Исследования толерогенных дендритных клеток новорожденных и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
Эпидемиология
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 611. 018. 83:612. 017. 1
ИССЛЕДОВАНИЯ ТОЛЕРОГЕННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ И ВЗРОСЛЫХ В МОДЕЛЯХ ИММУННОГО ОТВЕТА IN VITRO
М. Э. Цатуров, А. В. Матвеичев, М. В. Плеханова, И. Е. Заиченко,
О. Н. Бабайкина, М. А. Ломунова, В. Ю. Талаев,
^ ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»
Цатуров Максим Эдуардович — e-mail: tsme@yandex. ru
Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентируюшими клетками иммунной системы, выполняющие две важные функции — индукция Т-клеточного иммунного ответа и толерантности. Степень зрелости дендритных клеток зависит от условий культивирования и микроокружения. В данной работе нами исследовались свойства толерогенных ДК, полученных из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых. Нами показано, что полученные ДК новорожденных обладают рядом особенностей, отличающих их от ДК взрослых.
Ключевые слова: толерантность, толерогенные дендритные клетки, дексаметазон, молекулы костимуляции, ИЛ-10.
Dendritic cells (DC), professional antigenpresenting cells of the immune system, exert important functions both in induction of T cell immunity, as well as tolerance. DC maturation depends from condition of cultivation and microenvironment. In this study we research features of monocyte-derived tolerogenic DC of neonates and adults that made with dexametasone and interleukin-10. It was shown that tolerogenic DC of neonates possess some interesting property.
Key words: tolerance, tolerogenic DC, dexametasone, co-stimulatory molecules, IL-10.
Э п и де м и о ло ги я
Введение
Функционирование иммунной системы в ходе иммунного ответа и вне его находится под контролем многих молекулярных и клеточных систем. Эти системы призваны обеспечить оптимальный запуск и протекание реакции на антиген и при этом, не дать перейти этому процессу в русло различных системных отклонений, результатом которых может стать развитие аутоиммунной агрессии к собственным клеткам и тканям [1]. Центральную роль в инициации первичного иммунного ответа играют дендритные клетки (ДК) — наиболее активные и высокоспециализированные антигенпрезен-тирующие клетки организма [2, 3]. Кроме инициации иммунных реакций немаловажной является роль ДК в обеспечении толерантности к собственным антигенам и поддержания гомеостаза иммунокомпетентных клеток.
Исследования механизмов контроля процессов созревания ДК при различных условиях культивирования необходимы как для последовательного понимания отклонений в работе иммунной системы человека, так и для разработки способов лечения иммунопатологии. В частности, изучение механизмов выработки толерогенных свойств позволяет оценить возможность применения ДК с модулированными в ходе созревания свойствами при решении ряда проблем, возникающих в клинической практике при лечении аутоиммунных заболеваний и предотвращении отторжения трансплантированных органов.
Известно, что процессы иммунного ответа и подержания клеточного гомеостаза лимфоцитов в раннем постнатальном периоде существенно отличаются от аналогичных процессов у взрослых. В этой связи, особенно интересным аспектом исследования функциональной значимости ДК является изучение последних на ранних этапах развития, т. е. с позиций онтогенетической зрелости иммунной системы [4].
Целью данного исследования явилось изучение индуцированных толерогенных свойств дендритных клеток новорожденных детей и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro.
Материалы и методы
Дендритные клетки получали из моноцитов пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных и венозной крови здоровых доноров. Из проб стерильной гепаринизи-рованной крови выделяли мононуклеарные клетки над
слоем Hystopaque-1077 (Sigma, USA), клетки отмывали средой DME (Sigma, USA) и готовили суспензию клеток с концентрацией 3,5 — Б^Ю6 клеток/мл на среде DME с 10%
эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт Петербург). Клетки засевали в 24-луночные планшеты (Costar, USA) и инкубировали 3 часа при +37°С и 5% СО2. Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно смывали с поверхности пластика тремя порциями среды DME, в лунки с моноцитами вносили среду DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамином, р-меркаптоэтанолом и пируватом натрия. С помощью микроскопии контролировали чистоту удаления неадгезировавшихся клеток и плотность засева моноцитов. Для индукции созревания дендритных клеток в лунки добавляли рекомбинантный ГМ-КСФ (100 нг/мл, Biosource, USA) вместе с ИЛ-4 (20 нг/мл, Sigma, USA). В отдельные лунки с указанными выше стимуляторами вносили натриевую соль фосфата дексаметазона (0,4 мкг/мл, KRKA, Slovenia), рекомбинантный человеческий ИЛ-10
(100 нг/мл) (Biosource, USA). Моноциты, росшие без всех цитокинов и дексаметазона, использовались в качестве контроля. Клетки инкубировали в течение 3 и 8 суток при +37оС и 5% СО2. Затем из культур отбирали среду для определения содержания цитокинов. В культурах клеток меняли среду DME на новую, также с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамином, пируватом натрия и р-меркаптоэтанолом.
В среду с незрелыми обычными и модулированными ДК добавлялись активаторы терминального созревания липо-полисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, Отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Тарасевича, Москва), рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли, а (ФНОа) (10 нг/мл, Sigma, USA), растворимая форма рекомбинантной молекулы CD40L (Biosource, USA). Клетки с активаторами инкубировали еще одни сутки. Функциональные свойства модулированных дендритных клеток определяли по их способности стимулировать продукцию ИФН7 и пролиферацию у аллогенных лимфоцитов взрослых здоровых доноров. Пролиферацию оценивали по включению меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт Петербург), который добавляли в лунки по 0,5 мкКюри через 3 суток после начала культивирования второго этапа стимуляции на срок 24 ч. Лунки без добавления моноцитов и дендритных клеток использовались в качестве контрольных. Каждый вариант микрокультуры засевался в трех повторах. После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры (Titertek, USA) и анализировали с помощью р-сцинцилляционного счетчика СБС-2. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп. /мин.). Среду из культур кле- ^ ток собирали для определения содержания в ней ИФН-7 с помощью иммуноферментных тест-систем «ИФА-ИФН7» (Вектор-Бест, Новосибирск).
Для исследования экспрессии мембранных маркеров использовали моноклональные антитела к молекулам HLA-DR, СD14 (Сорбент, Москва), CD83 и CD86 (Caltag, USA), меченные ФИТЦ или фикоэритрином. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлюориметре FacsCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA) в режиме двухцветной цитометрии. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения CellQuest и WinMDI 2.8. Оценивался процент несущих маркер клеток и яркость свечения окрашенных клеток — геометрическая средняя пика окрашенных клеток (показатель GMean).
Результаты и их обсуждение
В ходе работы изучались особенности созревания ДК новорожденных и взрослых в зависимости от изменения условий культивирования, а также исследовались функцио- ^ нальные свойства полученных клеток в моделях межклеточного взаимодействия in vitro. В качестве модуляторов созревания использовались агенты, обладающие выраженными иммуносупрессорными свойствами — интерлейкин-10 и дек-саметазон, синтетический аналог глюкокортикоидов.
В ходе работы были выявлены статистически значимые отличия между фенотипическими и функциональными свойствами ДК, полученным из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Показана различная динамика экспрессии функционально значимых маркеров у дендритных клеток
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
Э п и де м и о логи я
ivk
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
новорожденных и взрослых. Молекула СЭ14 — моноцитар-ный маркер, сохраняется на большей части дендритных клеток новорожденных на ранних этапах культивирования. К восьмым суткам количество СЭ14+ ДК новорожденных снижается и достигает уровня взрослых. Количество СЭ86+ ДК новорожденных в культурах, напротив, с течением времени снижается (рис. 1).
вание Т-лимфоцитов, особенно Т-хелперов первого типа [5, 6]. Дефицит продукции ИЛ-10 незрелыми ДК новорожденных
может являться одним из факторов, создающих основу процесса развертывания периферического отдела иммунной системы — бурной поликлональной посттимической пролиферации Т-клеток, регистрируемой в раннем детском возрасте [4].
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
щ
A-DR CD14 CD86 ФНО
ШМЖ С014 С086 ни^ С014 С086
ФНО ЛПС
¦ДК оДК-ДЕКС ?ДК-ИЛ-10
РИС. 1.
Фенотип Д К новорожденных и взрослых.
Верхний ряд диаграмм — сравнение фенотипа обычных ДК взрослых и детей при культивировании в течение 3 (серые диаграммы) и 8 суток (черные диаграммы).
Нижняя диаграмма — количество обычных ДК и ДК, модулированных в ходе созревания дексаметазоном и ИЛ-10 (представлен фенотип ДК новорожденных детей).? — статистически достоверные отличия фенотипа трехсуточных ДК от восьмисуточных, * - отличие модулированных ДК от обычных. Достоверность результатов при р& lt-0,05 в парных и непарных т-тестах.
При действии модулирующих агентов на созревание ДК новорожденных и взрослых происходит значительная перестройка мембранного репертуара функциональных молекул. На рисунке 1 представлен фенотип модулированных и обычных ДК новорожденных. Как при активации ФНОа, так и ЛПС, культуры ДК, обработанные дексаметазоном, характеризуются резким увеличением содержания СЭ14+ клеток и снижением количества СЭ86+ клеток. Проявление супрессорной активности ИЛ-10 по отношению к молекулам кости-муляции выявило неожиданные результаты. Установлено, что при активации ЛПС, количество СЭ86-позитивных клеток в культуре ДК, обработанных ИЛ-10, выше, чем в культурах обычных ДК.
Также выявлены различия в продукции цитокинов дендритными клетками в зависимости от стадии созревания и условий культивирования. Показан сложный характер влияния синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровень продукции интерлейкина-10 дендритными клетками.
Модуляция свойств ДК веществами с иммуносупрессор-ными свойствами приводит к колоссальным изменениям в морфологии, фенотипе и функции получаемых ДК. Эти изменения ярко выражены уже на начальных этапах созревания моноцитов в дендритные клетки и выявляются в трехсуточной системе культивирования. Наиболее существенные отличия дендритных клеток новорожденных и взрослых проявляются в продукции дендритными клетками ИЛ-10. Незрелые трехсуточные ДК взрослых продуцируют значительные количества ИЛ-10, при этом наибольшая концентрация этого цитокина обнаруживалась в двухсуточных культурах незрелых ДК (рис. 2). В то же время, моноциты и незрелые ДК новорожденных оказались чрезвычайно слабыми продуцентами ИЛ-10. Как известно, ИЛ-10 является фактором, сдерживающим пролиферацию и функциониро-
600
— 500
Ё400
CD14 CD86 2 с к
ЛПС ^СК'-
Взрослые
л
3 с.к. без 3 с.к. ФНО 3 c.K. sCD40L 3 с.к. ЛПС 3 с.к. смесь стимула стимуляторов
? Моноциты нДК оДК-ДЕКС
600
500
400
300
200
100
0
РИС. 2.
Новорожденные дети




1
rfl ^ J J
2 с.к. 3 с.к. без 3 с.к. ФНО 3 c. ksCD40L 3 с.к. ЛПС 3 с.к. смесь стимула стимуляторов
? Моноциты ¦ ДК? ДК-ДЕКС
Продукция ИЛ-10 моноцитами и дендритными клетками взрослых и новорожденных детей в течение 2 и 3 суток культивирования.
ДК — обычные дендритные клетки, культивировавшиеся в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ДК-ДЕКС — дендритные клетки, культивировавшиеся в присутствии ИЛ-4, ГМ-КСФ и дексаметазона. Значимые различия показателей детей и взрослых обозначены — ¦ (при p& lt-0,05 в непарном т-тесте) — отличия ДК от нестимулированных моноцитов — ?- достоверный эффект действия дексаметазона — О (р& lt-0,05 в парном т-тесте).
Выводы
1. Дендритные клетки, полученные из моноцитов пуповинной крови новорожденных обладают рядом отличительных черт при сравнении с дендритными клетками, полученными из моноцитов венозной крови взрослых доноров. Фенотипическое созревание ДК новорожденных характеризуется медленной утратой моноцитарного маркера CD14 и нестойкой экспрессией костимуляторной молекулы CD86.
2. Действие ИЛ-10 на дендритные клетки новорожденных при созревании приводит к повышению уровня экспрессии CD86.
3. Незрелые дендритные клетки новорожденных в отли-
чие от ДК взрослых слабо продуцируют ИЛ-10. Модулирование дексаметазоном ДК новорожденных после активации резко увеличивают продукцию ИЛ-10 уже в трехсуточных культурах. [р
ЛИТЕРАТУРА
1. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. № 27 (6). С. 368−378.
2. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2002. № 20. Р. 621−667.
Эпидемиология
3. Hart J.P., Michael D. Gunn and Salvatore V. Pizzo A CD91-Positive Subset of CD11c+ Blood Dendritic Cells: Characterization of the APC that Functions to Enhance Adaptive Immune Responses against CD91-Targeted Antigens. The Journal of Immunology. 2004. № 172. P. 70−78.
4. Schonland S.O., Zimmer J.K., Lopez-Benitez C. M., Widmann T. et al. Homeostatic control of T-cell generation in neonates. Blood. 2003. № 102. P. 1428−1434.
5. Steinman R.M. Some interfaces of dendritic cell biology. APMIS. 2003. № 111 (7−8). P. 675−97.
6. Suciu-Foca N., Manavalan, J. S., Scotto, L. et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells//Int. Immunopharmacol. 2005. № 5. P. 7−11.
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой