Белковые микрочипы для диагностики злокачественных новообразований.
Разработка биочипа на простата-специфический антиген

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 616−006. 04−07−09"-
PROTEIN MICROCHIPS USED IN DIAGNOSTICS
OF MALIGNANT FORMATIONS. BIOCHIP DEV ELOPMENT TOWARDS PROSTATE
SPECIFIC ANTIGEN
Т. V. Osipova'-, TP. Ryabyh1, E.I. Dement leva2, E.L. Dariy2, A. Yu. Rubina A.S. Zasedatelev2, D. Yu. Blokhin'-, A. Yu. Baryshnikov'-, A.D. Mirzabekov2 '-N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS 2 V.A. Enguelgcirdt Institute of Molecular Biology RAS
ABSTRACT
Different tumor-associated antigens have found a wide utility in diagnostic and monitoring of cancer patients. Using of a new microchip technique makes it possible to test a rich variety of samples using many tumor markers. The goal of the investigation was to devise a technique of protein microchips for measuring of prostate cancer marker, prostate-specific antigen (PSA) in sera of cancer patients.
The gel-based biochips developed by Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS were used in the investigation. This biochip represented an array of three dimensional semi-spherical gel elements separated from each other with hydrophobic surface of a microscope slide. Diameter of gel drops was 50−300 (цт depending on a robot pin (GMS417 Arrayer, Affymetrix). The gel-immobilization of proteins is based on co-polymerization method.
Two variants of immunoassay were used: direct and «sandwich"-assay. In direct immunoassay antigen (PSA) was immobilized into polyacrylamide gels, and then PSA-specific monoclonal antibodies, labeled by fluorescent dye. coated on to the chip. In the antigen-capture two-site («sandwich») assay PSA and two specific monoclonal antibodies, directed towards the different antigen determinants, were used. Signals from microchip gel elements, involving fluorescent labels (Texas Red or Cy 3). were determined by special fluorescent microscope. Calibration curve fluorescence signal vs PSA concentration in solution was constructed, and PSA concentration in blood serum samples was determined.
It was demonstrated that the possibility exists for determination of small PSA concentrations by fluorescent immunoassay under the gel conditions. The minimum concentration of antigen detected in «sandwich» assay was ~0. 25 ng/ml. Sera of the patients with prostate cancer were analyzed by new protein biochip. and data obtained were compared with those for commercial kit PSA/Total EIA II Cobas Core (Switzerland). Correlation coefficient between PSA concentrations in sera of patients with prostate cancer determined by both methods was 0,99(p& lt-0. 01).
Data presented in the work demonstrate a radical new method for cancer diagnostics by protein microchips. The application of this method for evaluation of different tumor markers opens the possibility of analysis of variety samples of patient'-s sera using many tumor markers.
БЕЛКОВЫЕ МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ.
РАЗРАБОТКА БИОЧИПА НА ПРОСТАТА-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ АНТИГЕН
Т.В. Осипова'-, Т.П. Рябых'-, Е.И. Дементьева2, Е.Л. Дарий2, А.Ю. Рубина2, А.С. Заседателев2, Д.Ю. Блохин'-, А.Ю. Барышников'-, АД. Мирзабеков2 1 Г У Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН -Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН
РЕЗЮМЕ
Различные опухолеассоииированные антигены играют существенную роль в своевременной диагностике и мониторинге злокачественных заболеваний. Важнейшим направлением совершенствования лабораторной диагностики является создание мнкротехнологий, использующих многоэлементные матрицы. — микрочипы, позволяющие снизить количество исследуемого материала, расход дорогостоящих реактивов и в результате уменьшить стоимость каждого анализа. Разработанная в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгель-
РОССИЙСКИЙ Б И ОТЕ Р, А П Е ВТ И Ч ЕСКИ Й ЖУРНАЛ
Ш/ТОМ2/2003
гардта РАН технология изготовления биологических микрочипов позволяет проводить одновременный анализ большого количества образцов по многим параметрам. Целью настоящей работы была разработка микрочипа для измерения простата-специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови онкологических больных. Иммобилизацию антител в гидрогель производили методом сополимеризации, при этом моноклоналыше антитела сохраняли свою иммунологическую активность. При использовании прямого варианта иммуноанализа антиген (ПСА) иммобилизировали в гидрогель, после чего па чип наносили моноклональные антитела к ПСА. меченные флуоресцентным красителем. Для «сэндвич"-анализа использовали ПСА и 2 моноклональных антитела. направленных к разным детерминантам антигена. Сигналы от гелевых ячеек микрочипов, содержащих флуоресцентные метки (Техасский красный или Су 3). измеряли специальным флуоресцентным микроскопом. Оказалось, что минимальные концентрации антигена, определяемые в «сэндвич"-варианте иммуноанализа на микрочипе, составляют 0. 25 нг/мл. Коэффициент корреляции результатов анализа сывороток больных раком -: ростаты. полученных с помощью нового белкового микрочипа, и данных, полученных с помощью коммерческого набора PSA/Total Е1А II Cobas Core (Швейцария), составлял 0. 99 (р& lt-0,01).
Таким образом, доказана принципиальная возможность взаимодействий ПСА со специфическими моно-• тональными антителами в условиях гелевых элементов микрочипа, а также количественного иммуноанали-& gt-а Подобраны условия, при которых неспецнфические взаимодействия сведены к минимуму. Разрабатываемые чипы могут быть использованы для определения уровня ПСА в сыворотках крови человека.
Введение
Известно, что заболеваемость злокачественными & gt-пухолями в мире постоянно увеличивается. Для ди-ностики и контроля за лечением (мониторинг) в он-ь югических клиниках наиболее успешно использу-ются серологические опухолеассошшрованные марке-г ы (ОМ). Это сложные белки, синтезируемые и секре-р& gt- емые опухолевыми клетками в значительно боль-. количествах, чем нормальными [7]. ОМ откры-ыют новые возможное™ в лечении онкологических иболеваний, позволяют дифференцировать злокаче-. таенные и доброкачественные опухоли, определять. ¦ алию заболевания, своевременно выявлять и диаг-.: нровать рецидив. Измерение уровня соответствуй ¦с. -го маркера может решающим образом повлиять — & gt-ффект лечения.
Анализ О М проводится иммунохимическими мето-_ м-: с помощью стандартных диагностических наборов. :! а сегодняшний день важнейшим направлением совер--& gt- VI вования лабораторной диагностики является со-. ие микротехнологий, использующих многоэлемент-к--, матрицы — микрочипы, аналитические устройства, пеп — чяюшие проводить параллельный, одновременный Шил"специфических взаимодействий биологических «р-. молекул. Основное преимущество микрочипа перед традиционными методами — возможность анализа 6: :ого количества образцовс использованием мини-м ьных количеств анализируемого материала и доро-п стоящих реагентов (2- 18].
За последние годы биологические микрочипы вы-: илиеь в самостоятельную область науки и исполь-уичся в исследованиях фундаментальных проблем ы екулярвой биологин. Они приходят на смену ру-н» -ь-м аналитическим методам в медицине, биотех-м: ни. ветеринарии, фармакологии и т. д.
Каждая ячейка мнкрочнпа содержит иммобилизо-к ое вещество (ДНК. РНК. белки, моноклональные а. итела. лиганды. рецепторы и т. д.). способное спе-к- - и чески взаимодействовать с молекулами анали-» г-емого образца, образуя соответствующие комп-Наиболее широкое применение в последнее -ч кгилетие получили ДНК-мнкрочипы. содержащие ¦ «¦ ¦ юилизованные олнгонуклеотидные зонды [22]. С
V- ТОМ2/2003
помощью таких чипов можно выявлять генетические мутации и другие перестройки в генах, что может найти применение в диагностике различных заболеваний и определении лекарственной устойчивости. В настоящее время в науке и медицине успешно применяются коммерческие ДНК-чипы [24].
Однако преимуществешюе внимание уделяется развитию технологии белковых микрочипов, так как именно белкн реализуют важнейшие функции клетки. Белковые мнкрочипы могут стать мощным средством дтя изучения биологической роли огромного количества белков. определения их способности взаимодействовать друг с другом и прочими компонентами клетки, а кроме того, могут найти применение в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем в диагностических целях: для определения иммунного статуса организма, выявления специфических антигенов и антител, идентификации аллергенов, определения ОМ [21].
Последние 5 лет ведется разработка белковых микрочнпов для проведения иммунологического анализа [9- 13- 17- 26]. Сфера применения иммуночипов может быть разнообразна: анализ различных цитоки-нов [19], инфекционных агентов [13], гормонов [25], опухолевых маркеров [23- 29- 30], антител к опухолевым маркерам [10].
В ряде лабораторий мира разрабатывают технологии изготоатения белковых микроматриц, применяя различные способы нанесения и иммобилизации белков. В Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгар-дта РАН разработаны микрочипы на основе трехмерных гидрогелей. Показано, что в полусферические ячейки гидрогеля диаметром -100 мкм и объемом ~ 1 нл могут быть успешно иммобилизованы различные белки [6- 9]. Белковые чипы используют для проведешь различных реакций, в том числе, иммунологических. Различные варианты иммуноанализа-прямой, непрямой, «сэн-двич"-анализ — осуществляют в гелевых ячейках [9]. Нами ранее показана возможность выполнения количественного анализа белков в таких чипах [6].
Целый ряд диагностических тест-систем, используемых в онкологических клиниках, создан на основе иммунометрических методов как наиболее специфичных и высокочувствительных. Диагностика злокаче-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ствеиных новообразовании с помошью этих методов основана на количественных и змерениях уровня ОМ в сыворотке крови, который коррелирует с размером опухоли и стадией заболевания [20].
Рак предстательной железы (РПЖ). одно in самых распространенных онкологических заболеваний у мужчин. занимает одно из первых мест по смертности и частоте заболеваний. Характерной особенностью РПЖ является медленное скрытое течение вплоть до поздних стадий. Более половины первично выявленных больных РПЖ уже имеют костные метастазы [ 16]. Это указывает на необходимость поиска и создания эффективных современных способов диагностики РПЖ. которые легли бы в основу создания скришшговых программ для массового обследования мужского населения.
Широко внедрен в клиническую практику проста-та-специфический антиген (ПСА), общепризнанный серологический диагностический маркер РПЖ [28: 15]. ПСА применяется не только для дифференциальной диагностики и мониторинга, но и для скринингового обнаружения клинически не проявляемых опухолей [14- 8]. Мужчины старше 55 лет составляют группу высокого риска РПЖ. Их систематическое обследование на ПСА выявляет самые ранние стадш! этой формы рака [3].
Целью настоящего исследования была разработка диагностического биочипа на ПСА. В данной статье представлены результаты первых этапов исследования.
Материалы и методы
Моноклональные антитела Используемые в работе моноклональные антитела (МКА). специфические к ПСА. были получены в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Антитела имели изотип IgGl и легкую цепь каппа, не осуществляли перекрестной реактивности с другими антигенами (бычий и человеческий сывороточный альбумины. 3−2 мнкроглобулин, СА 19−9, СА-125). В 2001 г. на основе этих МКА была разработана диагностическая нммуноферментная тест-система (вариант «сэндвич») на общий ПСА [5], по своим диагностическим и аналитическим параметрам не уступающая коммерческому набору PSA/Total EIAII Cobas Core (Швейцария).
Антиген
ПСА получали из спермы здоровых доноров по методике, разработанной в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН [1]. Чистота антигена составляла 99%.
Изготовление микрочипов Гелевые микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела, получали методом фотоиндуиирован-ной сополимернзации, разработанным в Центре биологических мнкрочипов ИМБ РАН [4- 6- 27]. Стеклянные пластинки (2947 Micro Slides фирмы Corning. США), 25×75 мм. обрабатывали раствором Bind-Silane. промывали и высушивали. К 18 мкл раствора полнмеризационной смеси, содержащего ннзкомоле-кулярные компоненты геля, добавляли 2 мкл раствора белка (антитела), 6 мг/мл в 0. 015 М фосфатном
буфере. pH 7,2. содержащем 150 мМ NaCI (PBS), полученную смесь помещали в ячейки 384-луночного микротитровалыюго планшета (Genetix, UK). С использованием пина робота (GMS 417 Arrayer. AtTymetrix. США) раствор из каждой лунки планшета наносили в виде капель на поверхность стеклянного слайда. Диаметр гелевых элементов составлял 50−300 мкм. в зависимости от размера пина робота. Полимеризацию геля проводили при облучении ультрафиолетовым светом (350 нм) с интенсивностью 0. 06 мкВт/см2 (лампа Sylvania GTE. F15T8/350 BL. США. 15 Вт) в течение 30 мин при комнатной температуре в токе азота. После полимеризации микрочииы отмывали PBS. содержащим 0.1% Твин-20 (PBST). при комнатной температуре -для удаления незаполимеризовавших-ся мономеров и белков — и хранили при 10 °C.
Измерение флюоресцентных сигналов
Флюоресцентные сигналы от гелевых ячеек микрочипов. содержащих флюоресцентные метки, измеряли с помошью специально сконструированного флюоресцентного микроскопа, снабженного CCD-камерой и компьютерными программами для визуализации изображения и математических операций с измеренными сигналами [11: 12]. Для красителей Техасский красный и СуЗ использовали фильтры возбуждение/ эмиссия 580/630 и 535/590 нм соответственно.
Окрашивание антител флюоресцентными красителями
Антитела переводили в боратный буфер pH 9.3 гель-фильтрацией на спин-колонке (фирмы Bio-Rad. США), содержащей сефадекс G-25 coarse (Amersham Pharmacia Biotech, США). К 500 мкл раствора антитела (5−8 мг/мл) в боратном буфере pH 9.3 добавляли 5−10 мкл раствора Техасский красный-сульфоннлхло-рид или Су 3-сукцшшмндиый эфир в ацетонитрпле или диметилформамиде при молярном соотношении белок: краситель 1: 10. Полученную смесь перемешивали 2 ч при 4 °C. Окрашенные антитела очищали от ннз-комолекулярных примесей гель-фильтрацией на Сефадекс G-25 coarse. Получали спектр поглощения окрашенных белков в диапазоне 250−600 нм и рассчитывали количество молекул красителя, введенных в молекулу белка, по поглощению при 280 нм (белок). 595 (Техасский красный) или 545 нм (Су 3).
Прямой иммуноанализ простата-специфического антигена на микрочипах
Были изготовлены микрочипы, содержащие иммобилизованный антиген (ПСА) в концентрации 1−100 мкг/мл. В этом случае для стабилизации ПСА в поли-меризационную смесь добавляли Г/. БСА. Микрочип содержал также иммобилизованные иммуноглобулины человека (HIgG) в тех же концентрациях. После полимеризации микрочипы промывали PBST 2 ч при комнатной температуре. На отмытые чипы наносили блокировочный раствор (2% БСА, 5% сахароза в PBS, pH 7,2) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. После блокировки на мнкрочнпы наносили по 20 мкл раствора моноклональных антител к ПСА (ИКО-168), меченных Техасским красным. 5 мкг/мл в PBS. и
российский биотерапевтический журнал
№ 3/том2/200Э
инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в PBST в течение I ч при комнатной температуре измеряли интенсивность флюоресцентных сигналов от гелевых элементов мнкрочипа.
Сзпдвич-иммуноаиализ простата-специфического антигена на микрочипах Моноклональныс антитела к ПСА (ИКО-204) были иммобилизованы в гелевых ячейках микрочнпа диаметром 200 мкм (0.3 мг белка на 1 мл геля). Для оценки неспецифических взаимодействий микрочнп содержал иммобилизованные иммуноглобулины чело-зека (HIgG) в той же концентрации и гелевые ячейки, не содержащие иммобилизованных компонентов (пу-V: ые гели). После полимеризации мнкрочипы промы-аали и инкубировали с блокировочным раствором, как :. исано выше. После блокировки на микрочипы на-енли по 20 мкл растворов Г1СА (0,5−100 иг/мл в PBS,. держащем 4% бычьего сывороточного альбумина, ВС) или сывороток крови, разбавленных в 2 раза PBS. и инкубировали при 10 °C в течение ночи. Далее мик-г- чипы промывали PBST 15 мин при комнатной темпе-гмтуре и проявляли вторичными моноклональными ан-нтелами к ПСА (ИКО-168), меченными СуЗ, 5 мкг/мл i PBS. 1 ч. t После отмывки в PBST в течение 1 ч при
комм *
• мнатиой температуре измеряли интенсивность флю-. ресцентных сигналов от гелевых элементов микрочн-: Ив завершение строили график зависимости ин-. нснвности флюоресценции от концентрации ПСА в: м. гворе. из которого определяли неизвестную концен-
¦ гацию ПСА в сыворотке крови.
Одновременный анализ нескольких антигенов на микрочипах
Были изготовлены микрочипы, содержащие мо-!¦ зональные антитела к ПСА. моноклональпые ан-: ела к РЭА и иммуноглобулины человека (HIgG) | - мг/мл) и гелевые ячейки, не содержащие иммо-Г — нзованных компонентов (пустые гели). После отмывки и блокировки на микрочипы наносили раствор & lt- ого из антигенов (ПСА или РЭА) в PBS, содержа-: 1сч 4 БСА. и инкубировали при 10& quot-C в течение | ж Микрочипы промывали PBST 15 мин при ком-I -: ной температуре и проявляли смесью моноклональ-I ы антител к Г1СА и РЭА. меченных СуЗ, 5 мкг/мл, a PBS 1 ч при комнатной температуре. После этого ¦riмеряли интенсивность флюоресцентных сигналов
¦ ¦ елевых элементов мнкрочипа.
Статистическая обработка результатов.
Коррелялицонпый и регрессионный анализ прово-.: при помощи пакета программ Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Чнализ онкомаркеров на биочипах — новая область. зременной диагностики. поэтому в задачу настояще-: с исследования входила отработка всех этапов имму-лнализа: иммобилизация антител, подбор концентра-. антигена, подбор оптимальных условий окрашивания MКА флюоресцентными красителями идр.
11ммо0нлизашпо антител в ячейках гидрогеля про-и.?. шли методом фотоиндуцнрованной сополимери-
зации. Эффективность иммобилизации оценивали с помощью флюоресцентно меченных антител. Было показано, что интенсивность сигналов от гелевых ячеек микрочипов. содержащих флюоресцентно меченные МКА, прямо пропорциональна количеству флюоресцентно меченых компонентов. Степень иммобилизации антител. рассчитанная как соотношение флюоресцентных сигналов в гелевых элементах до и после полимеризации и тщательной отмывки, составляла 40−75%. в зависимости от химической композиции полимернзацион-ной смеси, времени и температуры полимеризации.
Иммунореактивность иммобилизованных антител проверяли методом прямого анализа, используяО мыши и антитела к ним. Эту же систему применяли в дальнейшем для отбора оптимальных гелевых композиций и условий полимеризации. Было показано, что антитела, иммобилизованные на мнкрочнпе, сохраняли свою иммунологическую реактивность. Оптимальные условия полимеризации были следующими: концентрация антител 6 мг/мл. время полимеризации 40 мин при м В этих условиях была оценена степень иммобилизации моноклональных антител к ПСА — она составила 45%.
На рис. 1 (А. Б. В) представлены результаты прямого иммуноанализа. Иммобилизованный на микрочипах ПСА проявляли антителами ИКО-204 (а), ИКО-168 (б) и антителами к пероксидазе хрена (в), меченными флюоресцентным красителем Техасским красным. Микрочнп содержал (слева направо — по два ряда): пустые гели, иммобилизованный иммуноглобулин человека Н1§ С. ПСА+БСА и ПСА. Концентрация антигена (ПСА) в геле составляла: 100 (верхний ряд) и далее (следующие ряды) — 20,5 и 1 мкг/мл геля.
При проявлении ПСА окрашенными антителами (рис. I, А. Б) наблюдались яркие сигналы в ячейках, пропорциональные концентрации антигена. При проявлении антителами к пероксидазе (рис. 1. В) наблюдались только слабые неспецнфические сигналы. В пустых гелях свечения не наблюдалось (рис. 1, А, Б, В).
Иммобилизация ПСА в комплексе с БСА приводила к усилению специфического сигнала. По-види-мому, добавление БСА увеличивает стабильность антигена. Использование в этих экспериментах высоких концентраций антигена объяснялось малой стабильностью ПСА и. видимо, его частичной инактивацией в процессе иммобилизации. Дальнейшие исследования проводили с использованием «сэндвич"-варианта иммуноанализа.
На рис. 2. А представлена калибровочная кривая для определения ПСА, полученная в «сэндвич"-вари-анте иммуноанализа. Интервал концентраций составлял от 0 до 12 нг/мл. Из рисунка видно, что зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации антигена имеет линейный характер. На рис. 2. Б дана аналогичная зависимость хтя интервала концентраций антигена от 0 до 25 нг/мл. Минимальная определяемая концентрация ПСА составляла 0,25 нг/мл. На основе этой калибровочной кривой определили уровни ПСА в пробах сывороток больных раком простаты.
Уровни ПСА в сыворотках больных, полученные с помощью мнкрочипа. были сравнены с результатами, выявленными для этих же сывороток в тест-систе-
I/2003
Iii1
JfcVTOM272003
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
э о о о о -о
1600 -1400

1200 —
1000 —
800
600 —
400 200 0
50
100
О + БСА, а — БСА, а неспециф.
150
Рис. 1. Прямой нммуноаналт ПСА иммобилизован на микрочипе в следующих концентрациях: 100 (верхний ряд) — 20 (второй ряд сверху) — 5 (третий ряд сверху) и 1 (нижний ряд) мкг/мл геля. Проявление антителами, меченными1 Техасским красным:
А — ИКО-204- Б — ИКО-168-В — антитела к пероксидазе хрена (АЬ-НИР)
Рис. 2. Зависимость интенсивности флюоресценции от концен 1 ранни ПСА («сэндвич"-иммуноаналнз):
А — интервал концентрации ПСА от 0 ло 12 нг/мл-Б — интервал концентраций от 0 до 25 мг/мл- 1 — раствор- 2 — сыворотки
больных
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ № 3/том2/200
ме PSA/Total ELA//Cobas Core (Швейцария). Коэффи-шент корреляции составил 0. 99 (р& lt-0. 01). Поле корре-: -или и линия регрессии уровней Г1СА, полученных в двух системах, представлены на рис. 3. Согласно дан-ым. можно прийти к заключению, что разрабатываемые чипы пригодны и для количественного определе-ния уровня ПСА в сыворотках человека.
О © © О О
© © © © (c)
0 10 20 30 40 50 Концентрация ПСА, нг/мл (Cobas Core)
— I in. ie корре. 1ЯЦНН и линия регрессии уровней 11С, А • ьлоротках больных, определяемые на микрочние и в т шционной иммуноферментной тест-системе
• * •
• • ы •
.о t
Гак как в перспективе разрабатываемый биочип ЯК, а си включать в себя не один. а много опухолевых ¦ц- «. ср. я. для их проявления необходимо использовать ова. меченых антител. Поэтому вторые антитела, конъ-
¦ & gt-р>- ванные с флюоресцентной меткой, должны быть с р специфичны к своему антигену, не проявляя пе-р»: ной реактивности с другими антигенами чипа.
11риведенные ннже результаты свидетельствуют о
• «чп» 2 разных антигена, нанесенные на чип. могут бы четко проявлены смесыо флюоресиягпю меченных
¦ тител На рис. 4 представлена структура микрочипа С: нооресцентпые изображения (Б. В. Г) после взан-*& gt-. :г!!ствия микрочипа с антигенами и проявления сме-
тнтел к ПСА и раково-эмбриональному антигену Р & gt- меченных Су 3. Как видно из рисунка, после вза-
¦ •¦ действия микрочипа с РЭА (20 нг/мл) и проявления. мл & gt- окрашенных антител наблюдались специфичес-¦*е флнюресцентные сигналы в ячейках 6: 7- 8, содержа-: ¦ I иммобилизованные антитела к РЭА, а после взаи-ш" — лзия с ПСА-специфические сигналы в ячейках I ¦микрочипа, содержащих иммобилизованные анти-
. к ПСА. Не было флюоресцентных сигналов от пус-т. елевых ячеек 3−5, а также ячеек 9 и 10. содержащих, а «V •& lt-"-шизованные Н^в. Следовательно, подобранные у- вия проведения иммуноанализа позволяют свести к «и чуму неспецифические взаимодействия. Невозни-I ерекрестной реакции окрашенных антител к ПСА
* '-¦'- & gt- и антител к РЭА — с ПСА.
Рис. 4. Структура микрочнна (А) и флюоресцентные изображения (Б, В. Г) после взаимодействия микрочипа с антигенами и проявления смесыо антител к ПСА и РЭА, меченных СуЗ:
А — Структура мнкрочнпа:
1.2 — ячейки, содержащие иммобилизованные антитела к ПСА, 0,3 мг/мл:
3, 4. 5 — пустые гели-
6, 7, 8 — ячейки, содержащие иммобилизованные антитела к РЭА. 0.3 мг/мл-
9, 10 — ячейки, содержащие иммобилизованные Н^С, 0.3 мг/
мл.
Б. В, Г — взаимодействие с антигенами: Б: 0 ПСА. 20 нг/мл РЭА: В: 0,5 нг/мл ПСА. 0 РЭА- Г: 4.7 нг/мл ПСА. 0 РЭА.
Таким образом, существует принципиальная возможность взаимодействий ПСА со специфическими мо-ноклональными антителами в условиях гелевых элементов микрочипа, а также количественного иммуноанализа. Подобраны условия, при которых неспсцифические взаимодействия сведены к минимуму. Минимальная концентрация ПСА. определяемая в растворе «сэндвич» иммуноаналнзом. составляет 0,25 нг/мл. Разрабатываемые чипы могут быть использованы для определения уровня ПСА в сыворотках крови человека.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Блохин Д. Ю., Иванов П К. Донская О Н Выделение и очистка простатического специфического антигена //
м2/2003 — *2/2003 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 БИОМАРКЕРЫ
Тезисы 2- го съезда онкологов стран СНГ «Онкология antigen as prescreening test for prostate cancer // J Urologv. 2000». — Украина. Киев. 2000. — Т. 22. — С. 218. — 1992. — Vol. 147. P. 846−852. 2. ВепгеровЮ.Ю. Микроминиатюризация лабораторных 17. Mendoza L.C. Мс Quary P. Monti an A Gungadhuran R. технологии- перспективы и проблемы // Клиническая и Brignac С. Eggers М. High-throughput microarrays-based лабораторная диагностика.- 1999. — № 9. — С. 5. enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // 3. Карпищенко А. И., Антонов В. Г., Бутенко А. Б идр. Опу- Biotechniques. — 1999 — Vol 27 — Р & quot-'-"-8−780 холи репродуктивных органов и тканей // В кн.: Онко- 18. Mirzabekov A and Kolchinsk. A Emerging array-based маркеры и их диагностическое значение. — Санкт-Пе- technologies in proteomics // Сигт Op Chem Biol. — тербург, 1999. — С. 32 — 38. 2001. — Vol. 6. — P. 70−5. 4. Мирзабеков А. Д. Рубина А.Ю., Паньков С. В. Компози- 19. Moody M.D. Van Arsdell S. l Murphy A P Oreniole цня для полимеризационной иммобилизации биологи- S.F., Burns С. Array-based Elisas for high-throughput чески значимых соединений и способ ее осуществления/ analysis of human cytokines // BioTechmques 2001. / Патент PCT/RU01/420. дата приоритета от 16. 10. 2001. — Vol. 31. — Р 186−194. 5. Осипова Т В. Ленева Н. В. Боровкова И. Б Создание ли- 20. Molina К. Filella X. Alzcarte J et al Prospective агностической тест-системы, выявляющей простатичес- evaluation of tumor markers (c-erbB -2 oncoprotein, кий специфический антиген на основе новых монокло- СЕА and СА 15. 3) in patients with Iccoregional breast нальных антител // Медицинская иммунология. Дни им- cancer // Breast cancer research and treatment 25-th мунологии в Санкт-Петербурге. -2001. — Т. 3. --№ 2. Annual San Antonio Breast Cancer Simpo-. an. 2002 — - C. 150−1. '- 76. — abstr. 126. 6. Рубина А. Ю, ПаньковС. В. Иванов С. М. Дементьева 21. NgJ.H., Hag L. L Biomedical application of protein chips E. If. Мирзабеков А. Д. Белковые микрочипы // ДАН Hi. Cell Mol Med. — 2002 — Vol 6. .V • P '-29−340 2001, — T. 381. -C. 701−4. 22. Proudnikov D. Timofeev E. Mirzabekov A Immobilization 7. Сергеева H.C., Маршу тина HВ Серологические опу- of DNA in polyacrilamide gel for the mar. '--:^. re of DNA холеассониированные маркеры (ОМ) в онкологичес- and DNA-oligonucleotide microchip* Ana Biochcm- кой клинике// Новости прикладной иммунологии и ал- 1998. — Vol. 259 — Р 34−41 лергологин. — 2001. — № 5. — С. 6−7. 23. Sato К. Tokeshi М. Kimura Н Kitam n Т Determination 8. Шапошникова Т. Е. Морозов А.В. Павленко К. А. идр. of carcinocmbrionic antigen in human sera b integrated Простатический специфический антиген в диагноста- bead-bed immunoassays in a microchip i: & lt-.-.-. -r diagnosis ке рака и доброкачественной гиперплазии предстатель- //Anal. Chem. -2001 Vol Р ной железы//Клиническая лабораторная диагностика. 24. Schena М, Heller К 1 T& gt-:er:.*.- TP К trad К , — 1999. -№ 10. — С. 14. Lachenmeir Е. Davis R W Мкгоаггауг biotechnology 9. Arenkov P. Kukhtin A. Gemmell A., Chupeeva, V., discovery platform for tuncti na een m-c* Trends Voloschuk S., Mirzabekov. A. Protein microchips: use for Biotechnol-1998 — Vol !6& lt-~>- P • immunoassay and enzymatic reactions//Anal. Biochem. 25. Schneider В H. Dtek. • •• EL '- r 1/ p ff tr J Г. 2000. — Vol. 278. — P. 123−131. Howard L. V Optical chip immunoassays for hCG in 10. Ascari M» Alarie J. P. Moreno-Bondi M. Vo-Dinh T. human whole blood Bio"en • В & lt-!et:r n 2000. — Application of an antibody for p53 detection and cancer Vol. 15. P 597−604 diagnosis//Biotechnol. Prog. -2001/ - Vol. 17(3). -P. 26 Schneider ВН. Diekenson EL. Vach MP Hoijer J.V., 543−552. Howard L V. Highly sensitive optical chip immunoassays 11. Bar sky Ya. Granunatin A. Ivanov A. Kreindlin E. Kotova in human serum II Biosens Bioclecin n 2& quot-"- - Vol. E. Barskii V. and Mirzabekov A. Wide-field luminescence 15. — P 13−22 microscopes for analyzing biological microchips//J. Opt. 27. VasiliskovA V. Timo'-,, E v.-. — S /& gt-• & gt-'-Vv.4. Technol. — 1998. — Vol 65. — P 938−941 L. Shick V V Mirzabekov A D f jr-va-. iooof nucroarray of 12 Barskv V. PerovA., TokalovS. ChudinovA., Kreindlin E. gel-immobilized compounds on a wf: ip b& gt- copoc. merization / Sharonov A. Kotova E. and A. Mirzabekov. Fluorescence /Biotechniques -1999 —: Г~ P & gt-92−6"-* data analysis on gel-based biochips//J. Biomol Screen. — 28. Watson K. A Tar: D В Hie predict prostate 2002. — Vol. 7. — P. 247−257. acid phosphatase as a screening test i г prostatic cancer / 13. Borrenbaeck C.A. Antibodies in diagnostics — from /N. Engl. J. Med. — 1980 V •: P immunoassays to protein chips//Immunology'-Today.- 29. Xiao Z. Jiang X Beckett U L. и • г G 1 Generationof 2000. — Vol. 21. — P. 379−382. baculovirus recombinant prostate-ipccific membrane 14. Catalona W.J., Smith D S. Ratliff T.L. Measurement of antigen and its use in the development ot ^ novel protein prostate-specific antigen in serum as a screening test for biochip quantitative immunoiiuv и Protein Expr Purif. prostate cancer//N. Eng. J. Med. — 1991, — Vol 324(17). — 2000 — Vol 19(1) -P 12−21 — P. 1156−1161. 30. Xiao Z., Adam В L Cazares LH. Clements MA. Davis 15. Hetherington J. W» SiddallJ.K. Cooper E.H. Contribution J.W. Schellhamnn-r PF Da! ma& lt-s.i F. 4 «'-right G L of scintigraphy, prostate acid phosphatase and prostate- Quantization of scrum prostate-specific membrane antigen specific antigen to monitoring of prostate cancer // Eur. by a novel protein biochip immunoassay discriminates Urology. — 1988. — Vol. 14 (1). — P. 1−5. benign from malignant prostate ci^cav: 1 Cancer Res — 16. Labrie F. Duponl A. Sitrubu R Serum prostate-specific 2001. — Vol. 6I (16| P 6029-Ъ0?3
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ *J/tom2/2003

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой