In vivo и in vitro индуцируемые эффекты Галавита на хемилюминесцентную активность мононуклеаров крови онкологических и неонкологических больных

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы


44 БИОТЕРАПИЯ
УДК 616−092.4. 9:616−006−053:612. 11
A. F. Tsyb, M. A. Caplan, V. N. Petrov, L. I. Krykunova, V. N. Medvedev, I. A. Smirnova
THE GALAVIT-MEDIATED IN VIVO AND IN VITRO CHEMILUMINESCENT ACTIVITY OF BLOOD MONONUCLEAR CELLS IN CANCER AND NON-CANCER PATIENTS
Medical Radiological Research Center RAMS, Obninsk
ABSTRACT
The chemiluminescent (CL) activity of blood mononuclear (MN) cells induced by galavit (and spontaneous) was investigated in cancer and non-cancer patients. The luminol-depended CL-activity of MN was measured by using lumi-nometer LKB-Wallak 1251. The in vitro induced CL-activity of MN in patients with advanced tumors (T3-T4, Nj-N3) exceeded the same parameter in non-cancer patients and in patients at the early stage of disease. These findings indicate that MN in cancer patients blood are activated.
Key words: galavit, chemiluminescent activity, blood mononuclear cells.
А. Ф. Цыб, М. А. Каплан, В. H. Петров, Л. И. Крикунова, В. Н. Медведев, И. А. Смирнова
IN VIVO И IN VITRO ИНДУЦИРУЕМЫЕ ЭФФЕКТЫ ГАЛАВИТА НА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ И НЕОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
РЕЗЮМЕ
Исследована спонтанная и индуцированная Галавитом in vivo и in vitro хемилюминесцентная (ХЛ) активность мононуклеаров (МН) крови онкологических и неонкологических больных. Люминолзависимая ХЛ-актив-ность выделенных в градиенте плотности МН крови измерена на люминометре LKB-Wallac 1251. Выявлена зависимая от дозы Галавита стимуляция продуцирующей активные радикалы кислорода активности МН. In vitro индуцированная ХЛ-активность МН на высоте комплексного лечения у больных распространенными формами опухолей (T3-T4, N1-N3) превышала значения показателя у пациентов с ранними стадиями заболевания (Т1-Т2, N0) и значениями критерия неонкологических больных. Последнее свидетельствует об активированном (прими-рованном) статусе МН крови онкологических больных.
Ключевые слова: Галавит, хемилюминесцентная активность, мононуклеары крови.
ВВЕДЕНИЕ
Проведены сравнительные исследования спонтанной индуцированной (in vivo и in vitro) галавитом хе-милюминесцентной (ХЛ) активности мононуклеаров (МН) периферической крови 41 онкологического (с различной локализацией первичного очага) и 10 неонкологических больных. Люминолзависимая ХЛ-ак-тивность МН, выделенных на градиенте плотности Histopaque 1077/1119, измерена на люминометре LKB-Wallac 1251 после добавления опсонизированного зи-
мозана. Выявлена зависимая от дозы Галавита стимуляция продуцирующей активные радикалы кислорода активности МН крови. Спонтанная и индуцированная Галавитом ХЛ-активность МН онкологических больных существенно выше, чем у неонкологических больных. In vitro индуцируемая ХЛ-активность МН на высоте комплексного лечения у больных распространенными формами опухолей (T3-T4, N1-N3) была выше показателей с более ранними стадиями заболевания (Т1-Т2, N0). Предполагается, что МН онкологиче-
ских больных изначально сенсибилизированы (прими-рованы), поэтому их ответ in vitro на действие Гала-вита значительно больше.
Одной из ключевых функций макрофагов является их способность убивать микробы и опухолевые клетки. В обоих случаях, как теперь стало ясным, действуют общие механизмы, которые сводятся к усиленной генерации активных (токсических) форм кислорода в ходе так называемого респираторного взрыва — резкого усиления окислительных процессов в фагоцитах [4, 7, 8, 12]. В группу активных радикалов кислорода входят синглетный кислород, супероксидный анион-, гидроксильный и гидроперекисный радикалы, перекись водорода, гипохлорит [1, 15]. Накопление этих продуктов в зоне контакта эффекторных (макрофа-гальных) и опухолевых клеток является одной из основных причин гибели трансформированных клеток. В последнее время благодаря появлению хемилюми-несцентных зондов (лиминол и люцигенин) стало возможным количественное определение активных радикалов кислорода в биологических жидкостях и культуральных средах в хемилюминесцентном тесте, который на сегодня является одним из специфических и наиболее высокочувствительных методов оценки функциональной активности макрофагов [1, 4, 13, 16]. Классическим стимулятором функции фагоцитов являются форболмиристата ацетат и липополисахариды. Поиск высокоактивных веществ, изменяющих функциональную активность макрофагов, привел к созданию Галавита (5-аминофталгидразида) [2]. Вместе с тем механизмы действия Галавита на сегодня остаются не изученными.
Цель настоящей работы — оценка in vivo и in vitro индуцируемых эффектов Галавита на хемилюминес-центную активность мононуклеаров периферической крови онкологических и неонкологических больных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 41 онкологический больной (с различной локализацией первичного очага: легкие, молочная железа, тело и шейка матки и т. д.) и 10 пациентов с обострением хронических заболеваний воспалительно-аллергической природы (преимущественно органов дыхания: пневмонии, бронхиты и т. д.) (см. табл. 1). Люминолзависимая ХЛ-активность мононуклеаров крови исследована на люминометре LKB-Wallac 1251 (Финляндия) [5, 6]. Мононуклеары выделены из периферической крови больных центрифугированием в градиенте плотности Histopaque 1077/1119 (Sigma, США) [14]. В кюветы люминометра вносили по 5×105 выделенных клеток в 450 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР- рН 7,4), содержащего 1×10−4 М люминола (5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phtha-lazinedione- Serva, ФРГ) и Галавит в конечной концентрации 0−10 000 мкг/мл. Интенсивность люминолза-висимой ХЛ в 5×105 кл. /мВ оценивали при температуре 37 °C автоматически на люминометре по специальной программе компьютера LKB-Wallac 1254−124 Phagocytosis Program в течение 30 мин после
добавления к взвеси клеток 75 мкл суспензии опсони-зированного зимозана (исходная концентрация 12,5 мг/мл). Зимозан является пусковым фактором метаболического взрыва в мононуклеарах с выбросом в инкубационную среду экстраклеточного пула активных радикалов кислорода, которые, в свою очередь, приводят к окислению люминола с излучением кванта ХЛ [1, 13, 16].
Все больные получали курс внутримышечных инъекций Галавита в дозе 100−400 мг ежедневно в течение 5 дней, затем 5-кратно через день по 100 мг на фоне противовоспалительной терапии неонкологических и комплексной противоопухолевой терапии онкологических больных. Анализы ХЛ-активности МН были проведены в 3 срока:
1) при поступлении пациента в клинику (до начала курса Галавита, т. е. измерение спонтанной in vivo неиндуцированной Галавитом ХЛ-активности клеток) —
2) после 5-кратного ежедневного внутримышечного введения Г алавита на фоне противоопухолевой или противовоспалительной терапии соответствующих больных (измерение во время лечения уже in vivo индуцированной Галавитом ХЛ-активности) —
3) после завершения полного 10-кратного курса Галавита на фоне дальнейшего продолжения специфической терапии (после лечения, т. е. отсроченная in vivo реакция клеток крови на галавит).
Противоопухолевая терапия включала (см. табл. 1) либо только лучевое воздействие (у 24 пациентов), химиотерапию (5 пациентов), фотодинамическую или лазерную терапию (по 3 пациента), либо комбинированную химиолучевую терапию (5 пациентов), а также химиолучевую терапию с оперативным вмешательством (2 пациента).
Расчеты параметрических (средняя арифметическая, средняя квадратическая ошибка, 95% доверительный интервал и т. д.) и непараметрических (медиана, 25 и 75% квартили и т. д.) критериев, характеризующих ряды выборок, а также оценку статистической значимости различий сравниваемых выборок, осуществляли на компьютере по статистическому пакету программ Statistica for Windows, Release 5. 0- Stat Soft Inc., США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что исходная (in vivo неиндуциро-ванная Галавитом) ХЛ-активность МН онкологических больных достоверно выше, чем уровень показателя неонкологических больных как в отсутствии in vitro воздействия Галавита (рис. 1, А, столбцы при дозе Галавита in vitro 0 мкг/мл), так и в еще большей мере при in vitro индуцирующем влиянии препарата (столбцы при дозе Г алавита in vitro 200−2000 мкг/мл). ХЛ-активность МН при дозе Галавита in vitro 2 и 20 мкг/мл практически не отличалась от уровня спонтанной (крайние слева два столбца — неиндуци-рованная in vivo и in vitro) активности клеток. Увеличение in vitro дозы Галавита до 200−500 мкг/мл приводило к 3−4-кратному усилению исходной (до in vivo при-
менения препарата) ХЛ-активности МН. Максимальный эффект in vitro стимуляции in vivo неинду-цированной ХЛ-активности МН выявлен при дозе Галавита 500 мкг/мл, когда эти показатели достигали почти 450% по сравнению с соответствующим уровнем ХЛ-активности клеток без добавления in vitro Галавита (Галавит in vitro 0 мкг/мл). При дальнейшем увеличении in vitro дозы Галавита до 2000−10 000 мкг/мл было выявлено дозозависимое угнетение ХЛ-активности МН крови. Галавит в дозе 10 000 мкг/мл in vitro приводил почти к полному угнетению ХЛ-активности МН крови онкологических и неонкологических больных. In vitro эффекты Галавита на ХЛ-активность МН неонкологических больных в относительных величинах были менее выраженными. На высоте in vivo 5-кратного ежедневного внутримышечного введения Галавита и по завершении 10-кратного курса препарата (рис. 1, Б) индуциро-
Рис. 1. Изменения исходной (А) и in vivo индуцированной (Б) ХЛ-активности МН крови онкологических и неонкологических больных при in vitro воздействии разных доз Галавита (М±95% доверительный интервал):
А — показатели исходной ХЛ-активности МН крови больных (в момент поступления в клинику, т. е. в отсутствие in vivo индуцирующего воздействии Галавита и специфической терапии) — Б — показатели in vivo индуцированной ХЛ-активности МН крови больных (т. е. на высоте проводимого специфического лечения и 5-кратного в/м введения Галавита) — по оси абсцисс использована in vitro доза Галавита в мкг/мл инкубационной среды- по оси ординат — величина пика ХЛ-активности в 5×105 кл. /мВ
ванная in vitro ХЛ-активность МН (т. е. вторичный ответ клеток) онкологических больных сохранялась также на более высоком уровне по отношению к значениям показателя неонкологических больных.
Таким образом, по всей видимости, речь может идти о более высокой функциональной активности МН крови онкологических больных по сравнению с исследованными неонкологическими больными. Об этом свидетельствуют также ранее опубликованные нами клинико-экспериментальные данные по оценке in vivo неиндуцированной ХЛ-активности МН и нейтрофилов крови пациентов с опухолями верхних дыхательных путей [5]. Повышение ХЛ-активности клеток крови онкологических больных, вероятно, связано с активацией пула моноцитов и естественных киллеров (NK-клеток), входящих во фракцию выделенных мононуклеаров крови [9]. Клетки крови паци-ентов-опухоленосителей, по-видимому, уже изначально сенсибилизированы (примированы) чужеродными для макроорганизма продуктами жизнедеятельности опухолевых клеток [10, 11], поэтому уровень спонтанной in vivo и in vitro индуцированной Галавитом ХЛ-активности МН существенно выше по отношению к показателям пациентов-доноров [5] и неонкологических больных.
По нашему мнению, следует обратить внимание на то, что вторичный (in vitro) ХЛ-ответ МН в конце и на высоте проводимого in vivo курса Галавита (см. рис. 1, Б) у онкологических больных характеризуется тенденцией к снижению по отношению к исходному (т. е. до начала лечения) уровню показателя при всех исследованных in vitro дозах препарата (см. рис. 1, А). Величина вторичного (in vitro) ответа клеток по мере проводимого курса in vivo терапии Галавитом характеризуется тенденцией к снижению. Следовательно, имеет место развитие признаков рефрактерности [2] макрофагов к стимулирующему in vivo воздействию малых доз Галавита. Однако рефрактерность МН преодолевается (клетки реактивируются) при повторном in vitro действии существенно больших доз Галавита. Исследованная in vitro доза Галавита 2−20 мкг/мл в целом соответствует расчетным значениям концентрации в системном кровотоке или в пересчете на общую массу тела в первые часы после внутримышечной инъекции пациенту 100 мг препарата. У обследованных в качестве контроля неонкологических больных с заболеваниями воспалительно-аллергической природы наблюдали обратную тенденцию: ХЛ-активность МН крови на in vitro воздействие Г алавита была выше на фоне первичного (in vivo) воздействия препарата по сравнению с исходными значениями оцениваемого показателя.
В табл. 1 представлены систематизированные данные по распространенности опухолевого процесса и использованным схемам комплексного лечения обследованных онкологических больных. В 3 основные группы (по локализации первичного очага) было отобрано к обследованию по 13 больных, которые на фоне специфической противоопухолевой терапии получали также
курс внутримышечных инъекций Галавита. Среди больных наиболее распространенной (46,3%) формой оказалась Tj-T2 и менее распространенной (34,3%) — Т3-Т4. При этом у 24 (58,5%) пациентов были выявлены метастазы в регионарные лимфатические узлы, а у 1 (при раке легкого) — отдаленные метастазы. In vitro индуцированная ХЛ-активность МН на высоте комплексного лечения у пациентов с распространенными формами опухолей (Т3-Т4, N1-N3) была значительно выше, чем у больных с ранними стадиями заболевания (Т1-Т2, N0) (рис. 2). Возможно, в связи с превалированием более ранних стадий в структуре больных раком матки спонтанная и in vitro индуцированная ХЛ-активность МН в этой группе оказалась наиболее низкой в абсолютных значениях по сравнению с другими локализациями первичного очага (рис. 3, А). Здесь могут играть роль также различия гормонального статуса больных (мужчины и женщины) или другие неучтенные факторы. Вместе с тем различия показателей исходной (до начала лечения) ХЛ-активности в сравниваемых группах (по локализации первичного очага) были не столь выраженными. По нашему мнению, высказанные положения требуют дальнейших уточнений на больших группах больных, а приведенные факты следует признать в качестве предварительных (на малых объемах выборок в условных группах больных).
Таблица 1
Распределение больных, обследованных на ХЛ-активность МН крови, в зависимости от локализации, распространенности опухолевого поражения и схем комплексного лечения
Рис. 2. Зависимость in vivo и in vitro индуцированной ХЛ-активности МН крови больных от размеров опухоли (А) и наличия метастазов (Б):
по оси абсцисс использована in vitro доза Галавита в мкг/мл инкубационной среды- по оси ординат — величина пика ХЛ-активности в 5×105 кл. /мВ
Первичный очаг Онкологические больные Всею
Легкие Молоч пая железа Матка Другие
Количество больных 13 13 13 2 41
И? 3 Т1 — 2 3 5
Т2 4 5 4 1 14
ТЗ 3 2 I 6
Т4 3 4 1 8
Z Е 7. N0 2 1 2 1 6
N1−3 8 12 4 24
МО 6 12 6 1 25
М1 1 — 1
Е 3 100 мг/сутки 6 4 а 6 20
200−400 мг/сутки 7 9 5 2]
3 1 — и? — Лучевая терапия 9 6 9 24
Химиотерапия 1 I 1 3
Лучевая и химиотерапия 1 4 5
Лучевая, химиотерапия и операция 1 1 2
Фотолинамичсская терапия 3 3
Лазерная терапия 1 2 3
По суточной дозировке Галавита в первые 5 дней комплексного лечения онкологических и неонкологических больных (см. табл. 1) были использованы 2 схемы:
1) больные (20 онкологических и 6 неонкологических), у которых в первые 5 дней суточная доза Галавита составила 100 мг-
2) больные (21 онкологический и 4 неонкологических), у которых в первые 5 дней суточная доза препарата составила 200−400 мг.
Прослеживается четкая зависимость влияния суточной дозы Галавита в схеме комплексного лечения онкологических больных на уровень in vitro индуцированной и неиндуцированной ХЛ-активности МН кро-
ви (рис. 3, Б). 2-кратное повышение использованной in vivo дозы Галавита приводило к заметному усилению in vitro индуцированного ХЛ-ответа МН крови онкологических больных.
Результаты наших исследований in vivo и in vitro эффектов Галавита на люминолзависимую ХЛ-активность МН крови онкологических больных позволили уточнить отдельные патогенетические механизмы активации макрофагов, а также получить новые данные по модифицирующему влиянию Галавита на формирование активированного (в т. ч. опухолегенного) статуса МН. Сенсибилизированные (примированные) макрофаги являются необходимым компонентом системы естественной противоопухолевой резистентности [3, 8−11]. Активированные макрофаги действуют на опухолевые и бактериальные клетки либо цитотоксически (цитостатически), либо в форме фагоцитарной реакции. Эффек-торные реакции макрофагов на опухолевые клетки связаны не только с быстрой продукцией токсических су-пероксидных радикалов кислорода, но и с продукцией других гуморальных факторов (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей, нейтральные проте-азы, кислые гидролазы, оксид азота и т. д.) [7, 8, 13, 14]. Известно, что формирование токсических радикалов кислорода на 10% связано с мембранной НАДФ-Н-ок-сидазой и на 90% - с ксантиноксидазой [8]. Источни-
Рис. 3. Зависимость in vivo и in vitro индуцированной ХЛ-активности МН крови больных от локализации первичного очага (А) и дозы в/м введения Галавита в схеме комплексного лечения (Б):
по оси абсцисс использована in vitro доза Галавита в мкг/мл инкубационной среды- по оси ординат — величина пика ХЛ-активности в 5×105 кл. /мВ
ком НАДФ-Н в макрофагах является преимущественно гексозомонофосфатный путь окисления углеводов. Ксантиноксидазный механизм катаболизма пуринов и пиримидинов в макрофагах обеспечивает главным образом формирование синглетного кислорода и в меньшей степени — перекиси водорода. Люминолзависимая Х Л формируется в системе миелопероксидазы и отражает суммарную активность супероксидных анион-радикалов, гидроксильного радикала, синглетного кислорода и т. д. [1, 13, 16].
Перечисленные механизмы, по-видимому, обеспечивают в абсолютных значениях превалирование лю-минолзависимой над люцигенинзависимой ХЛ-актив-ностью МН, индуцированных Галавитом in vivo и in vitro. Вместе с тем в предыдущей публикации нами было показано, что относительная величина прироста люцигенинзависимой ХЛ-активности при воздействии одной и той же дозы Галавита in vitro превалирует над эффектами на люмимнолзависимую ХЛ [6]. Эти данные служат в качестве доказательства того, что в основе стимулирующего эффекта Галавита на ХЛ-актив-ность МН, вероятно, доминирует механизм гиперпродукции супероксидного анион-радикала, поскольку люцигенин является специфическим зондом преимущественно на эти кислородные радикалы [1].
Планируя работу и излагая полученный материал (каким бы запутанным, на первый взгляд, он не показался), мы исходили из позиции оценки функциональных резервов макрофагов (реактивности клеток) до и в процессе проводимого комплексного лечения онкологических больных. Индикаторные ХЛ-тесты, основанные на высокой реактивности МН, должны, по нашему мнению, в ближайшее время найти более широкое применение в клинической практике при оценке выбора средств управления уровнем общей резистентности организма больных в онкологии и в клинике инфекционных заболеваний. ХЛ-тест по чувствительности и специфичности превосходит как минимум на 2 порядка все имеющиеся на сегодня лабораторные показатели оценки функциональных резервов макрофагов.
ВЫВОДЫ
Учитывая изложенные факты, можно утверждать, что Галавит характеризуется способностью стимулировать или угнетать (в зависимости от используемой его дозировки) функциональную активность МН крови, а следовательно, через указанные механизмы оказывать влияние и на общую резистентность организма к бактериальной и опухолевой инвазии. В связи с этим важно установить, насколько универсален механизм активирующего воздействия Галавита (действует ли аналогично препарат и на другие виды тканевых макрофагов), исследовать биохимические механизмы активации и сопряженность их с секреторной (в более широком плане), цитостатической и фагоцитарной функциями макрофагов. Указанные направления могут составить предмет дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю. А., Шерстнее М. П. Хемилюми-несценция клеток животных // Итоги науки и техники. Биофизика. ВИНИТИ. — М., 1989. — Т. 24. — С. 120.
2. Галавит в эксперименте и клинике / Под ред. М. Т. Абидова. — М., 1999. — 60 с.
3. Дейчман Г. И. Роль естественной резистентности в реакции организма на возникновение, рост и метаста-зирование опухолей // Итоги науки и техники. Онкология. ВИНИТИ. — М., 1984. — Т. 13. — С. 46−97.
4. Маянский А. Н., Маянский Д. ДОчерки о ней-трофиле и макрофаге. — Новосибирск: Наука, 1989.
— С. 130−147.
5. Петров В. Н., Андреев В. Г., Петров А. В. и др. // Рос. онкол. журн. — 1999. — № 3. — С. 19−23.
6. Петров В. Н., Цыб А. Ф., Каплан М. А. и др. // Междунар. мед. журн. — 2001. — № 5. — С. 417−420.
7. Потапова Г. И. // Вестник РАМН. — 1993. — № 4. — С. 3−7.
8. Потапова Г. И., Храмцова С. ДРоль аденозин-дезаминазы и метаболизма пуринов и пиримидинов в нарушении функции иммунных клеток при злокачественном росте // Итоги науки и техники. Онкология. ВИНИТИ. — М., 1993. — Т. 23. — С. 85−168.
9. Славина Е. Г. Лимфоциты-естественные киллеры (ЫК-клетки)-эффекторные клетки естественной
противоопухолевой резистентности // Итоги науки и техники. Онкология. ВИНИТИ. — М., 1984. — Т. 13.
— С. 98−141.
10. Суслов А. П. Роль мононуклеарных фагоцитов в деструкции клеток опухолей // Итоги науки и техники. Онкология. ВИНИТИ. — М., 1984. — Т. 13. — С. 142−210.
11. Суслов А. П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет // Итоги науки и техники. Онкология. ВИНИТИ. — М., 1990. — Т. 19. — С. 3−162.
12. Фрейндлин И. С. // Иммунология. — 1995. — № 3. — С. 44−48.
13. De Baetselier P., Schram E. Luminescent Bioassays Based on Macrophage Cell Lines // Methods in Enzymology. — New York: Academic Press, 1986. — Vol. 133. — P. 507−530.
14. English D., Andersen B. R. // J. Immunol. Meth.
— 1974. — Vol. 5. — P. 249.
15. Rossi F. // Biochem. Biophys. Acta. — 1986. — Vol. 853. — P. 65−89.
16. Van Dyke K., Van Dyke Ch. Cellular Chemilumi-nescence Associated with Disease States // Methods in Enzymology. — New York: Academic Press, 1986. — Vol. 133. — P. 493−507.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой