Наличие гена Rf1 в сортах крупноплодного подсолнечника коллекции ВИР

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 575. 13/. 162
НАЛИЧИЕ ГЕНА Rf1 В СОРТАХ КРУПНОПЛОДНОГО ПОДСОЛНЕЧНИКА КОЛЛЕКЦИИ ВИР
Пепеляева Е. А. 1, Анисимова И. Н. 2, Гаврилова В. А. 2, Рожкова В. Т. 3, Новоселова Л. В. 1
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», Пермь, Россия (614 990, г. Пермь, ул. Букирева, 15)
2ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова» ((9900, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42)
3ГНУ «Кубанская опытная станция ВИР им. Н.И. Вавилова», 355 193, п. Ботаника, Гулькевический район,
Краснодарский край_
Проведен анализ 34 образцов крупноплодного подсолнечника коллекции ВИР на наличие в них маркера гена Rf1 для создания родительских форм гибрида кондитерского направления. В результате исследования подтверждено наличие SCAR-маркера Y10 среди сортов крупноплодного подсолнечника. Исследованные образцы были условно распределены в 4 группы: 1 группа — с содержанием маркера гена Rf1 у более 50% исследованных растений- 2 группа — наличие маркера у 20−50% растений, 3 группа -наличие маркера у 10−20% растений и 4 группа, у растений которой маркер не был обнаружен. Во вторую группу образцов отнесены такие сорта, как СПК, Лакомка, Бородинский, Донской крупноплодный. В первую группу отнесены 9 образцов, причем у трех образцов количество растений с наличием маркера составляет более 90%.
Ключевые слова: подсолнечник, селекция, крупноплодность, восстановление фертильности, молекулярный маркер.
PRESENCE OF THE Rf1 GENE IN CONFECTIONERY SUNFLOWER VARIETIES OF THE VIR COLLECTION
Pepelyaeva E.A. 1, Anisimova I.N. 2, Gavrilova V.A. 2, Rozhkova V.T. 3, Novoselova L.V. 1
9The Perm State National Research University, Perm, Russia (614 990, Perm, Bukirev St., 15) 2N.I. Vavilov Research Institute of Plant Industry (19 000, St. Petersburg, B. Morskaya St., 42)
5 352 133 Kuban Experiment Station of VIR, Krasnodar territory, Gulkevich area, v. Botanica_
With the purpose of creation of parental forms for a confectionary hybrid variety the thirty three large-seed sunflower accessions of the VIR collection were analyzed for the presence of the Rf1 gene marker. As a result of research the presence of the SCAR-marker Y10 among the studied confectionery sunflower varieties is confirmed. The examined accessions were conventionally divided into 4 groups. In the first group the marker was present in more than 50% of the studied of plants. In the second the marker was found in 20−50% of the plants. In the third group the marker was observed in 10−20% of the plants, and in the fourth group all the plants were without marker. The second group includes accessions SPK, Lakomka, Borodinskiy, Donskoy krupnoplodnyi. The first group included 9 accessions and the three of them the of plants with the marker constituted more than 90%.
Keywords: sunflower, breeding, confectionery, fertility restoration, molecular marker. Введение
Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) широко распространена среди высших растений. Это явление заключается в неспособности растения продуцировать жизнеспособную пыльцу, тогда как женская генеративная сфера остается в норме. Различные системы ЦМС — Rf имеют принципиальное значение при производстве гибридных семян различных культур (подсолнечника, риса, сахарной свеклы, рапса и других), так как они обеспечивают проведение контролируемого опыления материнских стерильных линий пыльцой отцовских форм без трудоемкой ручной кастрации [7].
Мужская фертильность может быть восстановлена ядерными генами восстановления фертильности пыльцы Rf-генами (Restoration of fertility). К настоящему времени у подсолнечника (Helianthus annuus) описаны более 70 источников ЦМС, каждый из которых требует присутствия в геноме определенных генов восстановления фертильности. Однако все современные промышленные гибриды подсолнечника созданы на основе одного источника ЦМС РЕТ1, полученного Леклерком из межвидового гибрида H. petiolaris х H. annuus. Митохондральная ДНК форм с цитоплазматической мужской стерильностью (мтДНК РЕТ1) отличается от мтДНК фертильных форм наличием инверсии 11 т.н. и инсерции 5 т.н., приводящих к появлению новой открытой рамки считывания orfH522, ко-транскрибируемой вместе с геном atpA и кодирующей белок 16 кДа. Мужской фертильный фенотип может быть восстановлен путем введения в генотип гибрида доминантного ядерного гена Rf, который вызывает снижение уровня ко-транскрипта atpA-orfH522 в пыльниках в течение мейоза и дальнейшее снижение количества белка ORFH522. По различным данным, для восстановления фертильности пыльцы форм подсолнечника с ЦМС PET1 необходимо от одного до четырех генов. Показано, что один из генов, необходимых для восстановления фертильности форм с ЦМС РЕТ1, присутствует в генотипе большинства линий ЦМС и линий-закрепителей стерильности, а другой — Rf1 — должен быть введен из линии-восстановителя [5- 6].
О наличии генов Rf в генотипе можно судить по присутствию молекулярных маркеров, тесно сцепленных с ними. Было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [5], может использоваться для поиска носителей гена Rf1 [4].
Производство гибридных семян, проявляющих эффект гетерозиса в первом поколении, — основная методика повышения урожайности, валового сбора семян с высокими технологическими качествами. Для их промышленного производства используют материнские линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) [2].
Большинство созданных на основе системы ЦМС-Rf гибридов подсолнечника имеют масличное направление, тогда как кондитерскому направлению уделялось недостаточное внимание. В настоящее время существует необходимость в создании гибридов кондитерского направления отечественной селекции, так как возрастает спрос на производство кондитерского сырья.
В коллекции генетических ресурсов подсолнечника ВИР, насчитывающей 2230 образцов культурного и 630 образцов дикорастущих видов, имеется 85 линий-восстановителей фертильности пыльцы масличного направления, однако они не могут быть
использованы при создании крупноплодного гибрида, так как не соответствуют необходимым критериям (недостаточный размер семянки, высокая масличность) [2].
На данный момент крупноплодные отцовские линии-восстановители пыльцы в коллекции отсутствуют. Цель данного исследования заключалась в исследовании сортов крупноплодного подсолнечника для поиска в них генов Rf1 при помощи SCAR-маркеров с дальнейшим созданием из них отцовских линий.
Материал и методы
Материалом исследования служили 34 образца крупноплодного подсолнечника из коллекции ВИР, включающие 30 сортов отечественной и зарубежной селекции, одну линию (ВИР479), сорт Хейлудзянский, который был разделен на 3 фенотипически различные группы, и сорт Местный-9, который также был разделен на 2 формы — ветвистую и неветвистую. Весь материал репродуцирован в условиях Кубанской опытной станции ВИР. Геномную ДНК выделяли из этиолированных проростков с использованием модифицированного СТАБ-метода [1- 3]. В экстракционный буфер вводили поливинилпирролидон (PVP) 40 000 и метабисульфит натрия- для удаления РНК полученные фракции ДНК инкубировали в течение 1 ч при 37 °C в присутствии РНКазы А. Для амплификации маркерного фрагмента HRG02 использовали праймер Y10 (прямой 5'--AAA CGT GGG AGA GAG GTG G-3'-, обратный 5-AAA CGT GGG CTG AAG AAC TA-3). ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 94 °C (45 сек), отжиг праймеров при 65 °C в течение 45 сек, элонгация при 72 °C (60 сек), количество циклов 35. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 50 нг геномной ДНК, однократный реакционный буфер 10x (1,5 мМ MgCl2), по 0,4 мкМ каждого из праймеров, по 0,2 мМ каждого dNTP и 0,2 ед. Taq-полимеразы. Электрофорез проводился в 1,8%-ном агарозном геле. В опытах проанализировали в среднем по 8 растений из каждого образца.
Результаты и обсуждение
На ДНК изученных генотипов праймеры Y10 инициировали синтез фрагмента HRG02 ожидаемого размера (740 п.н.) либо не давали продуктов амплификации. В основном сорта подсолнечника демонстрировали гетерогенность по наличию-отсутствию маркерных последовательностей HRG02, что можно объяснить неоднородностью геномов сортов по сравнению с инцухт-линиями, которые представляют собой не одно поколение инбридинга.
В результате исследованные образцы крупноплодного подсолнечника были условно размещены в 4 группы в зависимости от количества растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10 (таблица 1). Первая группа включает образцы с наличием маркера Y10 у более половины исследованных растений, вторая группа — наличие маркера у 20−50% растений, третья — у 10−20%, у четвертой группы маркер Y10 отсутствовал.
Таблица 1. Результаты скрининга образцов коллекции с использованием БСЛЯ-маркера локуса Я/1
№ образца
Название образца
Кол-во выделенных проб (растений)
Присутствие маркера У10
Отсутствие маркера У10
Наличие маркера У10, %*
Группа 1: наличие маркера У10 у & gt-50% растений
к-2664, Приморский край
б/к, Северная Дакота, США и-610 067,с. 3 002, Китай к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый)
к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый) к-2801, Приморский край к-3578, с. Местный-2, Украина и-610 064, Хейлудзянский-1, Китай (ветвистый) к-2676, Украина
12
11 11
6
9
10
6
11
10 10
92
91 91
83 78
70
67
Группа 2: наличие ма ркера У10 у 20−50% растений
10 к-3510, Донской крупноплодный, Ростовская область 10 5 5 50
11 к-3581, Местный-5, Украина 10 5 5 50
12 к-2436, Кемеровская область 10 5 5 50
13 к-3573,с. Бородинский, Краснодар 2 1 1 50
14 к-2006, Приморский край 10 5 5 50
15 к-3426,с. СПК, Краснодар 10 5 5 50
16 и-610 064, Хейлудзянский-1, Китай (неветвистый) 2 1 1 50
17 к-3526, с. Лакомка, Краснодар 12 4 8 33
18 к-1720, Киргизия 7 2 5 29
19 к-1898, Краснодарский край 9 2 7 22
20 УБ-100 049 с. Мтдгеп, США 10 2 8 20
21 б/к, ВИР479 10 2 8 20
Группа 3: наличие ма ркера У10 у 10−20% растений
22 к-3150, Азербайджан 7 1 6 14
23 к-2642, с. Стадион, Болгария 8 1 7 13
24 к-2628, США 10 1 9 10
25 б/к с. Крупноплодный-2, Белгородская область 10 1 9 10
Группа 4: отсутствие маркера У10 у растений
26
27
28
29
30
31
32
33
34
к-1964, с. Кубанский,
Краснодарский край
к-3147, Азербайджан
и-610 064, Хейлудзянский-1, Китай
(неветвистый)
к-1589, Армения
к-2044, Франция
к-474, Армянская ССР
к-3516, Запорожский кондитерский
к-1833, Молдавия
к-2835, Приморский край
5 0
8 0
5 0
5 0
10 0
1 0
2 0
10 0
10 0
5 0
7 0
5 0
5 0
10 0
1 0
2 0
10 0
10 0
1
1
4
9
8
1
5
8
7
0
Примечание: * - количество растений, в геноме которых был обнаружен маркер У10, выраженное в процентном соотношении от общего числа проанализированных растений данного сорта.
Из полученных данных можно сделать вывод о наличии у большинства исследованных сортов в геноме гена Rf1, так как лишь у 8 из 34 образцов маркер Y10 отсутствовал полностью. У 9 сортов: и-610 064, Хейлудзянский-1, Китай- к-2676, Украина- и-610 067, с. 3 002, Китай- к-2801, Приморский край- б/к, Северная Дакота, США- к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый) — к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый) — к-3578, с. Местный-2, Украина- к-2664, Приморский край наличие маркера Y10 выявлено более чем у 60% проанализированных растений каждого образца. Причем необходимо отметить, что среди выявленных образцов присутствуют сорта как отечественной, так и зарубежной селекции.
Среди изученных образцов, в настоящий момент районированы кондитерские сорта подсолнечника — СПК, Лакомка, Донской крупноплодный, Бородинский. В сортах СПК, Донской крупноплодный и Бородинский в геноме половины исследованных растений каждого образца обнаружен маркер гена Rf1, в сорте Лакомка маркер Y10 присутствовал у 4 из 12 растений, это особенно важно, так как эти образцы имеют особенно ценные качества. Из данных сортов возможно создание отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы и в будущем гибрида кондитерского направления.
Для подтверждения достоверности данных молекулярно-генетического анализа необходимо провести гибридологический анализ в полевых условиях, причем образцы, показавшие полное отсутствие маркера Y10, в анализ не будут включены, что значительно сократит объем проводимых исследований. Также необходимо увеличить количество индивидуальных скрещиваний у сортов с незначительным процентным содержанием маркера гена Rf1 для повышения вероятности обнаружения растения, несущего интересуемый ген.
Таким образом, имеется потенциальная возможность создать отцовские линии-восстановители фертильности пыльцы кондитерского направления из образцов крупноплодного подсолнечника генетической коллекции ВИР им. Вавилова.
Работа частично поддержана РФФИ (проект № 12−04−329).
Список литературы
1. Анисимова И. Н., Алпатьева Н. В., Тимофеева Г. И. Скрининг генетических ресурсов растений с использованием ДНК-маркеров: основные принципы, выделение ДНК, постановка ПЦР, электрофорез в агарозном геле // Методические указания ВИР / под ред. Е. У. Радченко. — СПб.: ВИР, 2010. — 30 с.
2. Гаврилова В. А., Анисимова И. Н. Генетика культурных растений: подсолнечник. — СПб., 2003. — 197 с.
3. Малков И. А., Гаврилова В. А., Рожкова В. Т., Анисимова И. Н. Генетическое разнообразие линий-восстановителей фертильности пыльцы подсолнечника (Helianthus annuus, Asteraceae) // Карпология и репродуктивная биология высших растений: материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной памяти профессора А. П. Меликяна (18−19 октября 2011 г., Москва). — М.: ООО «Астра-Полиграфия»", 2011. — С. 300 305.
4. Маркин Н. В. SCAR-маркер гена Rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы растений с различными типами ЦМС / Н. В. Маркин, М. А. Тихонова, И. Н. Анисимова, В. Т. Рожкова, В. А. Гаврилова, А. В. Усатов // Масличные культуры. — 2009. -Вып. 2 (141). — С. 3−5.
5. Horn R., Kusterer B., Lazarescu E., Prufe M., Friedt W. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1-based F1 hybrids in sunflower (helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. 2003. — Vol. 106. — P. 599−606.
6. Kusterer B. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene / B. Kusterer, R. Horn, W. Friedt // Euphytica. — 2005. — Vol. 143. — P. 35−43.
7. Eckardt N.A. Cytoplasmic male sterility and fertility restoration // The Plant Cell. — 2006. — Vol. 18. — P. 515−517.
Рецензенты:
Демурин Я. Н., д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетики ГНУ «ВНИИМК Россельхозакадемии», г. Краснодар.
Колясникова Н. Л., д.б.н., доцент, зав. кафедрой ботаники и генетики, физиологии растений и биотехнологий, ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», г. Пермь.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой