid. Possibility to use the data for development of pharmacological method of neuroprotection is discussed.
Key words: CD38, retinoic acid, expression
Литература
1. Пальчик А. Б. и Шабалов Н. П. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных. — М.: «МЕДпресс-информ», 2GG6. — 25б с.
2. Салмина А. Б., Окунева О. С., Малиновская Н. А. и др. НАД±зависимые механизмы нарушения жизнеспособности клеток головного мозга в остром периоде гипоксически-ишемического перинатального поражения // Нейрохимия. — 2GG8. — Т. 25, № 3. — С. 1−8.
3. Фрухт Э. Л. и Тонкова-Ямпольская Р. В. Некоторые особенности развития и поведения детей с перинатальным поражением нервной системы Росс. педиатрический журнал. — 2GG1. — № 1. — С. 9−12.
4. Bruzzone S., Franco L., Guida L. et al. A self-restricted CD38-connexin 43 cross-talk affects NAD+ and cyclic ADP-ribose metabolism and regulates intracellular calcium in 3T3 fibroblasts // J. Biol. Chem. — 2GG1. — Vol. 27б. — P. 483GG-483G8.
5. Cebere A., and Liljequist S. Ethanol differentially inhibits homoquinolinic acid- and NMDA-induced neurotoxocity in primary cultures of cerebellar granule cells // Neurochemical Research. — 2GG3. — Vol. 28, N 8. — P. 1193−1199.
6. Ceni C., Pochon N., Villaz M. et al. The CD38-independent ADP-ribosyl cyclase from mouse brain synaptosomes: a comparative study of neonate and adult brain // Biochem. J. 2GG6. — Vol. 395. — P. 417−42б.
7. Duester G. Alcohol dehydrogenase as a critical mediator of retinoic acid synthesis from vitamin A in the mouse embryo // J. Nutr. — 1998. — Vol. 128. — P. 459−4б2.
8. Gonzalez A., Pariente J.A., Salido G.M. Ethanol stimulates ROS generation by mitochondria through Ca2+ mobilization and increases GFAP content in rat hippocampal astrocytes // Brain Research. — 2007. — Vol. 1178. — P. 28−37.
9. Higashida H., Salmina A., Olovyannikova R. Ya., Noda M. Cyclic ADP-ribose as a universal calcium signal molecule in the nervous system // Neurochem. Int. — 2007. — Vol. 51. — P. 192−199.
10. Kang B-N., Tirumurugaan K.G., Deshpande D.A. et al. Transcriptional regulation of CD38 expression by tumor necrosis factor-alfa in human airway smooth muscle cells: role of NF-kB and sensitivity to corticosteroids // FASEB J.
— 2006. — Vol. 20. — P. 1000−1002.
11. Kishimoto H., Hoshino S., Ohori M. et al. Molecular mechanism of human CD38 gene expression by retinoic acid // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273, N 25.
— P. 15 429−15 434.
12. Kornyei Z., Gocza E., Ruhl R. et al. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis // FASEB J. — 2007. — Vol. 21. — P. 24 962 509.
13. Lane M.A., and Bailey S.J. Role of retinoid signaling in the adult brain // Progress in Neurobiology. — 2005. — Vol. 75. — P. 275−293.
14. Molotkov A., and Duester G. Genetic evidence that retinaldehyde dehydrogenase Raldh1 (Aldha1) functions downstream of alcohol dehydrogenase Adh11 in metabolism of retinol to retinoic acid // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N 38. — P. 36 085−36 090.
15. Rice J., Vannucci R., Brierley J. The influence of immaturity on hypoxia-ischemic brain damage in the rat // Ann. Neurol. — 1981. — № 9. — P. 131−141.
16. Salmina A.B., Olovyannikova R. Ya., Noda M., Higashida H. NAD+ metabolism and ADP-ribosyl cyclase as targets for central nervous system therapy // Current Medicinal Chemistry. — 2006. — Vol. 6. — P. 193−210.
17. Vannucci S.J. and Hagberg H. Hypoxia-ischemia in the immature brain // J. Experimental Biology. — 2004. — Vol. 207. — P. 3149−3154.
18. Wagner E., Luo T., and Drager U.C. Retinoic acid synthesis in the postnatal mouse brain marks distinct developmental stages and functional systems // Cerebral Cortex. — 2002. — Vol. 12, N 12. — P. 1244−1253.
19. Wang Q., Sun A.Y., Simonyi A. et al. Ethanol preconditioning protects against ischemia/reperfusion-induced brain damage: Role of NADPH oxidase-derived ROS // Free Radic. Biol. Med. — 2007. — Vol. 43. — P. 1048−1060.
20. Wang T-W., Zhang H., Parent J.M. Retinoic acid regulates postnatal neurogenesis in the murine subventricular zone-olfactory bulb pathway // Development. — 2005. — Vol. 132. — P. 2721−2732.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой