Биологические свойства экзополисахарида Ancylobacter abiegnus

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 579. 22
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА ANCYLOBACTER ABIEGNUS 1Кичемазова Н.В., иБухарова Е.Н., 2Суровцова И.В., 1Карпунина Л.В.
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»,
Саратов, e-mail: natali8519@mail. ru-
2ООО «Научно-инновационная компания „Викдог“, г. Саратов, e-mail: nic. vicdog@mail. ru
Изучены биологические свойства экзополисахарида (ЭПС) бактерии Ancylobacter abiegnus Z-0056 (ан-цилана). Исследовано влияние ЭПС на микроорганизмы естественного местообитания Ancylobacter abiegnus (Singulisphaera mucilaginosa Z-0071, Xanthobacter xylophilus Z-0055) и на тест-штаммы микроорганизмов (Pseudomonas aeruginosa 27 533, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 230). Показано, что исследуемый экзополисахарид в концентрации 1 г/л оказывает положительное влияние на рост некоторых бактерий, в том числе и продуцента — Ancylobacter abiegnus Z-0056. Исследовали влияние ЭПС на клетки инфузорий Colpoda stenii [5] и лабораторных животных (белые мыши). Согласно полученным данным, можно предположить, что бактерии A. abiegnus Z-0056 продуцируют экзополисахарид с целью защиты от поедания простейшими, а также как запасное питательное вещество.
Ключевые слова: экзополисахарид, бактерии-диссипотрофы, биологические свойства, токсичность
BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE ANCYLOBACTER ABIEGNUS EXOPOLYSACCHARIDE 1Kichemazova N.V.,Bukharova E.N., 2Surovtsova I.V., 1Karpunina L.V.
1Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov, Saratov, e-mail: natali8519@mail. ru-
2Research & amp- Innovation Company „Vicdog“, Saratov, e-mail: nic. vicdog@mail. ru
The biological properties of the exopolysaccharide (EPS) of the Ancylobacter abiegnus Z-0056 bacteria (ancylan) were studied. The influence of this EPS on the natural-habitation microorganisms Ancylobacter abiegnus (Singulisphaera mucilaginosa Z-0071, Xanthobacter xylophilus Z-0055) and on test strains of several microorganisms (Pseudomonas aeruginosa 27 533, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035, and Candida albicans 230) was explored. The exopolysaccharide under study in a concentration of 1 g/L was shown to render positive effect on the growth of some bacteria, including the producent itself (Ancylobacter abiegnus Z-0056). The influence of the EPS on the cells of Colpoda stenii infusorians [5] and laboratory animals (while mice) was studied. According to our data, it can be supposed that the A. abiegnus Z-0056 bacteria produce their exopolysaccharide for protection from being eaten by protozoa and as a reserve nutrient.
Keywords: exopolysaccharide, dissipotrophic bacteria, biological properties, toxicity
В последние годы экзополисахариды микробного происхождения привлекают внимание многих исследователей. Микробные ЭПС находят применение в ветеринарии, медицине, фармацевтической, пищевой, химической, нефтедобывающей и других отраслях, поскольку обладают широким спектром физико-химических, функционально-технологических и биологических свойств [2, 13, 14]. В связи с этим поиск новых продуцентов микробного происхождения и всестороннее их изучение представляется актуальной задачей в современной микробиологии и биотехнологии.
Целью работы явилось изучение некоторых биологических свойств ЭПС Ажу1о-bacter abiegnus 2−0056.
Материалы и методы исследований
Объектом исследований явился экзополисахарид, впервые выделенный из культуральной жидкости диссипотрофной бактерии Ancylobacter abiegnus 2 — 0056, названный нами анциланом [11]. Бактерии Ancylobacter abiegnus 2 — 0056 были предоставлены сотрудниками лаборатории реликтовых микробных
сообществ Института микробиологии имени С. Н. Виноградского РАН [8]. Этот микроорганизм выделен из ультрапресных кислых дистрофных вод гниющей древесины ели Северных болот России. Диссипотро-фы вносят весомый вклад в круговорот углерода в экосистеме. Они участвуют в начальной стадии разложения древесины, где концентрация легкодоступных питательных веществ невысока [8].
ЭПС выделяли по общепринятой методике [3] в нашей модификации.
Влияние ЭПС на рост бактерий и грибов изучали методами серийных разведений и диффузии в агар [10,14]. Для проведения эксперимента использовали культуры бактерий сходных местообитаний: Singulisphaera mucilaginosa Z — 0071 и Xanthobacter xylophilus Z — 0055, полученные из лаборатории реликтовых микробных сообществ Института микробиологии имени С. Н. Виноградского РАН [8], а также тест-штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa 27 533, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035 и грибов Candida albicans 230, полученные из музея микроорганизмов кафедры микробиологии, биотехнологии и химии Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова.
Токсичность ЭПС определяли по влиянию на клетки инфузорий Colpoda stenii [5] и лабораторных
животных (белые мыши). Инфузории и мыши были получены из Пензенской областной ветеринарной лаборатории.
Исследования проводили на здоровых самцах белых беспородных мышей в возрасте 1−1,5 месяца со средней массой тела массой 22−25 г. Перед началом эксперимента выдерживали карантин — 21 день. Лабораторных животных содержали по общепринятым методикам [1]. Общий и биохимический анализы крови исследовали с помощью автоматического гематологического анализатора & lt-Жер^еЪ>-. Вскрытие, патоморфологическую диагностику и гистологические исследования проводили по методике ГА. Меркулова [12]. Количество бактерий в кишечнике экспериментальных животных определяли методом серийных
разведений [14]. Для культивирования бактерий использовали среды КАНАФАнМ и лактобакагар.
Результаты исследований и их обсуждение
При изучении влияния анцилана на рост бактерий было обнаружено, что добавление его в концентрации 1 г/л в питательную среду усиливает рост бактерий сходных местообитаний, таких, как Singulisphaera mucilaginosa 2−0071, а также и самого продуцента данного ЭПС-A. abiegnus 2−0056 (табл. 1).
Таблица 1
Влияние экзополисахарида A. abiegnus 2−0056 на рост микроорганизмов сходных
местообитаний
Штамм D, (X=425 нм), без добавления Эж D, (Х=425 нм), с добавлением ЭПC Результат
S. mucilaginosa Z-0071 0,295 0,353 Усиление роста
A. abiegnus Z-0055 0,551 0,574 Усиление роста
X. xylophilus Z-0055 0,379 0,374 Не влияет на рост
Положительное влияние в концентрациях 0,25 г/л, 0,5 г/л и 1 г/л анцилан оказывал и на рост некоторых других бактерий, в частности, Pseudomonas aeruginosa 27 533. В то же время на рост таких микроорга-
низмов, как Xanthobacter xylophilus Z-0055, Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 230, в этих же концентрациях данный ЭПС влияния не оказывал (табл. 1, 2).
Таблица 2
Влияние экзополисахарида A. abiegnus Z-0056 на рост тест-культур микроорганизмов
Концентрация ЭПС Микроорганизмы Зона усиления роста вокруг лунки, мм
0,25 г/л E. coli 01 —
S. aureus 209 —
P. aeruginosa 27 533 3
B. cereus 8035 —
C. albicans 230 —
0,5 г/л E. coli 01 —
S. aureus 209 —
P. aeruginosa 27 533 5
B. cereus 8035 —
C. albicans 230 —
1 г/л E. coli 01 —
S. aureus 209 —
P aeruginosa 27 533 10
B. cereus 8035 —
C. albicans 230 —
Примечание: „-“ не наблюдали усиления роста
Добавление данного биополимера в концентрации 1 г/л в культуру инфузорий (Со1ройа 81епЩ приводило первоначально (через 3 минуты) к их хаотичному движению (табл. 3). С пятой минуты наблюдали замедление движения отдельных клеток. Через 10 минут в поле зрения появлялись мертвые клетки. Через 30 минут наступала гибель 100% инфузорий. Через 50 минут в поле зрения наблюдали только фрагмен-
Исходя из приведенных данных, можно предположить, что исследуемый бактериальный ЭПС в природе играет роль источника питания для некоторых микроорганизмов, включая бактерии-продуценты этого биополимера. Это свойство встречается у олиготрофных бактерий, растущих в условиях дефицита питательных веществ [4]. Токсичность анцилана для инфузорий позволяет говорить о его защитной роли -ЭПС способствует защите бактерий от поедания простейшими в естественной среде обитания.
С целью оценки перспектив возможного применения анцилана были проведены испытания на лабораторных животных. Исследование токсичности ЭПС на лабораторных мышах проводили для оценки степени опасности однократного перорального введения малой и относительно высокой доз — 0,06 и 3 г на 1 кг массы тела животного соответственно. Животные были разделены на 3 группы: 1 группа — контрольная, получавшая физиологический раствор в объеме 1 мл- 2 группа мышей получала анцилан в дозе 0,06 г/кг в объеме 1 мл- 3 группа — получала анцилан в дозе 3,00 г/кг в объеме 1 мл. ЭПС и физиологический раствор вводили в организм мышей перорально через катетер натощак. Наблюдения за животными проводили в течение трех суток. В ходе эксперимента осущест-
ты клеток. В то время как в контроле (инфузории, находящиеся в физиологическом растворе без ЭПС) клетки инфузорий двигались спокойно и оставались живыми в течение всего эксперимента (3 часа). Следовательно, ЭПС А. abiegnus Z-0056 в данной концентрации токсичен для инфузорий, поскольку согласно ГОСТ [5] токсичным считается препарат, если гибель инфузорий наступает в интервале от 10 минут до 3 часов.
вляли контроль динамики массы животных. По окончании периода наблюдений всех животных контрольной и опытных групп подвергли эвтаназии с соблюдением принципов эвтаназии (применение эфирного наркоза), производили вскрытие и определение морфометрических характеристик внутренних органов. Также производили забор содержимого толстого кишечника животных и проводили посев содержимого на чашки Петри со средами для подсчета общего микробного числа бактерий (среда КАМАФАнМ), для молочнокислых бактерий (лактобакагар). Бактерии культивировали в термостате при 37 °C в течение трех суток.
Были получены следующие результаты.
В 1-й группе (контрольной) на протяжении трех суток после введения раствора ЭПС мыши были активны, поведение соответствовало норме. Признаки интоксикации отсутствовали.
Во 2-й группе, получавшей анцилан в дозировке 0,06 г/кг, поведение животных в ходе эксперимента было угнетенным в течение двух суток, затем постепенно приходило в норму, но иногда проявлялись признаки агрессии.
В 3-й группе, получавшей ЭПС в дозировке 3 г/кг, наблюдалось поведение, сходное с поведением мышей 2-й группы. Летальных случаев не наблюдали.
Таблица 3
Действие экзополисахарида А. аbiegnus Z-0056 на инфузории
Время, мин Поведение инфузорий
с ЭПС (опыт) без ЭПС (контроль)
3 Активное хаотичное движение Спокойное движение
5 Замедление движения Спокойное движение
10 Замедленное движение, некоторые клетки мертвые Спокойное движение
30 100% мертвых клеток Спокойное движение
40 10% мертвых клеток 90% разрушенных клеток Спокойное движение
50 В поле зрения только фрагменты клеток Спокойное движение
В течение эксперимента не выявлено временном отрезке пероральное посту-
существенных различий в динамике мас- пление бактериального экзополисахарида
сы опытных и контрольных животных. в организм животных не отражалось на
Это свидетельствует о том, что на данном их росте.
Влияние ЭПС A. abiegnus Z-0056 на массу мышей
Было проведено визуальное изучение, а также сравнительное исследование гистологических срезов печени, почек и сердца животных контрольной и опытных групп. Согласно полученным результатам, внешний вид, размеры и состояние тканей внутренних органов мышей контрольной группы соответствовали показателям клинически здоровых животных. У мышей 3-й группы, получавшей ЭПС в дозировке 3 г/кг, наблюдали изменения в структуре тканей. Так, визуально наблюдали увеличение размера печени по сравнению с контролем. Тканевый материал печени, полученный от 3-й группы, имел более бледную и неоднородную окраску по сравнению с контролем, клетки органа более крупные. Внешний вид почек у животных опытных групп не изменен по сравнению с контролем, однако в тканевом материале, взятом от животных 3-й группы, в цитоплазме клеток видны разных размеров вакуоли, наполненные жидкостью. Внешний вид сердца не изменен по сравнению с контролем. На гистологических срезах сердца мышей 3-й группы наблюдали поверхностную дезорганизацию
соединительной ткани (мукоидное набухание). Описанные изменения наблюдали и у животных 2-й группы, однако они были слабо выражены.
Таким образом, результаты визуальных наблюдений и гистологических исследований внутренних органов лабораторных мышей, получавших анцилан перорально, показывают влияние больших доз ЭПС на лимфо- и кровообращение. В малых дозах это влияние менее выражено.
В опытных группах животных наблюдали изменения некоторых показателей крови (табл. 4). Так, происходило повышение общего содержания белка в 1,1 и 1,5 раза во второй и третьей группе соответственно. Предположительно это было вызвано обезвоживанием организма [9]. Содержание билирубина возрастало во 2 группе в 1,4 раза, в 3 группе в 1,6 раза, что может быть связано с лизисом эритроцитов. Это подтверждается снижением общего количества эритроцитов, что, в свою очередь, объясняет нарушение окраски печени. Вероятно, негативное действие ЭПС на животный организм было вызвано прежде всего его способностью связывать воду.
Таблица 4
Влияние анцилана на некоторые показатели крови мышей
ЭПС Показатели крови
Били- рубин, мкмоль/л Р Белок, г/л Р Количество эритроцитов, х109/л Р
Анцилан 0,06 г/кг 6,10±0,30 & lt-0,05 64,30±3,20 & lt-0,05 7,57±0,30 & lt-0,05
Анцилан 3,0 г/кг 6,90±0,30 & lt-0,05 83,60±4,10 & lt-0,05 7,21±0,30 & lt-0,05
Контроль 4,30±0,17 — 56,20±2,80 — 8,00±0,40 —
Таким образом, эксперименты на лабораторных животных (мыши) показали практическую безвредность анцилана при условии соблюдения дозы. По сравнению с ЭПС ксилофиланом, полученным нами ранее из культуральной жидкости диссипо-трофной бактерии ХапґкоЬасґєг хуіоркіїт Z-0055 [4], анцилан не является токсичным веществом.
При исследовании влияния анцилана на микрофлору кишечника мышей было
Из представленных данных видно, что пероральное введение анцилана способствует увеличению количества молочнокислых бактерий в организме животных (мышей), что наблюдается и при воздействии некоторых других бактериальных ЭПС, как было показано нами ранее [4, 6].
Согласно полученным данным, можно предположить, что бактерии A. abiegnus Z-0056 продуцируют экзополисахарид с целью защиты от поедания простейшими, а также как запасное питательное вещество. После проведения дополнительных исследований анцилан может найти свое применение в ветеринарии, например, как проти-вопротозойное средство для животных.
Список литературы
1. Башенина Н. В. Руководство по содержанию и разведению новых в лабораторной практике видов мелких грызунов. — М.: Изд-во Московского ун-та, 1975. — 166 с.
обнаружено, что при концентрации ЭПС 0,06 г/кг происходило уменьшение общего микробного числа (ОМЧ) в 3,5 раза по сравнению с контролем и увеличение числа молочнокислых бактерий в 5 раз (табл. 5). При введении анцилана в организм мышей в концентрации 3 г/кг наблюдали как увеличение ОМЧ, так и увеличение количества молочнокислых бактерий в 1,1 и 80 раз соответственно по сравнению с контролем.
2. Беседнова Н. Н., Иванушко Л. А., Звягинцева Т. Н., Еля-кова Л. А. Иммунотропные свойства 13- 1^-6-р^-глюка-нов // Антибиотики и химиотерапия. — 2000. — N"2. — С. 37−44.
3. Бухарова Е. Н. Экзополисахарид РаетЬасШш ро1утуха 88А: получение, характеристика и перспективы использования в хлебопекарной промышленности: дисс… канд. биол. наук. — Саратов, 2004. — 189 с.
4. Бухарова Е. Н., Кичемазова Н. В., Бухарова И. А., Су-ровцова И.В., Карпунина Л. В. Исследование биологических свойств экзополисахарида ХапШоЬаС-ег ху1орЫ1ш// Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н. И. Вавилова. -2013. — № 2. — С. 11−14.
5. ГОСТ Р 52 337−2005. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности.
6. Денисова М. Н., Рысмухамбетова Г. Е., Бухарова Е. Н., Суровцова И. В., Карпунина Л. В Изучение влияния экзополисахарида ХапШотопаБ сатрев1-п8 на организм лабораторных животных //Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: мат. Межд. науч. -практ. конф. (28−29 января 2013 г.). — Саратов, 2013. — С. 184−185.
7. Ермольева З. В., Вайсберг Г. Е. Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. — М.: Медицина, 1976. — 184 с.
8. Зайчикова М. В., Берестовская Ю. Ю., Васильева Л. В. Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах //Актуальные аспекты современ-
Таблица 5
Влияние анцилана на микрофлору толстого кишечника мышей
ЭПС ОМЧ, х10п Р Количество молочнокислых бактерий, х109 Р
Анцилан, 0,06 г/кг 2,00±0,09 & lt-0,05 5,00±0,20 & lt-0,05
Анцилан, 3 г/кг 8,00±0,35 & lt-0,05 80,00±3,25 & lt-0,05
Контроль 7,00±0,30 — 1,00±0,05 —
ной микробиологии: V Молодежная школа-конференция с международным участием. — М., 2009. — С. 77−78.
9. Кесарева B.A., Денисенко В. Н. Клиническая интерпретация биохимических показателей сыворотки крови собак и кошек. — М.: КолосС, 2011. — 28 с.
10. Карпунина Л. В., Мельникова У Ю., Суслова Ю. В., Мухачева Е. С., Игнатов В. В. Бактерицидные свойства лектинов азотфиксирующих бацилл //Микробиология. -2003. — Т. 72, № 3. -С. 343−347.
11. Кичемазова Н. В., Жемеричкин Д А., Бухарова Е. Н., Берестовская Ю. Ю., Васильева Л. В., Карпунина Л. В. // Химия и биохимия углеводов: мат. IV Всеросс. школы-конференции (Саратов, 14−16 сентября 2011 г.). — Саратов: ООО (Ракурс», 2011. — С. 60−61.
12. Меркулов EA. Курс патологогистологической техники. — Л.: Медгиз, 1956. — С. 263.
13. Pуководство по медицинской микробиологии. Общая санитарная микробиология. Книга 1- под ред. A. С. Ла-бинской, Е. Г. Волиной. — М.: БИНОМ- - 2008. -1080 с.
14. Arena A., Maugeri T.L., Pavone B., Iannello D., Gug-liandolo C., Bisignano G. Antivirial and immunoregulatory effect of a novel exopolysaccharide from a marine thermotol-erant Bacillus licheniformis // Int. Immunopharmacol. — 2006. -V. 6. — P. 8−13.
References
1. Bashenina, N.V. Rukovodstvo po soderzhaniju i razvedeniju novyh v laboratornoj praktike vidov melkih gryzunov. — Moskva: Izd-vo Moskovskogo un-ta, 1975. — p. 166.
2. Besednova N.N., Ivanushko L.A., Zvjaginceva T.N. ,
Eljakova L.A. Immunotropnye svojstva 13- 16-p-D-
gljukanov // Antibiotiki i himioterapija. — 2000. — no. 2. -pp. 374.
3. Buharova E.N. Jekzopolisaharid Paenibacillus polymyxa 88A: poluchenie, harakteristika i perspektivy ispol'-zovanija v hlebopekarnoj promyshlennosti: diss… kand. biol. nauk. -Saratov. 2004. — p. 189.
4. Buharova E.N., Kichemazova N. V., Buharova I.A., Surovcova I.V., Karpunina L.V. Issledovanie biologicheskih svojstv jekzopolisaharida Xanthobacter xylophilus// Vestnik Saratovskogo gosagrouniversiteta im. N.I. Vavilova. — 2013. -no. 2. — pp. 11−14.
5. GOST R 52 337−2005. Korma, kombikorma, kombikormovoe syr'-e. Metody opredelenija obshhej toksichnosti.
6. Denisova M. N., Rysmuhambetova G. E., Buharova E. N., Surovcova I. V., Karpunina L. V Izuchenie vlijanija jekzopolisaharida Xanthomonas campestris na organizm laboratornyh zhivotnyh //Biotehnologija: real'-nost'- i perspektivy
v sel'-skom hozjajstve: Mat. Mezhd. nauch. -prakt. konf. 28−29 janvarja 2013 g., Saratov, 2013. -pp. 184−185.
7. Ermol'-eva Z.V., Vajsberg G.E. Stimuljacija nespecificheskoj rezistentnosti organizma i bakterial'-nye polisaharidy. — M.: Medicina, 1976. — p. 184.
8. Zajchikova M.V., Berestovskaja Ju. Ju., Vasil'-eva L.V. Dissipotrofnye bakterii ksilotrofnogo soobshhestva v presnovodnyh jekosistemah //Aktual'-nye aspekty sovremennoj mikrobiologii: V Molodezhnaja shkola-konferencija s mezhdunarodnym uchastiem. — Moskva, 2009. — pp. 77−78.
9. Kesareva E.A., Denisenko V.N. Klinicheskaja interpretacija biohimicheskih pokazatelej syvorotki krovi sobak i koshek — M. :KolosS, 2011. — pp. 28.
10. Karpunina L.V., Mel'-nikova U. Ju., Suslova Ju.V., Muhacheva E.S., Ignatov V.V. Baktericidnye svojstva lektinov azotfiksirujushhih bacill //Mikrobiologija. — 2003. -T. 72, no. 3. -pp. 343−347.
11. Kichemazova N.V., Zhemerichkin D.A., Buharova E.N., Berestovskaja Ju. Ju., Vasil'-eva L.V., Karpunina L.V. // Himija i biohimija uglevodov: Mat. konf. IV Vserossijskaja shkola-konferencija. Saratov, 14−16 sentjabrja 2011. — Saratov: OOO «Rakurs», 2011. — pp. 60−61.
12. Merkulov G.A. Kurs patologogistologicheskoj tehniki. L.: Medgiz., 1956. — p. 263.
13. Rukovodstvo po medicinskoj mikrobiologii. Obshhaja sanitarnaja mikrobiologija. Kniga 1./ Pod red. A. S. Labinskoj. E. G. Volinoj. Moskva: BINOM. -2008.- p. 1080.
14. Arena A., Maugeri T.L., Pavone B., Iannello D., Gugliandolo C., Bisignano G. Antivirial and immunoregulatory effect of a novel exopolysaccharide from a marine thermotolerant Bacillus licheniformis // Int. Immunopharmacol. -2006. -V. 6. -pp. 8−13.
Рецензенты:
Швиденко И. Г., д.м.н., профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского». г. Саратов-
Тихомирова Е. И., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой экологии ФГОУ ВПО «Саратовский госудаственный технический университет имени Ю.А. Гагарина», г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 04. 06. 2014.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой