Иммунокомпетентные клетки в эндометрии пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В. И. Кулаков, Н. И. Волков,
Ж. В. Беспалова
Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва
¦ В статье сообщается о результатах иммуногистохимического исследования эндометрия пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом. Проведен анализ динамики распределения иммунокомпетентных клеток в эндометрии пациенток с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом в сравнении с пациентками, страдающими бесплодием трубно-перитонеального генеза.
Ключевые слова: эндометриоз, бесплодие, динамика СВЗ-СБ4-С08-лимфодитов на протяжении менструального цикла, эндометрий
ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ В ЭНДОМЕТРИИ ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ И НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
Введение
В литературе неоднократно предпринимались попытки объяснить механизмы бесплодия при наружном генитальном эндомет-риозе [2,5,6,9]. Результаты этих исследований позволяют предполагать, что иммунная система может играть существенную роль в патогенезе бесплодия при этом заболевании [5,6]. Однако вплоть до настоящего времени роль иммунной системы в патогенезе бесплодия, связанного с эндометриозом, изучена не до конца.
Как показали исследования последних лет, эндометрий играет фундаментальную роль в процессах имплантации [ 1 ]. Для успешной имплантации необходимо наличие эндометрия, готового принять функционально полноценный эмбрион на стадии бластоцисты и нормальное взаимодействие антигенов материнской и эмбриональной ткани. Регуляция взаимодействия между клетками эндометрия и трофобласта осуществляется с участием интерлейкина-1, интерлейкина-8, лептина и других звеньев иммунной системы [11].
По мнению ряда авторов, изменение состава и количества иммунокомпетентных клеток может приводить к нарушению процессов имплантации эмбриона в эндометрий [1,7]. Однако имеющиеся данные неоднозначны, что делает актуальным проведение исследования состояния иммунокомпетентных клеток эндометрия на протяжении менструального цикла у женщин с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом.
Материал и методы исследования
В исследование включено 300 пациенток с регулярным 28-дневным овуляторным менструальным циклом, страдающих бесплодием. Всем была выполнена лапароскопия и биопсия эндометрия. В соответствии с задачами исследования, все пациентки были разделены на 2 группы.
Основную группу составили 150 пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом 1−1У степени распространения (согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности, г-АИЗ, 1996) [13] при проходимых маточных трубах.
Во II группу (контрольную) вошли 150 пациенток, страдающих бесплодием, обусловленным спаечным процессом в малом тазу (при непроходимых маточных трубах).
Средний возраст пациенток 31,1 ±3,2 лет (при колебаниях от 18 до 42 лет). Продолжительность периода бесплодия 4,6+1,9 лет (при колебаниях от 1 до 15 лет).
Таблица
Используемые моноклональные антитела
Название Предназначено (CD) Специфичность в отношении антигенов Распределение маркированных антигенов Разведение
Anti-Leu4 CD3 Молекулярный вес (МВ) 22−28 кД. Поверхностные антигены Т-лимфоциты. Пан-Т-маркер 1: 200
Anti-Leu3a CD4 МВ 55 кД. Поверхностные антигены Т4-хелперы/индукторы (моноциты, макрофаги) 1: 400
Anti-Leu2a CD8 МВ 32 кД. МВ 43 кД. Поверхностные антигены Т8-цитотоксические/супрес-сорные лимфоциты 1: 400
Anti-Leu7 (HNK-1) — МВ 110 кД Натуральные киллеры (НК) — Подгруппа Т-лимфоцитов 1: 50
Anti-Human B-cell Клон To 15 CD22 МВ 130 кД В-лимфоциты. Пан-В-маркер 1: 100
Лапароскопия и биопсия эндометрия была проведена с 5 по 28 день менструального цикла. В каждый из дней указанного периода оперировано 5−7 пациенток. Полученные образцы ткани эндометрия сохраняли при температуре -800°С до микроскопического исследования.
Соответствие каждого образца эндометрия определенному дню менструального цикла устанавливали с помощью вычисления относительно даты первого дня последней менструации и гистологического исследования биоптатов эндометрия по методу Dallenbach-Hellwer (1981) [2].
Для проведения иммунохимического исследования были приготовлены микропрепараты образцов эндометрия. Идентификация CD3-, CD4-и СБ8-позитивных лимфоцитов, натуральных киллеров и В-лимфоцитов была проведена с использованием панели из 5 моноклональных антител: Anti-Leu4, Anti-Leu3a, Anti-Leu2a, Anti-Leu7, Anti-Human-B-cell (таблица). Эти антитела, специфически связываясь с лимфоидными клетками, окрашивают их в коричневый цвет, что позволяет отличить их при световой микроскопии.
Анализ и оценка препаратов осуществлялись с помощью световой микроскопии. В каждом срезе проводили подсчет абсолютного числа клеток, меченных соответствующими антителами.
Статистический анализ результатов проводился с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Динамика распределения иммунокомпетен-тных клеток в эндометрии в течение менструального цикла.
1. Распределение Т-лимфоцитов
1.1. СБЗ-позитивные Т-лимфоциты
СОЗ-антиген содержится на мембранах Т-лим-фоцитов и позволяет определить их количество
среди всех лимфоцитов. У пациенток с эндо-метриозом начальный уровень СОЗ-позитивных Т-клеток составлял 240 в 1 мм² на 5-й день цикла, достигал 290 в 1 мм² к 7 дню цикла (р& gt-0,05) и снижался до 180 в 1 мм² к 12 дню цикла, далее варьируясь в пределах 100−150 клеток в 1 мм² до конца цикла.
В контрольной группе число СОЗ-позитивных Т-лимфоцитов в ранней пролиферативной фазе колебалось с 420 клеток в 1 мм² на 5-й день менструального цикла до 570 в 1 мм² на 6-й день (р& gt-0,05). После 6 дня цикла их количество снижалось до 180 в 1 мм² к 12 дню. Далее число СОЗ-позитивных Т-лимфоцитов варьировалось в пределах 100−150 клеток в 1 мм².
Сравнение динамики изменения уровня СОЗ-по-зитивных Т-лимфоцитов у женщин с эндо-метриозом и в контрольной группе не выявило существенных различий на протяжении менструального цикла (р& gt-0,05).
1.2. Т-лимфоциты хелперы/индукторы (СО 4)
Т-лимфоциты хелперы/индукторы (С04-по-зитивные Т-лимфоциты), участвуют в начальном этапе иммунного ответа. Они распознают чужеродные антигены и передают информацию о них В-лимфоцитам, которые, в свою очередь, вырабатывают специфические антитела.
У пациенток с эндометриозом число С04-по-зитивных Т-лимфоцитов было максимальным между 5 и 6 днем менструального цикла и составляло 110−120 в 1 мм². Далее к 13-му дню менструального цикла их количество стремительно снижалось до 30 клеток в 1 мм². После незначительного повышения на 16-й день, происходило медленное снижение до 20 клеток в 1 мм², вплоть до конца менструального цикла.
В контрольной группе на протяжении всего менструального цикла динамика изменения уровня С04-позитивных лимфоцитов соответ-
ствовала изменениям в группе больных эндо-метриозом (р& gt-0,05).
1.3. Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CD8)
Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты (CDS-позитивные лимфоциты) играют противоположную Т-хелперам функцию в гуморальном иммунитете (угнетают систему гуморального иммунитета). Они принимают участие в формировании естественной или индуцированной антигеном иммунологической толерантности. Важная роль принадлежит этим клеткам в процессах угнетения естественного иммунного ответа на нидацию оплодотворенной яйцеклетки, которая на начальном этапе воспринимается иммунной системой как чужеродный антигенный объект. При нарушении функции Т-супрессорного звена иммунитета в подавляющем большинстве случаев происходит отторжение эмбриона на самых ранних этапах имплантации.
Максимальный уровень CDS-позитивных Т-лимфоцитов у пациенток с эндометриозом был на 5−8-й день менструального цикла и составлял 125 клеток в 1 мм². Начиная с 9-го дня их число быстро снижалось, достигая уровня 48 клеток в 1 мм² к 14-му дню менструального цикла. После 14-го дня их количество было относительно постоянным вплоть до конца менструального цикла (р& gt-0,05).
В контрольной группе изменение количества CDS-позитивных лимфоцитов в 1 мм² соответствовало характеру изменений в группе больных эндометриозом. Различия были статистически недостоверны (р& gt-0,05).
1.4. Натуральные киллеры (Leu7)
Натуральные киллеры (Ьеи7-позитивные
клетки) — большие гранулярные клетки, содержащие белок перфорин, который, проникая в цитоплазму клетки-мишени, вызывает осмотический взрыв и лизис. Натуральные киллеры осуществляют важную функцию иммунной системы — сохранение генетического гомеостаза организма путем киллинга клеток, несущих генетическую неоднородность.
У пациенток с эндометриозом число Leu7-no-зитивных клеток было постоянным на протяжении всего менструального цикла (около 4 в 1 мм2).
В контрольной группе Ьеи7-позитивные клетки на протяжении всего менструального цикла встречались редко, были слабо окрашены и не имели четкой локализации. Эти клетки располагались в строме эндометрия и среди скоплений лимфоцитов, а в некоторых препаратах отсутствовали. Максимальное число этих клеток (20 в 1 мм2) зафиксировано на 5-й день менструального цикла. На 8-й день их количество сни-
жалось до 3−4 в 1 мм², оставаясь стабильным на протяжении всех последующих дней менструального цикла.
Статистически достоверных отличий от контрольной группы не выявлено (р& gt-0,05).
2. Распределение В-лимфоцитов (С022)
В-лимфоциты отвечают на антигенное раздражение синтезом антител, связывающих эти антигены. Конечной фазой этой реакции является уничтожение чужеродных антигенов.
Этот класс лимфоцитов был обнаружен в скоплениях лимфоцитов. Подобная микроскопическая картина наблюдалась в обеих группах обследованных.
В эндометрии пациенток, страдающих эндометриозом, максимальный уровень С022-пози-тивных клеток зарегистрирован на 5−8-й день менструального цикла (40 клеток в 1 мм2). К концу пролиферативной фазы, на 11-й день менструального цикла, количество этих клеток снижалось до 20 в 1 мм², впоследствии их число колебалось от 10 до 25 клеток в 1 мм² с пиковым значением на 13-й день менструального цикла.
Количественная динамика С022-позитивных В-лимфоцитов у пациенток со спаечным процессом в малом тазу: на 6−8-й день менструального цикла достигался максимум со средним числом 50 клеток в мм2. После 9-го дня менструального цикла их число стремительно снижалось и между 11 и 23 днями составляло 12 СЭ22-позитивных клеток в 1 мм². Между 23 и 26 днями их число возрастало до 30 в 1 мм², затем снова снижалось к концу менструального цикла.
В обеих обследованных группах пациенток существенных различий не отмечалось (р& gt-0,05).
3. Распределение макрофагов
Макрофаги выполняют функцию разрушения
и переваривания поврежденных, дефектных, состарившихся клеток организма, а также чужеродных клеточных агентов.
Встречаемость и распределение макрофагов в эндометрии на протяжении менструального цикла были одинаковыми у пациенток обеих групп. Количественные изменения клеток были незначительны (р& gt-0,05).
В начале менструального цикла среднее число макрофагов варьировалось в пределах 150−200 клеток в 1 мм², затем к 11-му дню менструального цикла медленно снижалось до 100+10 клеток. С 11-го по 21-й день количество макрофагов оставалось стабильным, а начиная с 22-го дня менструального цикла, их число возрастало, достигая уровня фазы ранней пролиферации.
4. Агрегации лимфоцитов
Агрегации лимфоцитов встречались на протяжении всего менструального цикла в эндомет-
рии пациенток обеих групп. В группе пациенток с эндометриозом агрегация лимфоцитов наблюдалась в фолликулярную фазу в 27% образцов и в 6% образцов в лютеиновую фазу. В контрольной группе агрегация лимфоцитов наблюдалась в 22% образцов в фолликулярную фазу цикла и в 10% образцов в лютеиновую фазу цикла. Не было различий структуры скоплений лимфоцитов у пациенток обеих обследованных групп. Скопления лимфоцитов состояли из сотен клеток, расположенных в основном в функциональном слое. Небольшие группы лимфоцитов присутствовали вокруг желез.
Центральные поля крупных скоплений состояли преимущественно из В-лимфоцитов. Т-лим-фоциты локализовались в основном в краевых зонах этих полей.
Макрофаги были представлены по краям, и лишь изредка — внутри скоплений лимфоцитов.
Обсуждение
1. Т-лимфоциты. Различные подгруппы Т-лим-фоцитов обнаруживались как в виде отдельных клеток, так и в виде интра- и субэпителиальных клеточных агрегатов в эндометрии в течение всего менструального цикла. Количество и распределение этих клеток в течение менструального цикла не различаются у пациенток с эндометриозом и пациенток контрольной группы.
Наибольшее количество клеток было обнаружено с помощью маркера апИ-Ьеи 4 (СОЗ). Установлено, что динамика распределения клеток различных подгрупп схожа и имеет 2 максимума: в раннюю пролиферативную фазу и в конце секреторной фазы, без выраженных изменений в промежутке. Среднее количество различных Т-лим-фоцитов имело колебания, не превышающее ±10 клеток в 1 мм² во вторую фазу цикла. При этом высокая концентрация Т-лимфоцитов в начале менструального цикла может быть объяснена анатомическими особенностями: толщина функционального слоя эндометрия в эту фазу составляет от 0,5 до 4 мм. Следовательно, в начале пролиферативной фазы менструального цикла биопсия может быть взята из более глубоких слоев эндометрия с наибольшей плотностью клеток.
Соотношение СБ4: С08 — «индекс иммунорегуляции» — является показателем гармоничного функционирования иммунной системы и в норме составляет 1:2. В раннюю пролиферативную фазу соотношение СЭ4: С08 составило 1:1. В дальнейшем количество С04-позитив-ных клеток снижалось, в то время как уровень С08-позитивных клеток оставался относительно стабильным. К концу менструального цик-
ла мы наблюдали преобладание CDS-позитивных Т-лимфоцитов, при этом соотношение CD4: CD8 колебалось от 1:2 до 1:4. Подобная картина наблюдалась в эндометрии больных обеих групп.
Полученные данные совпадают с результатами проведенных ранее исследований [5, 14]. Преобладание СБ8-позитивных Т-лимфоцитов в тканях, чувствительных к эстрогенам, может быть объяснено тем, что эти клетки имеют рецепторы эстрогенов, тогда как у С04-позитивных лимфоцитов эти рецепторы отсутствуют [12].
2. Натуральные киллеры в небольшом количестве присутствовали в эндометрии в течение всего менструального цикла. Мы не обнаружили разницы в количестве и распределении этих клеток у женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой. Lydyard и Grossi в работе по изучению иммунологических возможностей натуральных киллеров доказали присутствие небольшого количества этих клеток в эндометрии. Кроме того, их количество подвергалось циклическим изменениям [8]. Аналогичные результаты относительно эндометрия здоровых женщин были описаны Kamat и Isaacson (1987), King et al. (1988) [5, 6].
3. В-лимфоциты. В эндометрии обследованных пациенток найдено небольшое количество В-лимфоцитов. В некоторых скоплениях лимфоцитов обнаружены поля, состоящие исключительно из В-лимфоцитов. Эти находки совпадают с результатами исследований эндометрия здоровых женщин [5, 10].
4. Макрофаги. Макрофаги присутствовали в эндометрии женщин с эндометриозом и в контрольной группе в сходных количествах на протяжении всего менструального цикла. Средний уровень макрофагов был высоким в начале и в конце менструального цикла, а в середине цикла имел тенденцию к снижению. Макрофаги были равномерно распределены в строме эндометрия, и лишь изредка встречались интра- и субэпител иально. Однако роль макрофагов эндометрия при эндометриозе и связанном с ним бесплодии остается не ясной. В настоящее время некоторые исследователи сообщают о повышении уровня и активности макрофагов в перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом [3, 4, 9, 15]. Другие авторы указывают на повышение количества макрофагов в секреторную фазу [8].
5. Скопления лимфоцитов. В эндометрии пациенток обеих групп обнаруживались скопления лимфоцитов на протяжении всего менструального цикла. Выявлена циклическая зависимость в распределении этих скоплений.
В контрольной группе они были обнаружены в 22% образцов материала в пролиферативную фазу и в 10% образцов в секреторную фазу. В группе пациенток с эндометриозом скопления лимфоцитов обнаруживались в 27 и 6% образцов материала соответственно. Скопления лимфоцитов располагались главным образом в нижней части функционального и базальном слое эндометрия и состояли из В-лимфоцитов в центральной зоне и Т-лимфоцитов по периферии скоплений. Подобные данные относительно распределения и состава скоплений лимфоцитов имеются в литературе, однако эти исследования базируются на малом числе наблюдений, и в них отсутствует подбор пациенток по возрасту [5, 10, 14].
Заключение
Анализируя данные, полученные при изучении динамики распределения иммунокомпетент-ных клеток в эндометрии пациенток с эндометриозом и со спаечным процессом в малом тазу на протяжении менструального цикла, можно сделать следующие выводы:
1. Количество и распределение Т- и В-лим-фоцитов, макрофагов, скоплений лимфоцитов подвержены циклическим изменениям, что, по нашему мнению, может свидетельствовать о тесной взаимосвязи функции яичников и локальной функции иммунокомпетентных клеток, и подтверждает характеристику эндометрия как слизисто-лимфатической ткани.
2. Отсутствие различий в количественных и качественных показателях динамики распределения. иммунокомпетентных клеток эндометрия (различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, макрофагов) в зависимости от фаз менструального цикла у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе в сравнении с контрольной группой (бесплодие при непроходимых маточных трубах вследствие спаечного процесса развившегося после перенесенных
воспалительных заболеваний органов малого таза) свидетельствует о сохранении нормальной функции эндометрия у пациенток с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе.
Литература
1. Carver Н., Martin К., Sryropoulou Barlow D., Sargen I., Mardon H. An in-vitro model for stromal invasion during implantation of the human blastocyst // Human Reproduction. — Vol. 18, N 2. — 2003. ~ P. 283−290.
2. Dallenbach-Hellweg G. Histopatologie des endometriums. -Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 1981.
3. Haney A.F., Handwerger S., Weiberg G.B. Peritoneal fluid prolactin in infertile women with endometriosis: lack of evidence of secretory activity by endometric implants //
Fertil. Steril. — 1984. — Vol. 42. — P. 932−938.
4. Haltne J., Hammond M.G., Hulka J.F. et al. Retrograde menstruation in healthy women and patients with endometriosis // Obstetr. Gynecol. — 1984. — 64: 151−154.
5. Kamat B.R., Isaacson P.G. The immunohistochemical distribution of leukocytic subpopulations in human endometrium // Am. J. Pathol. — 1987. — Vol. 127. — P. 66−73.
6. King A., Wellings V., Gardner L., Loke Y. W. Immunocytochemical characterization of the unusual large granular lymphocytes in human endometrium throughout the menstrual cycle // Hum. Immunol. — 1988. — Vol. 24. -
P. 195−205.
7. Klentzeris L.D. Роль эндометрия в имплантации (обзор литературы). // Проблемы репродукции. — N 2. — 1999.
8. Lygyard P., Grossi С. Cells involved in the immune response. In: Immunology. — Edinburgh, London, Melbourne, 1989. -P. 2. 2−2. 17.
9. Mettler L. Immunphanotyp von Endometrium und Endometriose // Endometriose. — 1989. — N 3. — P. 64−69.
10. Morris H., Edwards J., Tillman A., Emms M. Endometrial lymphoid tissue: an immunhystological study // J. Clin.
Pathol. — 1985. — Vol. 38. — P. 644−652.
11. Pellicer A., Dominguez F., Simon C. Endometrial factors of implantation failure. In: Joint SIG Embryology and SIG Reproductive Genetics course. ESHRE 2003. — Madrid,
2003. — P. 30−32.
12. Press M.F., Mousec-Goebel N.A., Bur М., Green G.L. Estrogen receptor localization in female genital tract // Am.
J. Pathol. — 1989. — Vol. 123. — P. 280−292.
13. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. // Fertil. Steril. -1997. — Vol. 67, N 5. — P. 817−821.
14. Tabibzadeh S.S. Proliferative activity of lymphoid cells in human endometrium throughout of menstrual cycle //
J. Clin. Endocrin. Metab. — 1990. — Vol. 70. — P. 437−443.
15. Weinberg J.B., Haney A.F., Ramakrishnan S. Peritoneal fluid and plasma level of human macrophage colony -stimulation factor in relation to peritoneal fluid macrophage content // Blood. — 1991. — 78. — P. 513−516.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой