Деструкция хитозана в растворе под действием фермента гиалуронидазы

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 541. 64:536
ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНА В РАСТВОРЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТА
ГИАЛУРОНИДАЗЫ
© В. В. Чернова1, В. П. Володина2, Е. И. Кулиш1*, С. В. Колесов1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450 074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел.: +7 (340) 273 66 08.
2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450 054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Е-mail: alenakulish@rambler. ш
Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции хитозана в растворах уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза. Оценено влияние концентрации хитозана, концентрации фермента и концентрации уксусной кислоты в растворе, а также температуры процесса на степень ферментативного разложения хитозана в растворе. По степени падения молекулярных масс в ходе деструкции предполагается, что неспецифический фермент гиалуронидаза разрушает основную цепь хитозана.
Ключевые слова: хитозан, фермент, деструкция, молекулярная масса.
Уникальные свойства получаемого из возобновляемого природного сырья природного полисахарида хитозана (ХТ) — его совместимость с тканями человека, биоинертность и бактериостатич-ность, влагопроницаемость и другие свойства -делают его полимером, пригодным для использования в медицинских целях [1, 2]. Среди многочисленных достоинств ХТ — его биоразрушаемость до обычных для организма веществ. Это определяет возможность использования данного полимера при создании биодеградируемых полимерных носителей в виде пленок, например, в терапии ожоговых ран [3−5]. В условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (в том числе ферментов, присутствующих на коже — коллагеназы, гиалуронидазы и др.). В связи с этим рассмотрение факта деструктирующего влияния на ХТ неспецифических ферментов представляется важной задачей как с научной, так и с практической точек зрения.
В качестве объектов исследования был выбран образец ХТ (ТУ 6−09−05−296−76, фирма «Химмед» Россия), полученный щелочным дезацетилировани-ем крабового хитина (степень деацетилирования ~75% с Мп=120 000), и ферментный препарат гиалуронидаза (ГУП «Иммунопрепарат», Уфа). Растворы Х Т готовили перемешиванием в течение 810 часов при комнатной температуре. В качестве растворителя была использована уксусная кислота концентрацией 1, 5 и 10 г/дл. Ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом количестве воды, вносили в раствор ХТ непосредственно перед началом изучения процесса деструкции. Температура проведения процесса составляла 25, 35 и 40 °C. Глубину деструктивного превращения ХТ в растворе оценивали по падению относительной вязкости раствора ХТ в присутствии фермента Д'-Л по отношению к относительной вязкости исходного раствора ХТо, (в %). Значение относительной вязкости раствора фермента составляло
менее 1% от вязкости раствора ХТ, и его вклад в значения вязкости раствора не учитывался. Характеристическую вязкость ХТ определяли вискози-метрически в буферном растворе, состоящем из 0.3 м. уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия, согласно стандартной методике [6]. Ошибка эксперимента составляла не более 5%.
Фермент гиалуронидаза катализирует реакции гидролитического расщепления и деполимеризации основного компонента соединительной ткани — гиа-луроновой кислоты [7]. Гиалуроновые кислоты представляют собой высокомолекулярные линейные биополимеры, молекулы которых построены из чередующихся остатков Б-глюкуроновой кислоты и N ацетил-Б-гликозамина, соединенных р-(1-& gt-4) — и р-(1−3)-связями (рис. 1. а). ХТ является аминополиса-харидом, т. е. веществом с близкой к гиалуроновой кислоте химической структурой (рис. 1. б), и, как оказалось, под действием гиалуронидазы в нем также протекает процесс ферментативного разложения.
Как показали вискозиметрические исследования, выдержка растворов ХТ в присутствии фермента в течение 26 часов сопровождается постепенным уменьшением относительной вязкости раствора, что свидетельствует о протекании процесса деструкции. Однако как видно из рис. 2, для того, чтобы процесс деструкции стал ощутим, требуются весьма существенные количества фермента. Наличие фермента в растворе порядка 0. 1−0. 5% масс. по отношению к ХТ не вызывает заметного уменьшения относительной вязкости раствора. Ощутимым процесс деструкции становится только лишь при содержании фермента & gt-1% масс.
В общем случае степень деструктивного превращения ХТ от содержания фермента в растворе зависит нелинейным образом (рис. 3).
Влияние концентрации ХТ в растворе на степень его ферментативного превращения имеет характер экстремальной зависимости между степенью падения относительной вязкости и его содержанием в растворе (рис. 4).
* автор, ответственный за переписку
Рис. 1. Фрагмент цепи гиалуроновой кислоты (а) и хитозана (б).
Лт)
^0
Рис. 2. Изменение вязкости раствора хитозана от времени выдержки с ферментом. Концентрация хитозана в растворе -2 г/дл. Концентрация уксусной кислоты в растворе — 1 г/дл. Соотношение фермент: ХТ в растворе 0. 5: 99.5 (1), 1: 99 (2), 5: 95 (3) и 10: 90 (4). Температура процесса 25 °C.
Данный характер зависимости может быть объяснен, если учесть тот факт, что область концентраций ХТ порядка 0. 35−0.4 г/дл соответствует области кроссовера, т. е. области перехода полимера из разбавленного раствора к раствору полуразбав-ленному. Несмотря на небольшую количественную разницу в значениях содержания ХТ в растворе до и после точки кроссовера, качественно надмолеку-
лярная структура полимера в разных концентрационных режимах принципиально различна [8]. В области разбавленного раствора надмолекулярная структура раствора представляет собой изолированные набухшие макромолекулярные клубки ХТ, доступность звеньев которых для взаимодействия с ферментом высока.
Дг|
1: 99 5: 95 10: 90
соотношение фермент: ХТ
Рис. 3. Изменение вязкости раствора хитозана от содержания в растворе фермента. Концентрация уксусной кислоты в растворе — 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с ферментом — 3 часа. Содержание хитозана в растворе 0.2 г/дл (1), 0.3 г /дл (2), 0.4 г /дл (3), 0.7 г /дл (4), 1.0 г/дл (5) и 2.0 г/дл (6). Температура процесса 25° С.
Лг|
0.2 0.6 10 2. 0
в растворе, г/дл
Рис. 4. Изменение вязкости раствора хитозана от его содержания в растворе. Концентрация уксусной кислоты в растворе — 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с ферментом — 3 часа. Соотношение фермент: ХТ 1: 99 (1), 5: 95(2), 10: 90 (3). Температура процесса 25° С.
При переходе к полуразбавленному режиму раствор представлен перекрывающимися между собой агрегатами макромолекул, создающими определенные диффузионные затруднения для взаимодействующего с ними фермента. Очевидно, что доступность звеньев полимера для взаимодействия с ферментом с переходом к полуразбавленному раствору уменьшается, что, вероятно, и сопровождается уменьшением степени деструкции ХТ в растворе.
Повышение температуры проведения реакции ферментативной деструкции ХТ приводит к увеличению степени ферментативного разложения (рис. 5), на котором сказывается, однако, изменение концентрации используемой в качестве растворителя уксусной кислоты.
По всей вероятности для растворов уксусной кислоты каждой концентрации имеется свой температурный оптимум, соответствующий максимальной степени
деструкции ХТ. Соответственно и для каждой температуры процесса имеется определенная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающая наибольшую глубину превращения ХТ. Например, при 25° С максимальной степени деструкции ХТ соответствует концентрация уксусной кислоты в растворе равная 5 г/дл (рис. 6).
Очевидно, что наблюдаемые закономерности измерения относительной вязкости отражают объективно проходящие в растворе ХТ процессы ферментативного разложения полимера.
Изменения молекулярной массы ХТ в ходе деструкции рассчитаны по уравнению Марка-Куна-Хаувинка для ХТ в буферном растворе [9, 10] (табл.).
Как видно из представленных данных, в ряде случаев степень деструкции весьма значительна — молекулярная масса ХТ падает практически в 2 раза. Кроме этого, можно отметить, что с увеличением температуры происходит существенное нивелирование различия в степенях деструкции для растворов ХТ, отличающихся кислотностью среды. Как видно из данных табл., при температуре деструкции равной 45° С степень падения молекулярной массы практически одинакова для растворов ХТ в 1 и 10%-ной кислоте, в то время как при 25° С разница весьма существенна (на 6800 и 37 000 соответственно).
Таблица
Характеристики образцов хитозана, выделенных из 2%-ного раствора хитозана в уксусной кислоте (Время выдержки с ферментом -3 часа. Соотношение фермент: ХЗ — 10: 90)
Т, О о [СН3СООН], Изменение в ходе
г/дл Д[Г|] ДМ
1 0. 25 6800
25
10 1. 05 37 000
1 1. 45 53 000
35
10 0. 80 27 000
1 0. 85 29 000
45
10 0. 70 23 000
Рис. 5. Изменение вязкости раствора 2%-ного хитозана от температуры. Концентрация уксусной кислоты в растворе — 1 г/дл (а) и 10 г/дл (б). Выдержка раствора хитозана с ферментом — 3 часа. Соотношение фермент: ХТ 1: 99 (1), 5: 95(2) и 10: 90 (3).
Рис. 6. Изменение вязкости 2%-ного раствора хитозана от кислотности среды. Выдержка раствора хитозана с ферментом — 3 часа. Соотношение фермент: ХТ 1: 99 (1), 5: 95 (2) и 10: 90 (3). Температура 25° С.
Выводы
1. Обнаружен факт протекания ферментативной деструкции хитозана в растворе уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза.
2. Определено влияние на степень ферментативного разложения:
а) концентрации хитозана в растворе — в интервале концентраций 0. 2−2% масс. наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости с максимумом в области точки кроссовера-
б) концентрации фермента в растворе — в интервале концентраций 0. 1−10% масс. как общая тенденция
наблюдается уменьшение степени влияния фермента на процесс деструкции хитозана-
в) концентрации уксусной кислоты в растворе -при температуре 25° С в интервале рН равных от 2. 71 до 2. 21 наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости с максимумом в области рН = 2. 36 (соответствующей 5%-ной кислоте).
3. По степени падения молекулярных масс в ходе деструкции можно предположить, что неспецифические ферменты разрушают основную цепь хитозана.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Республики Башкортостан (грант
р_поволжье_а № 08−03−97 030).
ЛИТЕРАТУРА
1. Muzzarelli R. A. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977.
2. Марквичева Е. А. // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 315−326.
3. Гальбрайх Л. С. // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 1.С. 51
4. Сливкин А. И., Лапенко В. Л., Арзамасцев А. П., Болгов А. А. // Вестник ВГУ. 2005. Серия: Химия. Биология. Фармация. № 2. С. 73−87.
5. Ильина А. В., Варламов В. П. // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 79−90.
6. Рафиков С. Р., Будтов В. П., Монаков Ю. Б. Введение в физи-ко-химию растворов полимеров. М.: Наука, 1978. -328 с.
7. Meyer K. Hyaluronidases // The Enzimes. NY: Academic Press, 1971. V. 5, P. 307−320.
8. Кулиш Е. И., Володина В. П., Фаткуллина Р. Р., Колесов С. В., Заиков Г. Е. // Высокомолек. соед. 2008. Серия Б. Т. 50. № 7. С. 1277−1280.
9. Агеев Е. П., Вихорева Г. А., Матушкина Н. Н., Пчелко О. М., Гальбрайх Л. С. // Высокомолек. соед. 2000. Серия А. Т. 42. № 2. С. 333−339.
10. Гамзадзе А. И., Шлимак В. М., Скляр А. М // Aota Poly-merica. 1985. Вd. 36. № 8. S. 420.
Поступила в редакцию 28. I0. 2008 г.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой