Низкодозовые антибактериальные биопрепараты на основе лишайников рода Cladonia

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 615. 281. 9
НИЗКОДОЗОВЫЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ЛИШАЙНИКОВ РОДА CLADONIA
1Аньшакова В.В., 2,1Кершенгольц Б.М., 3Корякина В.В., 3ДИванова И.К.
1 Северо-Восточный федеральный университет им. М. К. Аммосова,
Якутск, e-mail: anshakova_v@mail. ru-
2Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, Якутск-
3Институт проблем нефти и газа СО РАН, Якутск
Разработана механохимическая технология получения высокоэффективных твердофазных биокомплексов без участия растворителей в одну технологическую стадию на основе «универсального активного наполнителя» — полимерной матрицы лишайниковых b-олигосахаридов с различными видами фармаконов (известными фармацевтическими препаратами, физиологически активными веществами лекарственных растений). Ударно-истирающее воздействие с добавками твердофазных химических реагентов (например, солей), сопровождается, наряду с разрушением клеточных стенок, изменением химического состава компонентов растительного сырья в результате разрыва ряда химических связей (даже таких прочных, как р-гликозидных) и протекания химических реакций, вплоть до образования некоторых очень важных ФАВ именно в процессе механохимической обработки сырья. Использование «free solvent» процессов на основе природных олигосахаридов приводит к пролонгации действия активного вещества (фармакона), повышению его биологического эффекта в несколько раз, при этом снижая дозу и токсичность.
Ключевые слова: механохимия, биологически активные вещества, лишайники, антибактериальная активность
LOWDOSE ANTIBACTERIAL BIOLOGICAL PRODUCTS ON THE BASIS OF LICHENS OF SORT CLADONIA 1Anshakova V.V., 2,1Kershengoltc B.M., 3Koryakina V.V., 3,1Ivanova I.K.
1North-Eastern Federal University named after M.K. Ammosov, Yakutsk, e-mail: anshakova_v@mail. ru- 2Institute of biological problems ofpermafrost SB RAS, Yakutsk-
3Institute of Oil and Gas Problems, SB RAS, Yakutsk
The mechanochemical technology for producing of high-performance solid-state biocomplexes processing without solvent in one technological stage based on «universal active filler» which is a polymer lichen b-oligosaccharide matrix with different kind of API (known pharmaceuticals, physiologically active substances of herbs) is developed. Impact-abrasive effect with additives of solid-state chemical reagents (eg. Salts), followed by changes in the chemical composition of the components of plant material along with the destruction of cell walls.
It is a result of breaking a number of chemical bonds (even such strong as p-glycoside), and of chemical reactions, including to the formation of some very important API just (namely) in the process of mechanochemical processing of raw materials. The application of «solvent-free» processes based on natural oligosaccharides prolongs of the operation of API and increases of its biological effect in a few times, while reducing the dose and toxicity.
Keywords: mechanochemistry, biologically active substances, lichens, antibacterial activity
В настоящее время для расширения Нами предложена механохимическая сырьевой базы лекарственного и пище- активация лишайникового сырья с микродо-
вого растительного сырья используются бавками твердофазного неорганического ще-
крайне малоисследованные объекты, к ко- лочного реагента с целью увеличения эффек-
торым относятся лишайники, видовое раз- тивности применения как самостоятельного
нообразие которых на территории Якутии ягелевого препарата так и в комплексе с из-
насчитывает свыше пятисот видов [4]. Среди вестными фармпрепаратами [1]. Преимуще-
огромного разнообразия известных видов ством предлагаемой механохимической об-
лишайников особый интерес представляет работки лишайников рода Cladonia является
изучение такого семейства, как Кладониевые тот факт, что в ней нет ни экстракционных,
(Cladoniaceae), по двум причинам: первая — ни гидролизных стадий обработки биосы-
это один из наиболее сложных в химиче- рья, процесс проходит без участия раствори-
ском отношении представителей лишайни- телей в одну технологическую стадию, что
ков [2]. Вторая причина заключается в том, обеспечивает сокращение ресурсо- и энерго-
что основную биомассу ягеля (75−85%) ёмкости технологического процесса.
на Северо-Востоке России образуют пред- Целью настоящей работы является ставители широко известного рода Кладо- изучение влияния эффекта механохими-
ния (Cladonia) — Cladonia rangiferina, C. ческого комплексообразования фармакона
Stellaris, С. arbuscula, C. Mitis, т.к. лишай- (действующего вещества) лишайниковыми
ники рода Cladonia считаются надёжными Р-олигосахаридами на базовые свойства ле-
индикаторами бедных сухих почв. карственного препарата.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись слоевища лишайников рода Cladonia (ягель) механоактивированные и грубоизмельченнные, также твердофазные биокомплексы на основе лишайниковых Р-олигосахаридов, используемых в качестве универсальной матрицы, до 90−95% по массе, с цефазолином.
Механохимическую активацию проводили в воздушной среде в мельнице-активаторе проточного типа ЦЭМ 7−80.
Сравнительный анализ физико-химических
свойств ягеля и биокомплексов на его основе проведен как для грубо измельченного биоматериала, так и для механоактивированных образцов. В качестве физико-химических методов исследования объектов были использованы метод сканирующей электронной микроскопии (сканирующий электронный микроскоп
ТМ-1000_0438 2011. 05. 18 L 32 В хб Ok 20 urn
а
ТМ-1000 Hitachi High Technologies, Япония) и ЯМР спектроскопии (Bruker) [2].
Антибактериальные свойства объектов исследовали in vitro на культурах бактериальных штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов [5].
Результаты исследования и их обсуждение
Использование механохимической обработки разрушает стенки клеток, где находится основная часть физиологически активных веществ растений (ФАВ) и приводит к образованию наноразмерных частиц в твердой фазе (рис. 1), тем самым способствует максимально эффективному выходу (ФАВ) из клеток.
1000. 0444 2011. 05. 1S L D2.8 Х5. 0к 20 um
б
Рис. 1. Сканирующие электронные фотографии структуры ягеля различного измельчения: грубого помола (а), механоактивированного (б)
Химический состав слоевищ лишайников р. Cladonia грубого и механоактиваци-онного помола исследовали с точки зрения перспективности их применения и в качестве комплексообразователя с различными действующими веществами и как чистого лишайникового биопрепарата. Этим обусловлен выбор анализируемых веществ. Комплексообразующая функция обусловлена наличием в исследуемых механоак-тивированных объектах олигосахаридов. Способностью лизировать патогенные и условно патогенные бактериальные клетки обладают лишайниковые кислоты, ярким представителем которых является уснино-вая кислота.
Протонные спектры (рис. 2), полученные на ЯМР-спектрометре высокого разрешения Луапсе III 400 МГц (Бгикег), свидетельствуют о том, что все образцы ягеля содержат большое количество усниновой кислоты. Исследуемые образцы готовили путем растворения соответствующих проб
в дейтерированной воде. '-Н-спектры были сняты по стандартной методике в хлороформе, используя внешний стандарт БМ§ 0.
Все спектры образцов грубого помола и после механоактивационного воздействия в интервале частот 0−6 м. д в аммонийном буффере идентичны в алифатической области спектра. В целом спектр представляет собой смесь усниновой кислоты и полисахаридных веществ.
В районе 3,0−3,4 м.д. проявляются сигналы протонов сахаридного остова лихена-на, который состоит из последовательностей 1,3 и 1,4-связанных остатков глюкозы, помимо которых присутствуют сигналы аномерных протонов полисахаридов при 5,20 и 5,12 м.д. В ходе механоактивации наблюдается изменения интенсивностей сигналов 3,29 и 3,33 м.д., т. е. взаимоизменение их интенсивностей: при механоактивации уменьшается интенсивность сигнала 3,29 при увеличении сигнала 3,33 м.д. (рис. 3), что, возможно, свидетельствует об измене-
нии химического окружения внутри циклов ной среде таких изменений не происходит
полисахарида. В отличие от щелочных экс- и спектры ягеля различного воздействия
трактов исследуемого вещества, в кислот- идентичны.
Рис. 2. Протонные спектры в СНС13:
А — усниновой кислоты- В — ягеля грубого помола С) ягеля после механоактивации
Рис. 3. Протонные спектры ягеля грубого помола (А) и ягеля после механоактивации (В) в аммонийном буфере в интервале 3−3,5 м. д.
Результатом механохимической активации наряду с образованием на-норазмерных частиц является образование Р-олигосахаридных молекул (активного наполнителя) за счёт расщепления части Р-гликозидных связей в лишайниковых Р-полисахаридах. Это также
подтверждено анализом водорастворимых углеводов (по методу восстанавливающих концов) в экстрактах слоевищ лишайников после грубого измельчения либо механохи-мической активации. Содержание легкогидролизуемых углеводов в пробах лишайника рода С^ота составило 4,61 мг/г сухого
образца грубого помола и 33,48 мг/г сухого механоактивированного сырья.
Эффект повышения биоактивности фармакона можно объяснить его ком-плексообразованием с лишайниковыми Р-олигосахаридами (рис. 4).
Поскольку вторичные метаболиты лишайников, например, лишайниковые кислоты (усниновая, леканоровая, физодовая),
обладающие антибиотическим действием, представляют своего рода «внутрилишай-никовый фармакон», было исследовано влияние механохимической активации на антибактериальное действие ягелевого препарата без внесения дополнительных фармаконов, по отношению к восьми штаммам условно-патогенных бактерий (табл. 1).
Рис. 4. Схема межмолекулярных взаимодействий усниновой кислоты с в-олигосахаридами
Таблица 1
Антибактериальное действие порошка (контроль) и препарата механохимически активированного ягеля на культуры условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов
Название видов бактериальных штаммов Антибактериальное действие порошка грубоизмельченных слоевищ лишайников Антибактериальное действие порошка механохимически активированных слоевищ лишайников
Enterobacter cloacae +* +++
Staphylococcus aureus + ++++
Лактозо-негативная E. coli ++ ++++
Klebsiella pneumonia + ++++
Proteus vulgaris ++++ ++++
Гемолитическая E. coli + ++++
E. coli M-17 ++ ++++
Salmonella enteritidis + ++++
Примечания:
+ - слабый лизис- ++ - частичное лизирование- +++ - почти полный лизис- ++++ - полный лизис.
Видно, что если при внесении в питательные среды для культивирования данных штаммов порошка грубоизмельчен-ных слоевищ лишайников в концентрации 5,0 мг/мл наблюдался очень слабый лизис, то внесение механохимически активированных слоевищ лишайников в той же концентрации приводило к полному лизису бактериальных клеток.
Также была исследована способность лишайниковых Р-олигосахаридов повышать активность дополнительно вводимого на стадии механоактивации фармакона, на
примере антибактериального препарата це-фазолина по отношению к бактериальному штамму Е. соШ М17 (табл. 2). Видно, что цефазолин начинал оказывать частичное антибактериальное действие только при концентрациях выше 2,0 мкг/мл, в то время как механохимически активированный композит лишайниковых Р-олигосахаридов с цефазолином оказывал аналогичное ли-зирующее действие уже при концентрации цефазолина 0,25 мкг/мл, т. е. активность цефазолина в таком комплексе возрастала в 8−10 раз.
Таблица 2
Антибактериальное действие комплексного препарата «Лишайник механохимически активированный + цефазолин» в соотношении 100: 1, на штамм Е. соШ М17
№ п/п Концентрация це-фазолина мкг/мл Антибактериальное действие
Комплексный препарат «Механохимически активированный лишайник + цефазолин» Препарат цефазолина (контроль)
1 0,25 ++ *) —
2 0,5 ++ -
3 1,0 ++ +
4 2,0 +++ +
5 4,0 ++++ ++
6 Контроль — -
Примечания: * + - слабый лизис- ++ - частичное лизирование- +++ - почти полный лизис- ++++ - полный лизис- - - полное отсутствие лизиса.
Заключение
Созданные механохимические био-
комплексы на основе лишайникового сырья имеют существенно меньшую дозу активно действующей субстанции, следовательно, они менее токсичны, что позволяет достичь антибактериального эффекта при снижении дозы антибиотика в 10 раз.
Список литературы
1. Механохимические технологии получения биологически активных веществ из лишайников / В. В. Аньшакова, Б. М. Кершенгольц, Е. С. Хлебный, А. А. Шеин // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2011. — Т. 13, № 1. — С. 236−240.
2. Структурное исследование полисахаридов лишайников Севана сиси1Ма и С. 1з1ап& amp-са / РП. Горшкова, Е. Л. Назаренко, В. А. Зубков, Л. С. Степаненко, В. В. Исаков. // Биоорганическая химия. — 1997. — Т. 23, № 2. — С. 134−138.
3. Дембицкий В. М. Органические метаболиты лишайников / В. М. Дембицкий, Г. А. Толстиков. — Новосибирск: Изд-во: «Гео», 2005. — 135 с.
4. Официальный сайт Министерства природных ресурсов и экологии Российской Федерации http: //www. mnr. gov. ru/maps/?region = 14.
5. МУК 4.2. 1890−04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания, утв. главным государственным санитарным врачом РФ 04. 03. 2004.
References
1. An’shakova V.V., Kershengol’c B.M., Hlebnyj E.S., Shein A.A. Izvestija Samarskogo nauchnogo centra Rossijskoj akademii nauk (News of the Samara center of science of the Russian Academy of Sciences), 2011, no. 1, pp. 236−240.
2. Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Stepanenko L.S., Isakov V.V. Bioorganic chemistry, 1997, no. 2, pp. 134−138.
3. Dembickij V.M., Tolstikov G.A. Organicheskie metabol-ity lishajnikov (Organic metabolites of lichens). Novosibirsk, 2005, 135 p.
4. Oficial’nyj sajt Ministerstva prirodnyh resursov i je-kologii Rossijskoj Federacii (Official site of the Ministry of natural resources and ecology of the Russian Federation) http: // www. mnr. gov. ru/maps/7region = 14.
5. MUK 4.2. 1890−04. Opredelenie chuvstvitel’nosti mik-roorganizmov k antibakterial’nym preparatam (Methodical instructions RF) 04. 03. 2004.
Рецензенты:
Федорова С. А., д.б.н., зав. лабораторией молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем Со РАМН, г. Якутск.
Павлова А. И., д.в.н., профессор, проректор по научной работе, зав. кафедрой физиологии и экологии ФВМ ФГОУ ВПО Якутской государственной сельскохозяйственной академии, г. Якутск.
Работа поступила в редакцию 15. 02. 2012.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой