Биосенсорная детекция бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах для предупреждения их порчи

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 602. 3:579. 8
БИОСЕНСОРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИХ ПОРЧИ
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ"*
Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ"*
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ"*
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук** ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина"* ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора** ava@gabri. ru
432 017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1- тел.: 8(422)559547х e-maihfeokna@yandex. ru
Ключевые слова: Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium, Bacillus coagulans бактериофаги, детекция, биосенсоры, индикация, идентификация, молоко, молочные продукты, порча.
Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009−2013 годы (соглашение от № 8267 от 10. 08. 2012).
В статье представлены результаты исследований проб молока, искусственно кон-таминированных штаммами бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium в концентрации 103 КОЕ/мл, бактериологическим методом и методом РНФ с помощью сконструированных экспериментальных биопрепаратов на основе бациллярных бактериофагов. Установлено, что постановка РНФ при обнаружении данных бактерий показала значительную экономию времени (26 часов) в сравнении с бактериологическим методом исследования (96 часов), чувствительность которого не позволила обнаружить указанные бактерии в вышеназванной концентрации.
Введение
Одним из основных требований, предъявляемых к пищевым продуктам, является их безопасность для потребителя и стабильность состава. Основной причиной порчи продуктов и развития пищевых от-
равлений людей являются микроорганизмы. Особенно остро эта проблема касается портящихся продуктов — свежих фруктов, овощей, мясных и хлебобулочных изделий, соков, молочных продуктов [1,2].
Спорообразующие бактерии рода Bacillus (Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bac-ullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium, Bacillus coagulans) являются одним из этиологических факторов биологического разрушения продуктов питания, в том числе молока. Наличие у бацилл спор препятствует инактивации этих микроорганизмов после кратковременного термического воздействия, а выраженная их протеолитическая активность приводит к различным порокам.
Результаты исследований, полученные ВНИИМС, показали, что бактерии рода Bacullis активно развиваются при различных температурах хранения, изменяя орга-нолептические характеристики продукта. При размножении в диапазоне температур 28−370С бациллярные факультативные анаэробы придают молоку и молочным продуктам специфический вяжущий вкус, запах порченых фруктов, дрожжевой привкус, полынную и хинную горечь и изменяют цвет. Установлено, что в условиях холодильного хранения процессы порчи идут аналогично, но значительно медленнее [3,4]
Анализ нормативно-технической документации (ГОСТов и СанПиНов) свидетельствует о том, что в настоящее время для молочных продуктов споровые факультативно-анаэробные микроорганизмы, которыми являются бациллы, не являются санитарно-показательными, поэтому их наличие не нормируется и не подлежит обязательному контролю в условиях производственных лабораторий. Однако при появлении ряда характерных пороков вкуса и внешнего вида у молочных продуктов для бактериологического контроля рекомендуется делать посевы 2−4-кратно разведенного продукта на наличие указанной неспецифической микрофлоры [5,6].
Основным источником контаминации молока являются объекты окружающей среды, корма и воздуха. Доказано, что пастеризация не снижает уровень контаминации, а анаэробные условия и низкие температуры хранения задерживают, но не предотвращают развитие бактерий рода Bacillus [7].
При производстве ряда продуктов, в
технологическом процессе которых заложено концентрирование сухих веществ молока (сыры, сгущенные и сухие молочные продукты), происходит увеличение количества бактериальных клеток изучаемых споровых микроорганизмов за счет их концентрации. Для плавленых сыров и молокосодержащих продуктов, в рецептуре которых используются разнообразные молочные и немолочные компоненты и высокотемпературная обработка сырья (пастеризация или плавление), споровая микрофлора становится подавляющей. Так, в плавленых сырах ее количество может превышать 70% от общего количества микроорганизмов в продукте [8].
Своевременное качественное и количественное обнаружение этих микроорганизмов поможет предотвратить негативные процессы. Поэтому разработка методов детекции бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах является той практической задачей, которую необходимо решать в пищевой и перерабатывающей промышленности.
Использование для этих целей тест-систем ПЦР ограничено по нескольким причинам: отсутствие коммерческих прай-меров на многие виды рода Bacillus, дорогостоящие оборудование и расходные материалы, отсутствие квалифицированных специалистов [9]. Применение бактериологического метода исследований для этих целей затруднено в связи с отсутствием соответствующей современной нормативно-технической документации, позволяющей проводить идентификацию бацилл [10].
Цель и задачи исследования
Разработать метод биосенсорной детекции бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium с использованием фаговых биопрепаратов, который позволит в течение 25−26 часов определить бракеражную концентрацию вышеназванных бактерий (10 3 КОЕ/мл) в молоке-сырье [3].
Для достижения поставленной цели необходимо
— сконструировать экспериментальные биопрепараты на основе выделенных и се-
лекционированных специфических бактериофагов Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium-
— определить оптимальные параметры постановки реакции нарастания титра фага с экспериментальными биопрепаратами-
— разработать схему по постановки реакции нарастания титра фага с пробами молока с целью обнаружения разных видов бацилл.
Объекты и методы исследования
Штаммы бактерий Bacillus megaterium 182 и Bacillus megaterium 4, Bacillus mesentericus 66 и Bacillus mesentericus 2- Bacillus subtilis 26 и Bacillus subtilis 4, Bacillus mycoides 537 и Bacillus mycoides Н были полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветери-нарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Штаммы бактериофагов: Phagum Bacillus megaterium Bm — 10 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus megaterium Bm — 1 УГСХА-Деп- Phagum Bacillus subtilis Bs — 13 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus subtilis Bs — 16 УГСХА-Деп- Phagum Bacillus mycoides B. myc — 3 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus mycoides B. myc-5 УГСХА-Деп- Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm — 3 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm — 8 УГСХА-Деп, выделены и изучены нами.
Объекты исследования — пробы молока.
Метод биосенсорной детекции бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium с использованием фагового биопрепарата разрабатывали на основе методики реакции нарастания титра фага [11, 12]. Выделение и идентификацию бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium проводили по методике Gordon [13, 14]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows- «Stat Soft Ins. «, США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).
Результаты исследований
Первым этапом конструирования био-
1!
? & amp- ES SS «1

Si
р U ш Sa Hi H ¦ i
са s!
препаратов для биосенсорной детекции бактерий рода Bacillus нами был осуществлен подбор фагов, специфичных в пределах каждого вида (для Bacillus mycoides -Phagum Bacillus mycoides B. myc. серии УГСХА- для Bacullis subtilis — Phagum Bacullis subtilis B.s. серии УГСХА- для Bacillus mesentericus (pumilus) — Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm. серии УГСХА) — для Bacillus megaterium — Phagum Bacillus megaterium B. meg. серии УГСХА. Отобранные фаги характеризовались высокими показателями литической активности и максимально широким совместным спектром литического действия в пределах гомологичного вида [15, 16,17,18].
Экспериментальные биопрепараты готовили на основе коммерческого питательного бульона при температуре 37 °C.
В результате проведенных исследований нами было определено оптимальное соотношение бактериофага и индикаторной культуры — 1: 1, т. е. 0,2 мл фага и 0,2 мл индикаторной культуры (для фагов Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium), 1:5 (для фагов Bacillus mycoides), время пассажа составило 6−7 часов.
Очистку готовых фаговых препаратов от бактериальных клеток производили методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 |am GV). Разлитый во флаконы фаг подвергали контролю на чистоту, стерильность и литическую активность. Биопрепараты на основе фагов Bacillus представляют собой флаконы с прозрачной жидкостью желтого цвета (цвет засеянной среды) без посторонних примесей и наличия осадка. Литическая активность на плотных питательных средах составила 109 БОЕ/мл. Дата изготовления серии бактериофагов исчисляется со дня закупорки флаконов. Экспериментальным путем установлено, что срок годности биопрепаратов на основе бациллярных фагов при температуре 2−4 °С составляет 12 месяцев (срок наблюдения).
На втором этапе были проведены исследования по постановке реакции нарастания титра фага с МПБ, искусственно кон-
Таблица 1
Концентрация бактерий, определяемая в пробе молока при постановке РНФ на бактериофагах рода Bacillus серии УГСХА
Объект исследования — контамини-рованное бактериями рода Bacillus молоко в дозе (КОЕ, мл) Контроль индикаторного фага Контроль свободного фага Опыт Увеличение (раз)
Количество негативных колоний фага
Bacillus megaterium
103 39 ± 2 — 273 ± 14 7
102 39 ± 2 — 195± 8 5
101 39 ± 2 — 41 ± 6 1
Bacillus subtilis
103 24 ± 3,2 — 144 ± 12 6
102 24 ± 3,2 — 72 ± 5 3
101 24 ± 3,2 — 24 ± 9 1
Bacillus mycoides
103 56 ± 3,7 — 280 ± 11 5
102 56 ± 3,7 — 168 ± 6 3
101 56 ± 3,7 — 56 ± 7 1
Bacillus mesentericus (pumilus)
103 38 ± 4,4 — 228 ± 5 6
102 38 ± 4,4 — 152 ± 6 4
101 38 ± 4,4 — 76 ± 3 2
таминированными 18 часовыми индикаторными культурами бацилл каждого вида в концентрации 103 КОЕ/мл. В качестве контроля применяли стерильный МПБ. Для каждого бациллярного бактериофага в эксперименте использовали по три комплекта из 3 пробирок. В пробирки № 1 и № 2 вносили исследуемый материал (в данном случае это МПБ, контаминированный 18-часовой индикаторной культурой) объемом 9 мл. В пробирку № 3 вносили 9 мл стерильного МПБ. Затем в пробирки № 1 и № 3 добавляли по 1 мл бактериофага в концентрации 104 БОЕ/мл, в пробирку № 2 вносили 1 мл стерильного МПБ и помещали в термостат (37 0С) на 7 часов. После подращивания исследуемого материала вместе с бактериофагом из каждой пробирки брали по 0,25 мл и вносили в пробирки с 4,5 мл МПБ. Содержимое всех пробирок фильтровали и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев по Грациа.
В результате опытов нами установлено, что при положительной реакции количество бляшкообразующих единиц в опыте превышало более чем в 5 раз количество
бляшкообразующих единиц в контроле [19].
Время, затраченное на детекцию бацилл с помощью изготовленных фаговых препаратов, составило 26 часов (0,5 часа -подготовка реакции + 7 часов — время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа — время, затрачиваемое на постановку эксперимента + 18 часов — время термостатирования посевов).
Третьим этапом наших исследований стала разработка схемы постановки РНФ для биосенсорной детекции выше перечисленных бацилл с использованием фаговых биопрепаратов в молоке-сырье. Для постановки эксперимента было исследовано 3 пробы молока.
Первая проба молока была использована для определения концентрации бактерий рода Bacillus, которую возможно определить в молоке, используя РНФ с применением гомологичных бактериофагов. Пробу молока в объеме 10 мл вносили в колбу со МПБ (соотношение 1: 10) и искусственно контаминировали 18-часовым штаммом Bacillus каждого вида в концентрации 103 КОЕ/мл. Схема проведения эксперимента
Таблица 2
Результаты использования РНФ для детекции бацилл в пробах молока, искусственно контаминированного бактериями Bacillus разных видов в концентрации 103 КОЕ/мл
Количе- Количе- Результат
№ № фага ство не- ство не- Увеличе- Результат РНФ бактериологических
про бы гативных колоний в контроле гативных колоний в опыте ние титра фага, раз (время исследования 26 часов) исследований (время исследования 96 часов)
Bacillus megaterium
1 B. meg — 10 39 ± 2 280 ± 13 7,2 Положительный Отрицательный
B. meg — 1 43 ± 4 296 ± 9 6,9 Положительный при выявлении
2 B. meg — 10 39 ± 2 273 ± 11 7,0 Положительный концентрации 103
B. meg — 1 43 ± 4 233 ± 8 7,3 Положительный КОЕ/мл молока при
3 B. meg — 10 39 ± 2 288 ± 12 7,4 Положительный использовании схе-
B. meg — 1 43 ± 4 305 ± 6 7,1 Положительный мы Gordon (1973
Bacillus subtilis
1 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 166 ± 14 266 ± 9 6,9 7,0 Положительный Отрицательный при выявлении
2 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 151 ± 8 274 ± 11 6,3 7,2 Положительный концентрации 103 КОЕ/мл молока при
3 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 158 ± 6 277 ± 12 6,6 7,3 Положительный использовании схемы Gordon (1973
Bacillus mycoides
1 B. myc-3 56 ± 3,7 364 ± 12 6,5 Положительный Отрицательный
B. myc-5 39 ± 4,6 199 ±5 5,1 Положительный при выявлении
2 B. myc-3 56 ± 3,7 347 ± 11 6,2 Положительный концентрации 103
B. myc-5 39 ± 4,6 218 ± 9 5,6 Положительный КОЕ/мл молока при
3 B. myc-3 56 ± 3,7 367 ± 6 6,6 Положительный использовании схе-
B. myc-5 39 ± 4,6 230 ± 10 5,9 Положительный мы Gordon (1973
Bacillus mesentericus (pumilus)
1 Bm-3 36±1,4 245 ± 13 6,8 Положительный Отрицательный
Bm-8 22±2,3 156 ± 6 7,1 Положительный при выявлении
2 Bm-3 36±1,4 209 ± 11 5,8 Положительный концентрации 103
Bm-8 22±2,3 150 ± 9 6,8 Положительный КОЕ/мл молока при
3 Bm-3 36±1,4 241 ± 14 6,7 Положительный использовании схе-
Bm-8 22±2,3 141 ± 6 6,4 Положительный мы Gordon (1973
гов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи» (1993) (II) [20].
Результаты проведенных исследований по детекции бактерий рода Bacillus в искусственно контаминированных пробах молока свидетельствуют о том, что постановка РНФ для обнаружения данных бактерий показала значительную экономию времени (26 часов)
отражена на рис. 1. Результаты исследований представлены в табл. 1.
В табл. 2 приведены сравнительные результаты индикации бактерий рода Bacillus с применением специфических бактериофагов при применении бактериологического метода и метода РНФ.
На рис. 2 отражена схема ускоренной идентификации на примере бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофа-
Рис. 1 — Схема постановки реакции нарастания титра фага с использованием экспериментального биопрепарата на основе бактериофагов изучаемых видов бактерий рода Bacillus
в сравнении с бактериологическим методом исследования (96 часов), чувствительность которого не позволяет обнаружить бациллы всех
вышеперечисленных видов. Выводы
Исходя из выше изложенного и учиты-
1! Sa
es
«1

р ll
и Л
¦ ¦ 1 8|
¦¦¦ al
BS SS
I
II
Исследуемый материал
п=1= Прогревание в
течение 45 мин.
при 70°С
Подращивание в условиях термостата в течение 6 часов
при 37 °C ¦
Посев на чашки с МПА газоном
Исследуемый материал
5
Среда Гаузе№ 2 Среда Громыко
Фагоидентификация бактерий при помощи бактериофагов Bs-13 и Bs-16- Вс-4 и
Вс-8 серии УГСХА /
Выделение чистой культуры по методу Дригальского
I
Пересев на МПБ
J
ш о и га т
СО
}
го о го 3& quot-
Среда Кларка, 1% глюкозный агар, картофельный агар, МПБ с мочевиной, мясо-пептонный желатин, МПБ с яичным желтком, МПБ с нитратами в анаэростате
m о о га
положительным бактерии вида Bacillus subtilis Bacillus cereus
/
отрицательный
положительный бактерии вида Bacillus subtilis, Bacillus cereus
Итого: 25 часов Итого: 96 часов (4 суток)
Рис. 2 — Схема ускоренной идентификации бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи» (II)
вая результаты исследовании, полученных нами ранее, разработанный метод биосенсорной детекции Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus) с применением выделенных и селекционированных специфических в пределах вида бактериофагов, может быть с успехом использован на этапе приемочного контроля качества молока-сырья.
Библиографический список
1. Джей, Дж.М. Современная пищевая
микробиология / Дж. М. Джей, М. Дж. Лесснер, Д. А. Гольден. — М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2011. — 887 с.
2. Васильев, Д. А. Бактериофаги микроорганизмов, значимых для животных, растений и человека / Д. А. Васильев, Н. А. Феоктистова, А. И. Калдыркаев. — Ульяновск: УГСХА ООО «Колор-Принт», 2013. -226 с.
3. Свириденко, Г., Комарова Т. Споровые аэробы рода Bacillus -значимые микроорганизмы порчи для молочных продуктов // Продовольственный торгово-промышленный портал — режим доступа — URL: http: //www. produkt. by/ Journal.
4. Rasko, DA. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms / D.A. Rasko, M.R. Altherr, C.S. Han, J. Ravel // FEMS Microbiol Rev. — 2005. — № 29. — Р. 303−329.
5. Техэксперт (электронный фонд правовой и нормативно-технической документации) — режим доступа — URL: http: // docs. cntd. ru/document.
6. Законы России: справочник по законодательству — режим доступа — URL: http: // zakonrus. ru/gost.
7. Васильев, Д. А. Бактериофаги рода Bacillus / Д. А. Васильев, Н. А. Феоктистова, С. Н. Золотухин, А. В. Алешкин. — Ульяновск: УГСХА, 2013. — 78 с.
8. Портал Foodinnovation. ru — режим доступа — URL: http: //foodinnovation. ru/ news/prom_news/3621. html.
9. Феоктистова, Н. А. Роль Bacillus subtilis в обсеменении пищевых продуктов
отрицательный
и
SEIS es «1

Si
р U ш SS Hi н ¦ i
00 s!
/ Н. А. Феоктистова, А. И. Мустафин, Д. А. Васильев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК». -Москва, 2009. — Т.2. — С. 70−72.
10. Калдыркаев, А. И. Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма: автореф. дис. … канд. биол. наук / Калдыркаев Андрей Иванович.
— Саратов, 2013. — С. 17.
11. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. — М.: Научный мир, 2012. -636 с.
12. Юдина, М. А. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / М. А. Юдина, Н. А. Феоктистова, Д. А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
— 2012. — № 3 (19). — С. 69−73.
13. Васильев, Д. А. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипи-ческой характеристики / Д. А. Васильев, Н. А. Феоктистова, А. И. Калдыркаев. — Ульяновск, ООО «Колор-Принт», 2013. — 48 с.
14. Васильев, Д. А. Методы частной бактериологии / Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, С. Н. Золотухин. — Ульяновск: УГСХА, 2004. — 234 с.
15. Феоктистова, Н. А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus
mesentericus / Н. А. Феоктистова, А. И. Мустафин, Д. А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2011. — № 3 (15). — С. 61−68.
16. Феоктистова, Н. А. Биоиндикация бактерий Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н. А. Феоктистова, Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2013. — № 3 (23). — С. 43−49.
17. Феоктистова, Н. А. Методика выделения фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / Н. А. Феоктистова, А. И. Мустафин, Д. А. Васильев // Естественные и технические науки. — 2011. — № 2 (52). — С. 83−86.
18. Феоктистова, Н. А. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / Н. А. Феоктистова, А. И. Мустафин, А. И. Калдыркаев // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. -2011. — № 4(32). — С. 288−291.
19. Золотухин, С. Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дис. … докт. биол. наук: / Золотухин Сергей Николаевич. — Ульяновск, 2007. — С. 32.
20. Bergey'-s manual of determinative bacteriology. — Baltimore: Williams and Wilkins Co, — 1993. — 9th ed. — P. 1258.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой