Новые подходы к стандартизации плодов черники обыкновенной

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Химия растительного сырья. 2012. № 4. С. 1б7−173.
УДК 615. 32:547. 9+543. 544
НОВЫЕ ПОДХОДЫКСТАНДАРТИЗАЦИИ ПЛОДОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ
© В. А. Куркин, Т.К. Рязанова
Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара, 443 099 (Россия), e-mail: vakur@samaramail. ru
Разработаны методики качественного анализа и количественного определения антоцианов в плодах черники обыкновенной свежих (Vaccinium myrtillus L.) методом спектрофотометрии при аналитической длине волны 546 нм в пересчете на цианидин-3-глюкозид.
Ключевые слова: черника обыкновенная, Vaccinium myrtillus L., антоцианы, тонкослойная хроматография, спек-трофотометрия, стандартизация.
Введение
Воздушно-сухие плоды черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) используются в Российской Федерации в качестве вяжущего, противовоспалительного и противодиарейного средства [1−4]. Отвар из плодов черники с давних времен активно применяется при острых и хронических расстройствах желудочно-кишечного тракта, колитах, энтероколитах, дизентерии [1−4]. Вяжущее и антисептическое действие плодов обусловлено содержащимися в них конденсированными дубильными веществами на основе галло-катехина, эпикатехина, эпигаллокатехина [2, 3].
Однако в настоящее время возросший интерес к плодам R
вызван другой группой присутствующих в них соединений -антоцианами, гликозилированными формами антоцианидинов, представляющих собой производных 2-фенилбензопирилия [2].
Для этих соединений выявлена способность ускорять регенерацию родопсина, улучшать кровоснабжение глаза, предотвращать фотоиндуцированное повреждение сетчатки, улучшать функциональное состояние сетчатки глаза при миопии, диабетической ретинопатии [3, 4]. Данное фармакотерапевтическое действие антоцианов в основном обусловлено их антиокси-дантной активностью, более выраженной, чем у а-токоферола, аскорбиновой кислоты, Р-каротина, и сравнимой с коммерческими антиоксидантами — бутилгидроксиани-золом и бутилгидрокситолуолом [5]. В соответствии с этим в настоящее время плоды черники обыкновенной широко используются в производстве лекарственных средств («Стрикс», «Миртилене форте» и др.) и ряда биологически активных добавок [1, 4]. На фоне огромной популярности плодов черники обыкновенной, к сожалению, до сих пор не решены проблемы стандартизации сырья данного растения. В Российской
Федерации существует фармакопейная статья на вы-
Антоцианидины плодов черники
R
R
Цианидин
Дельфинидин
Мальвидин
ОН
ОН
ОСН3
Н
ОН
ОСН3
Куркин Владимир Александрович — заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, профессор, доктор фармацевтических наук, тел.: (84б) 2б0−33−59, e-mail: vakur@samaramail. ru Рязанова Татьяна Константиновна — студентка, e-mail: ryazantatyana@mail. ru
сушенные плоды черники обыкновенной [6], однако в ней отражены далеко не все показатели качества, предъявляемые в соответствии с ОСТ 91 500. 05. 100 «Стандарты качества лекарственных средств. Ос-
* Автор, с которым следует вести переписку.
новные положения» к фармакопейным статьям на лекарственное растительное сырье [7]. В частности, не нормируется содержание действующих веществ, а качественный анализ представлен пробирочными реакциями. В европейской фармакопее имеются отдельные монографии, посвященные свежим и воздушносухим плодам черники, регламентирующие содержание соответственно антоцианов и дубильных веществ [8], однако используемые в них методики анализа не лишены недостатков.
На наш взгляд, стандартизацию и воздушно-сухих, и свежих плодов черники обыкновенной целесообразно осуществлять по содержанию антоцианов. Это связано с тем обстоятельством, что антоцианы плодов черники являются по сравнению с дубильными веществами более лабильной группой биологически активных соединений, легко разрушающихся под действием света, высокой температуры, высоких значениях pH. Следовательно, уровень содержания антоцианов в плодах черники обыкновенной может быть надежным критерием подлинности качества и препаратов на его основе данного сырья.
По литературным данным, а также по результатам наших предварительных исследований, известно, что потери антоцианов при сушке могут достигать 50−60% [9]. В связи с этим целесообразно использовать в качестве исходного сырья в производстве препаратов свежие плоды черники обыкновенной. Возможно, отсутствие фармакопейной статьи на свежее сырье является одной из основных причин, по которой лекарственные средства на основе плодов черники на отечественном фармацевтическом рынке являются преимущественно препаратами зарубежного производства (из отечественных представлен только гомеопатический сироп «Миртикам»), несмотря на довольно обширный ареал черники обыкновенной в Российской Федерации (Республика Карелия, Ленинградская, Новгородская, Ивановская области и др.) [3].
В связи с этим актуальным является решение проблемы стандартизации плодов черники обыкновенной свежих в плане обоснования методик анализа, показателей качества и нормативной документации на данное сырье в форме фармакопейной статьи.
Цель настоящего исследования — разработка методик качественного анализа и количественного определения суммы антоцианов в свежих (быстрозамороженных) плодах черники обыкновенной.
Экспериментальная часть
Объектами исследования служили промышленные образцы воздушно-сухих плодов черники производства ООО ПКФ «Фитофарм» (Анапа, Краснодарский край), ЗАО «Иван-Чай» (Москва) и быстрозамороженные плоды черники (ЗАО «Хладокомбинат западный», Московская область, Одинцово, ТУ 9165−247 569 210−00).
В исследовании использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ), адсорбционной жидкостную колоночную хроматографию и метод спектроскопии в УФ и видимой области спектра. В методе ТСХ разделение проводили на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Регистрацию спектров осуществляли с помощью спектрофотометра «Specord 40″ (Analytik Jena) в диапазоне длин волн 190−700 нм.
На предварительном этапе было проведено исследование по определению оптимальной хроматографической системы для разделения антоцианов черники методом тонкослойной хроматографии. Были апробированы несколько систем растворителей: хлороформ — метанол — вода (26: 14: 3) — хлороформ -этанол — вода (26: 16: 3) — хлороформ — 0,1% спиртовой раствор НС1 — вода (26: 16: 3), 1% спиртовой раствор НС1- н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода 4: 1: 2 или 4: 1: 5 (верхняя фаза). В качестве оптимальной системы растворителей для хроматографического разделения антоцианов нами рекомендована смесь н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода 4: 1: 2- 4: 1: 5 (верхняя фаза). Детекцию веществ осуществляли в видимой области спектра и в УФ-свете (254 и 366 нм). На хроматограмме извлечения из плодов черники обыкновенной обнаруживаются пятна розового цвета с величиной Rf около 0,51 и 0,47 (предположительно, гликозиды мальвидина), фиолетового цвета с Rf 0,36 (предположительно, цианидин-3-глюкозид) и пятна синего цвета с Rf 0,20 и 0,33 (предположительно, гликозиды дельфинидина) (рис. 1). Результаты данных исследований свидетельствуют о целесообразности использования ТСХ в системе н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4: 1: 2) для идентификации плодов черники обыкновенной, имеющих характерный набор антоцианов (рис. 1).
С целью разработки методик анализа была проведена работа по выделению веществ антоциановой природы из плодов черники обыкновенной методом препаративной колоночной хроматографии на силикагеле Ь 40/100 и рехроматографии целевых фракций на полиамиде (& lt-^ое1т»). В качестве элюента использовались хлороформ, смеси хлороформа и метанола, содержащего 0,1% хлористоводородной кислоты в различных соотношениях. В результате выделены 3 доминирующих антоциана (с 0,51- 0,36 и 0,20 в системе н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода, 4: 1: 2). Сравнение их химических свойств показало, что вещество с 0,51 не изменяло свою окраску при добавлении раствора алюминия хлорида (характерно для производных мальвидина), что свидетельствует об отсутствии в молекуле орто-дигидроксигруппировки. В случае антоцианов с
0,36 и 0,20 при добавлении раствора алюминия хлорида вещества приобретали синий цвет, что свидетельствует о комплексооб-разовании (цианидин, дельфинидин).
Методом ТСХ показано, что соединение с 0,36 является одним из доминирующих антоцианов плодов черники обыкновенной. На основании данных УФ- и ЯМР-спектров данное соединение идентифицировано как цианидин-3-О-глюкозид.
Изучение электронных спектров показало, что кривые поглощения выделенных антоцианов имеют характерные максимумы при 281±2 нм и в видимой области в интервале 538±2 -551±2 нм (рис. 2). Для вещества с 0,51 максимум поглощения соответствовал 538±2 нм- для вещества с 0,36 — 546±2 нм-
т о
і
2 3
4
Рис. 1. ТСХ-анализ: система н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4: 1: 2). Обозначения: 1 — спиртовое извлечение из свежих плодов черники-
2 — мальвидин-3-О-глюкозид-
3 — цианидин-3-О-глюкозид-
4 — дельфинидин-3-О-глюкозид
веществу с 0,20 соответствовала длина волны при максимуме
поглощения 551±2 нм (рис. 2). Соотношение оптических плотностей в УФ-области и в видимой области спектра (А282/А546) для антоцианов и извлечения из свежих плодов черники составляет примерно 1: 1,51, 8 (рис. 2−4). Максимум поглощения извлечения из плодов черники, полученного настаиванием при температуре 8±2 °С (экстрагент — 95% спирт, содержащий 1% НС1), соответствовал веществу с И* 0,36 (546±2 нм), т. е. цианидин-3-О-глюкозиду (рис. 3). На наш взгляд, характерная кривая поглощения может быть использована для качественного анализа изучаемого растительного сырья (рис. 3).
Рис. 2. Спектры поглощения растворов дельфинидин-3-О-глюкозида (1), цианидин-3-О-глюкозида (2), мальвидин-3-О-глюкозида (3) в 95% этиловом спирте, содержащем 1% НС1, и раствора водноспиртового извлечения из свежих плодов черники (4)
Следует отметить, что кривые поглощения водно-спиртовых извлечений из высушенного и свежего сырья заметно различаются по соотношению оптических плотностей в максимумах поглощения в видимой (546±2 нм) и УФ-области спектра (281±2 нм) (А546/А282) (рис. 4). Для воздушно-сухих плодов это соотношение изменяется в пользу коротковолнового максимума и составляет 1,0: 0,100, 15 (рис. 3). Такое различие, по всей видимости, обусловлено изменением химического состава плодов черники после высушивания по принятой схеме (провяливание в течение 2−3 ч при температуре 35−40 °С, а затем досушивание при температуре 55−60 °С) в пользу полифенольных соединений в связи с разрушением антоцианов [10]. Следовательно, соотношение А546/А282 является важным показателем доброкачественности сырья и косвенно отображает химические процессы, происходящие в сырье при хранении и в процессе переработки.
Для целей стандартизации был определен удельный показатель поглощения цианидин-3-О-глюкозида в 1% растворе хлористоводородной кислоты в 95% этиловом спирте при аналитической длине волны 546 нм, который составил 100±4,3, что соответствует значению, указанному в одном из литературных источников [11]. Полученное значение удельного показателя поглощения было использовано при раз -работке методики количественного определения антоцианов в плодах черники. Сравнилась экстракционная способность спиртов различных концентраций, влияние pH, температуры, соотношения сырье: экстрагент и времени экстрагирования. Определено, что наибольший выход антоцианов из быстрозамороженных плодов черники наблюдается при использовании в качестве экстрагента 95% этилового спирта, содержащего 1% раствора хлористоводородной кислоты, соотношение сырье: экстрагент 1: 50- время экстракции 30 мин на кипящей водяной бане (табл. 1).
Рис. 3. Спектры поглощения в УФ и видимой области спектра водно-спиртовых извлечений из воздушно-сухого сырья плодов черники обыкновенной (1) и из свежих плодов черники обыкновенной (2)
250 300 350 400 450 500 550 600 650 М
АЬдаЬвпсв
Рис. 4. Спектры поглощения водно-спиртового извлечения из свежих плодов черники обыкновенной (1), воздушно-сухих плодов черники обыкновенной (2) и цианидин-3-О-глюкозида (3) в 95% этиловом спирте, содержащем 1% НС1
Таблица 1. Влияние различных факторов на полноту извлечения антоцианов из плодов черники обыкновенной
Концентрация этилового спирта, % Соотношение сырье: экстрагент Время экстракции, мин Содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в свежем сырье Примечание
Экстрагент
95 (1% НС1) 1: 50 120 2,32±0,26 настаивание при комнатной температуре
95 (0,1% НС1) 1: 50 30 2,39±0,18 нагрев на кипящей водяной бане
95 (1% НС1) 1: 50 30 4,05±0,18 ««
70 (1% НС1) 1: 50 30 3,43±0,17 ««
40 (1% НС1) 1: 50 30 3,48±0,15 ««
вода (1% НС1) 1: 50 30 2,85±0,18 ««
Время экстрагирования
95 (1% НС1) 1: 50 15 3,25±0,15 ««
95 (1% НС1) 1: 50 30 4,05±0,18 ««
95 (1% НС1) 1: 50 45 3,22±0,20 ««
95 (1% НС1) 1: 50 60 2,64±0,17 ««
95 (1% НС1) 1: 50 90 2,75±0,14 ««
Соотношение сырье: экстрагент
95 (1% НС1) 1: 30 30 3,76±0,17 ««
95 (1% НС1) 1: 50 30 4,05±0,18 ««
95 (1% НС1) 1: 100 30 4,15 ±0,20 ««
95 (1% НС1) 1: 150 30 4,05±0,10 ««
Методика качественного анализа антоцианов плодов черники обыкновенной. 2,0 г размороженных плодов черники помещают в коническую колбу со шлифом, добавляют 10 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты, закрывают пробкой и перемешивают 20 мин. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр марки «Красная полоса». На линию старта пластинки «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ», проведенную на расстоянии 1,5−2 см от нижнего края хроматографической пластинки, микропипеткой наносят 0,02 мл извлечения в виде пятна диаметром около 5 мм. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе, затем помещают в хроматографическую камеру, которую предварительно насыщают смесью растворителей н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4: 1: 2) в течение суток, и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 8 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в видимом свете. На хроматограмме обнаруживаются розовые пятна с величиной 0,47 и 0,51 (гликозиды мальвидина), фиолетового цвета с 0,36 (цианидин-3-глюкозид) и пятна синего цвета с 0,20 и 0,33 (гликозиды дельфинидина).
Спектр поглощения 5-кратного разведения полученного извлечения в области от 190 до 700 нм имеет характерные максимумы поглощения при 282 и 546 нм.
Методика количественного определения суммы антоцианов в плодах черники. Около 1 г (точная навеска) размороженных плодов черники помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент 95% этиловым спиртом, содержащим 1% хлористоводородной кислоты. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (марки «Красная лента»). 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят до метки 1% раствором хлористоводородной кислоты в 95% этиловом спирте. Оптическую плотность измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 546 нм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт.
Примечание: приготовление 1% раствора хлористоводородной кислоты в 95% спирте. 5,5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной (Государственная фармакопея Российской Федерации XII издания) доводят 95% этиловым спиртом до объема 200,0 мл.
Содержание суммы антоцианов в плодах черники свежих в процентах (X) в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид вычисляют по формуле
А¦25•50
X. ----------,
т -1 -100
где, А — оптическая плотность испытуемого раствора- т — масса сырья, г- 100 — удельный показатель поглощения выделенного антоциана.
Результаты статистической обработки проведенных опытов показывают, что ошибка единичного определения суммы антоцианов в плодах черники с доверительной вероятностью 95% составляет 4,54% (табл. 2).
Содержание антоцианов в исследуемых образцах плодов черники обыкновенной с использованием данной методики составило 3,80−4,10%.
Условия для извлечения антоцианов из свежих плодов черники обыкновенной отличаются от определенных нами оптимальных условий для извлечения антоцианов из воздушно-сухого сырья (60% спирт, содержащий 1% хлористоводородной кислоты- время извлечения 90 мин), что, возможно, связано с особенностями экстрагирования веществ из сухого и свежего сырья. В свежем сырье растительные клетки имеют мембраны (плазмолемма, тонопласт), обладающие избирательной проницаемостью. Эти мембраны препятствуют переходу низко- и высокомолекулярных веществ из клетки в окружающую среду. Поэтому процесс экстрагирования сводится к вымыванию веществ из разрушенных клеток. Разрушение клеток возможно обработкой крепкими спиртами. При высушивании клеточные мембраны теряют свою полупрони-цаемость, приобретают свойства пористой перегородки, в экстрагировании через эту перегородку основное значение приобретают процессы осмоса и диализа. В связи с этим основными требованиями к экстрагенту становятся способность хорошо смачивать материал, способность десорбировать и растворять биологически активные соединения, а также оптимальное значение поверхностного натяжения. Многоэтапность процесса извлечения антоцианов из высушенного сырья, возможно, также обусловливает большую длительность экстрагирования и установления равновесия.
Таблица 2. Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антоцианов
в свежих плодах черники обыкновенной
n f X S S2 P, % t (P, f) AX E, %
7 6 4,15 0,0767 0,588 95 2,45 0,18 4,54
Выводы
1. Из свежих плодов черники обыкновенной выделено доминирующее вещество антоциановой природы, идентифицированное на основании данных УФ- и ЯМР-спектров как цианидин-3-О-глюкозид.
2. Для качественного анализа плодов черники обыкновенной предложен метод тонкослойной хроматографии в системе н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4: 1: 2), а также характер кривой поглощения в УФ и видимой области (максимумы поглощения при 281±2 и 546±2 нм).
3. Разработана методика количественного определения антоцианов в плодах черники обыкновенной свежих методом прямой спектрофотометрии в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид при аналитической длине волны 546 нм. Содержание суммы антоцианов в сырье данного растения составляет 3,50−4,10%.
Список литературы
1. Государственный реестр лекарственных средств: в 2-х т. М., 2009. Т. 1. 1359 с.
2. Куркин В. А. Фармакогнозия. Самара, 2007. 1239 с.
3. Куркин В. А. Основы фитотерапии. Самара, 2009. 963 с.
4. Неумывакин И. П. Черника. На страже здоровья. СПб., 2008. 128 с.
5. Kowalczyk, E., Krzesinski P., Kura M., Szmigiel B., Blaszczyk J. Anthocyanins in medicine // Pol. J. Pharmacol. 2003. Vol. 55. Pp. 699−702.
6. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. М., 1990. 400 с.
7. ОСТ 91 500. 05. 001−00. Отраслевой стандарт. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения.
8. European Pharmacopoeia. 6-th Ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention. Inc., 2008. Pp. 738−739.
9. Lohachoompol V., Srzednicki G., Craske J. The Change of Total Anthocyanins in Blueberries and Their Antioxidant Ef-
fect after Drying and Freezing // J. Biomed. Biotechnol. 2004. N5. Pp. 248−252.
10. Правила сбора и сушки лекарственных растений: сборник инструкций. М., 1985. 328 с.
11. Francis F.J. Anthocyanins as food colors. Ed. by P. Makakis. London, 1982. Pp. 181−208.
Поступило в редакцию 13 июня 2011 г.
Kurkin V.A. *, Ryazanova T.K. NEW APPROACHES TO STANDARDIZATION OF FRESH FRUCTUS OF VACCINIUMMYRTILLUS L.
Samara State Medical University, st. Chapaevskaia, 89, Samara, 443 099 (Russia), e-mail: vakur@samaramail. ru There were developed the techniques of qualitative and quantitative analysis of fresh (fast-frozen) fructus of billberry (Vaccinium myrtillus L.).
Thin-layer chromatography (in the solvent system n-butanol — glacial acetic acid — water, 4: 1: 2- detection in the visible range) and UV/Visible spectroscopy (maximum of absorption at 281 ±2 nm and 546±2 nm) were proposed for the qualitative determination of anthocyanins in the fructus of billberry.
The method of quantitative determination of total anthocyanins in the fresh (fast-frozen) fructus of billberry by means of direct spectrophotometry (analytical wave-length at 546 nm) was developed. The contents of the total anthocyanins are varied with 3,50 to 4,10% (calculated on cyanidin-3-glucoside). The relative degree of the determination of the total anthocyanins in developed method with confidence probability 0,95 is no more than +4,54%.
Keywords: bilberry, Vaccinium myrtillus L., anthocyanins, thin-layer chromatography, spectrophotometry, standardization.
References
1. Gosudarstvennyi reestr lekarstvennykh sredstv. [State register of medicines]. Moscow, 2009, vol. 1, 1359 p. (in Russ.).
2. Kurkin V.A. Farmakognoziia. [Pharmacognosy]. Samara, 2007, 1239 p. (in Russ.).
3. Kurkin V.A. Osnovy fitoterapii. [Fundamentals of herbal medicine.]. Samara, 2009, 963 p. (in Russ.).
4. Neumyvakin I.P. Chernika. Na strazhe zdorov'-ia. [Blueberries. On guard health]. St. Petersburg, 2008, 128 p. (in Russ.).
5. Kowalczyk, E., Krzesinski P., Kura M., Szmigiel B., Blaszczyk J. Pol. J. Pharmacol., 2003, vol. 55, pp. 699−702.
6. Gosudarstvennaia farmakopeia SSSR: Vyp. 2. Obshchie metody analiza. Lekarstvennoe rastitel'-noe syr'-e. 11-e izd. [State Pharmacopoeia of the USSR: Vol. 2. Common methods of analysis. Herbal drugs. 11th ed.]. Moscow, 1990, 400 p. (in Russ.)
7. OST 91 500. 05. 001−00. Otraslevoi standart. Standarty kachestva lekarstvennykh sredstv. Osnovnye polozheniia. [OST 91 500. 05. 001−00. Industry standard. Standards of quality medicines. The main provisions. ]
8. European Pharmacopoeia. 6-th Ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention. Inc., 2008. Pp. 738−739.
9. Lohachoompol V., Srzednicki G., Craske J. J. Biomed. Biotechnol., 2004, no. 5, pp. 248−252.
10. Pravila sbora i sushki lekarstvennykh rastenii (sbornik instruktsii). [The collection and drying of herbs (a collection of instructions)]. Moscow, 1985, 328 p. (in Russ.).
11. Francis F.J. Anthocyanins as food colors. Ed. by P. Makakis. London, 1982. Pp. 181−208.
Received June 13, 2011
* Corresponding author.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой