ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕЧЕНОЧНОГО СОСАЛЬЩИКА FASCIOLA HEPATICA НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ТУБУЛИНА-?2 (TUBB2)

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 619: 616. 995. 122. 21:1−07
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕЧЕНОЧНОГО СОСАЛЬЩИКА Fasciola hepatica НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ТУБУЛИНА-02 (tubb2)
А.С. ГУЛЯЕВ аспирант
Институт биологии гена РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина
B.А. ВАСИЛЬЕВ кандидат биологических наук Институт биологии гена РАН
Н.Ю. ФИЛИМОНОВ Санкт-Петербургский Государственный Университет
C.К. СЕМЕНОВА кандидат биологических наук
Институт биологии гена РАН
И.А. АРХИПОВ доктор ветеринарных наук Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К. И. Скрябина, 117 218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, e-mail: vi2is@ncport. ru
Впервые изучена структура гена тубулина-02 (tubb2) Fasciola hepatica, продукт которого, возможно, является основной мишенью действия бензимидазо-лов. Показана возможность использования этого гена для дифференциации географических популяций F. hepatica из России и Великобритании. Обсуждаются причины возникновения мутационных изменений в кодирующих участках гена и связь наблюдаемого полиморфизма с действием антигельминтных препаратов.
Ключевые слова: Fasciola hepatica, ген тубулина, полиморфизм, мутация, дендрограмма, дифференциация.
Фасциолез — один из опасных гельминтозов животных и человека. Он широко распространен в нашей стране и в мире. Инвазированность животных фасциолами в отдельных регионах России достигает 50−80% [2]. До 17 млн человек по всему миру заражено фасциолами и еще 250 млн находятся под угрозой заражения [17]. Фасциолы, паразитируя в печени, вызывают тяжелые патологические изменения и, особенно, в период острого течения болезни. Средняя экстенсивность инвазии крупного рогатого скота по стране составляет 18,6%, потери молока на одну зараженную корову в год — 320 кг или 16,6%, прирост массы тела больного молодняка снижается на 27 кг (на 14,3%). Кроме того, ущерб складывается из утилизации пораженной печени и гибели животных, особенно овец [1]. Глобальные потери сельского хозяйства от фасциолеза оценивают в 3 мрд долларов [3].
Для лечения фасциолеза во всем мире используют различные препараты, в том числе производные бензимидазолов (альбендазол и триклабендазол). Механизм действия бензимидазолов заключается в связывании препарата с микротрубочками, образованными двумя субъединицами тубулина (а и в), что приводит к их диссоциации и последующему нарушению веретена деления, изменения клеточной секреции и движения [5, 15]. Показано, что в тече-
ние нескольких десятилетий их широкого применения в ряде стран появились штаммы гельминтов, устойчивые к действию данных препаратов [7, 10, 16]. С этой точки зрения большое семейство генов тубулина представляет удобную генетическую модель для изучения причин возникновения резистентности к действию антигельминтных препаратов.
Гены тубулина изучены у некоторых цестод (Bothriocephalus acheilogna-thi, Taenia asiatica, Echinococcus granulosus, E. multilocularis и др.) [4, 13], а также у некоторых нематод (Haemonchus contortus, Cyathostominae, Tricho-strongylidae) [9, 12, 19]. У нематод мутации в трех кодонах (167, 198 и 200) гена tubbl ассоциированы с устойчивостью к действию БЗ [9, 11, 14, 19]. Недавно получены доказательства того, что именно -тубулин изоформы 2 (tubb2) является одной из мишеней действия альбендазола у F. hepatica [6]. Структура генов тубулина определена лишь у небольшого числа гельминтов. Известно, что генв -тубулина одной из изоформ тубулина (tubbl) нематоды
H. contortus содержит 9 интронов и 10 экзонов [11], цестоды E. multilocularis — 2 интрона и 3 экзона [4]. Число изоформ тубулина также может варьировать: у H. contortus представлены Р-тубулины двух изоформ [11], у E. multilocularis — трех [4]. Что же касается сосальщиков, то у них, по-видимому, разнообразие тубулинов выше. Например, у F. hepatica для субъединицы Р известны, как минимум, 6 изоформ, а для субъединицы, а — 5 [18], причем один из генов Р -тубулина не содержит интронов вообще [15]. В настоящее время известны две последовательности кДНК гена tubb2 фасциолы [18].
Гены тубулинов нередко используют в качестве маркеров для дифференциации географических популяций гельминтов, иногда в совокупности с другими распространенными маркерами (например, ITS рДНК или митохондриальные гены) [21, 22].
Поэтому цель нашей работы состояла в анализе структуры и полиморфизма генов тубулина Р2 у F. hepatica из трех российских популяций. Для сравнения использованы две известные последовательности кДНК фасциолы F. hepatica из Великобритании [18].
Материалы и методы
Выделение ДНК из 8 марит F. hepatica, собранных из печени крупного рогатого скота с территории Мордовии (n = 2), Смоленской (n = 3) и Псковской (n = 3) областей проводили с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 100 согласно методике, предложенной производителем.
Подбор праймеров осуществляли с помощью программы PrimerSelect на основании двух последовательностей кДНК tubb2 F. hepatica из Великобритании (№AM773764 и № AM933586) [18]. Прямой FTB1 (5'-
TTCAGGCTGGTCAATGTGGA-3') и обратный FTB2 (5'-TCAGTTGAGCCCTTGCCAGTC-3') праймеры подобраны соответственно к позициям 20−39 и 850−870 пн.
Локус-специфичную ПЦР проводили на ДНК 8 марит при следующем температурном режиме: 94 °C — 2 мин- 94 °C — 1,5 мин (30 циклов) — 72 °C — 10 мин. Разделение продуктов амплификации осуществляли в 1,5%-ном агарозном геле.
Элюцию из геля и очистку амплификатов проводили с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Clean-up System по методике производителя.
Молекулярное клонирование элюированных амплификатов, полученных с помощью праймеров FTB1, FTB2 на ДНК 8 исследованных образцов фас-циол, осуществляли с применением наборов реактивов P-Gem R T-Easy Vector System. Для секвенирования и построения 8 консенсусных последовательностей участка гена tubb2 анализировали как минимум по три колонии из одной реакции лигирования.
Секвенирование 24 вставок осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100 Avant Genetic Analyzer в Межинсти-
тутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» (www. genome-centre. narod. ru).
Выравнивание последовательностей проводили с помощью пакета программ MEGA 4.0.- для выбора модели нуклеотидных замен использовали пакет программ PAUP 4.0 (ModelTest) [20]- дендрограммы строили методом «максимального подобия» (ML) с помощью программы PhyML 3.0. [8].
Результаты и обсуждение
При амплифицировании участка гена tubb2 на 8 образцах ДНК получены 8 единичных фрагментов размером 1150 пн. В результате клонирования ам-плификатов и секвенирования трех вставок от каждого клона получены 24 нуклеотидные последовательности гена tubb2. Для каждого из клонов составлена консенсусная последовательность. Консенсус составлялся как минимум из трех последовательностей- если нуклеотид в какой-либо позиции различался в последовательностях клонированных вставок, то в консенсус ставился нуклеотид, присутствовавший в большинстве последовательностей вставок.
Внутри 8 консенсусных последовательностей определены границы экзо-нов путем выравнивания с двумя известными последовательностями кДНК tubb2 F. hepatica (№ AM773764 и № AM933586), размер которых составлял 1332 пн. Оказалось, что полученные нами участки гена tubb2 содержат 3 эк-зона и 2 интрона, длина которых составила: 1 экзон — 57 пн, 2 экзон — 468, 3 экзон — 354 пн- 1 и 2 интроны — 185 и 86 пн, соответственно. Таким образом, нами получены частичные последовательности гена tubb2, включающие полностью первый и второй и частично третий экзоны, а также интроны 1 и 2.
В таблице 1 приведена характеристика нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма в гене tubb2 у F. hepatica российской популяции. Для сравнения были включены три соответствующих экзона двух последовательностей кДНК tubb2 фасциол из Великобритании. При сравнении 10 нуклеотидных последовательностей мы обнаружили только точковые замены, причем большая часть этих замен вызвана транзициями. В российских образцах мутации в два раза чаще встречались в интронах по сравнению с экзонами (5,5 и 2,5−2,8%), причем более короткий второй интрон оказался и наиболее полиморфным (11,6%).
Как для российских, так и для английских образцов фасциол характерно неравномерное распределение мутаций по трем экзонам. Наиболее полиморфными оказались более протяженные второй и третий экзоны гена tubb2 у F. hepatica российской популяции (2,6 и 3,7%). У двух образцов из Великобритании максимальная изменчивость выявлена в третьем экзоне (3,4%).
Большая часть мутаций в экзонах относится к синонимичным и не вызывает изменений аминокислотного состава тубулина. Эта тенденция четко выражена при сравнении 8 последовательностей экзонов tubb2 у F. hepatica российской популяции. Изменения аминокислотного состава тубулина у российских образцов составили 2,4% по сравнению с сосальщиками из Ведикобри-тании (0,34%).
Обращает на себя внимание тот факт, что для всей кодирующей последовательности российских фасциол соотношение несинонимичных и синонимичных замен составляет 0,39, что указывает на наличие стабилизирующего отбора по данному локусу. Этот показатель несколько выше для третьего экзона (0,63), немного ниже для второго экзона (0,2) и равен нулю в первом экзоне.
Из приведенных данных видно, что исследованные фасциолы российской популяции по частоте встречаемости мутаций практически не отличаются от фасциол из Великобритании. Однако локализация этих мутаций в последовательностях гена у образцов из географически разобщенных популяций варьирует. Об этом свидетельствуют дендрограммы генетических различий, построенные на основании суммарной нуклеотидной последовательности экзонов и интронов гена tubb2 и последовательностей только экзонов этого гена (рис. 1, 2).
1. Характеристика нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма в гене ШЪЪ2 у.е. НераИеа
российской и британской популяций (в скобках указано значение, полученное при сравнении последовательностей экзонов ЫЪЪ2 британских фасциол)
Длина, пн Число полиморф-ных сайтов Доля полиморфных сайтов, % Число транзиций и трансверсий Число несинонимичных и синонимичных замен Доля аминокислотных замен, % Отношение несинонимичные/ синонимичные замены (Я)
1 экзон 57 0 (1) 0 (1,8) 0/0 (1/0) 0/0 (0/1) 0 (0) 0 (0)
1 интрон 185 5 2,70 5/0 — - -
2 экзон 468 12 (9) 2,6 (1,9) 10/2 (8/1) 2/10 (1/8) 1,28 (0,64) 0,2 (0,13)
2 интрон 86 10 11,6 4/6 — - -
3 экзон 355 13 (12) 3,7 (3,4) 9/4 (11/1) 5/8 (0/12) 4,24 (0) 0,63 (0)
Все экзоны 879 25 (22) 2,8 (2,5) 19/6 (20/2) 7/18 (1/21) 2,40 (0,34) 0,39 (0,04)
Все интроны 271 15 5,5 9/6 — - -
Суммарно (без вепБапк) 1150 40 3,5 28/12 — - -
Смоленск З
— Псков З
— Псков 1 Псков 2
----Мордовия 1
— Мордовия 2 Смоленск 1
100 I Смоленск 2
Рис. 1. Дендрограмма генетических различий между российскими фасциолами, построенная на основании суммарной нуклеотидной последовательности трех экзонов и двух интронов гена ШЬЬ2 (модель Юшига 2, А1С = 3185,507, — 1пЬ = 1574,714)
56
— Псков 2
Смоленск 3
Псков 1
— Мордовия 1
47І- Псков 3 Мордовия 2
П См& lt-
Смоленск 1
39і Смоленск 2 -АМ773 764
— АМ933 586
Рис. 2. Дендрограмма генетических различий между российскими и анлийскими фасциолами, построенная на основании суммарной нуклеотидной последовательности трех экзонов гена ШЬЬ2 (модель Ктига 2+ в, А1С = 3283,929, — 1пЬ = 1622,920)
Три хорошо дифференцированные группы можно выделить среди фас-циол российской части ареала. Два образца из Мордовии формируют собственный кластер. В отдельную группу объединены все три образца из Псковской области. И только фасциолы из Смоленской области менее однородны -два образца (Смоленск 1 и Смоленск 2) дифференцированы в отдельный кластер, а третий (Смоленск 3) оказался более сходным с сосальщиками из Псковской области. Сходство Смоленска 3 и псковских образцов можно объяснить географической близостью этих популяций и, следовательно, возможностью их частичного смешения за счет перевозки из смежных областей окончательных хозяев, крупного рогатого скота.
При сравнении суммарной последовательности только кодирующих участков гена ШЬЬ2 различия между выборками фасциол из трех областей Российской Федерации менее выражены. Однако популяции из России и Великобритании формируют два отдельных, далеко отстоящих друг от друга, кластера. Аналогичная дифференциация на две группы обнаружена нами и при сравнении аминокислотных последовательностей гена ШЬЬ2 (данные не приведены).
Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможность использования гена тубулина-р2 для дифференциации географически разобщенных популяций ?. НераНеа. Эти различия обусловлены мутационными измене-
ниями, возникшими в процессе адаптации паразита к условиям среды в географически удаленных группах окончательных хозяев.
Нельзя исключить, что одним из факторов отбора может служить действие антигельминтиков (например, применение бензимидазолов). Известно, что именно в европейских странах широко применяют бензимидазолы против фасциолеза, и именно там зафиксированы случаи появления резистентных штаммов. Например, экспериментальное исследование устойчивости F. hepa-tica к триклабендазолу показало, что его эффективность против устойчивых штаммов фасциол составляет всего 10,8%, а против восприимчивых штаммов — 99,8% при дозе 10 мг/кг в обоих случаях [7]. Для выяснения окончательных причин возникновения генетической изменчивости гена tubb2 печеночных сосальщиков необходимо расширить исследуемый ареал и использовать несколько дополнительных маркеров полиморфизма ядерного и митохондриального генома.
Заключение
Впервые показано, что ген tubb2 у F. hepatica состоит как минимум из трех экзонов и двух интронов. Несмотря на то, что данный локус не является селективно нейтральным, он позволяет дифференцировать географические разобщенные популяции F. hepatica из России и Великобритании. Нельзя исключить, что одним из селективных факторов может служить воздействие на паразита антигельминтиков.
Работа частично финансировалась грантами РФФИ (09−04−1 611а, НШ-2107. 2008. 4, Программой по молекулярной и клеточной биологии, ФЦП ГК № 02. 740. 11. 0088, П1043 и ГК 16. 740. 11. 0001.
Литература
1. Атаев А. М. Особенности эпизоотического процесса при фасциолезе животных // Ветеринария. — 1991. — № 10. — С. 44−47.
2. Лошкарева В. В. Маритогония трематод у крупного рогатого скота и оптимизация сроков применения антигельминтиков в условиях Среднего Предуралья: Дис. … канд. вет. наук. — М., 2005. — С. 11−12.
3. Boray J.C. Disease of Domestic Animals Caused by Flukes. Food and Agricultural Organisation of the United Nations. — Rome, 1994. — 49 p.
4. Brehm K. et al. Cloning and characterization of P-tubulin genes from Echinococcus multilocularis // Molecular and Biochemical Parasitology. -2000. — V. 107. — P. 297−302.
5. Buchanan J.F. et al. Fasciola hepatica: surface and internal tegumental changes induced by treatment in vitro with the sulphoxidemetabolite of albendazole ('-Valbazen'-) // Parasitology. — 2003. — V. 126. — P. 41−153.
6. Chambers E. et al. Liver fluke P-tubulin 2 binds albendazole and is thus a probable target of this drug // Parasitol. Res. — 2010. — V. 107. — P. 1257−1264 p.
7. Gaasenbeek C.P.H. et al. An experimental study on triclabendazole resistance of Fasciola hepatica in sheep // Vet. Parasitol. — 2001. — V. 95 — P. 37−43.
8. Guindon and Gascuel. A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood // Systematic biology. — 2003. — V. 52. -P. 696−704.
9. Hodgkinson J.E. et al. The role of polymorphisms at P-tubulin isotype 1 codons 167 and 200 in benzimidazole resistance in cyathostomins // Intern. J. for Parasitol. — 2008. — V. 38. — P. 1149−1160.
10. Jackson F., Coop R.L. The development of anthelmintic resistance in sheep nematodes // Parasitology. — 2000. — V. 120. — P. 95−107.
11. Kwa M.S.G. et al. Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with conserved mutation at amino acid 200 in beta tubulin isotype 1 // Mol. and Biochem. Parasitol. — 1994. — V. 63. — P. 299−303.
12. Kwa M.S.G. et al. Beta-tubulin genes from the parasitic nematode Hae-monchus contortus modulate drug resistance in Caenorhabditis elegans // J. of Mol. Biol. — 1995. — V. 246. — P. 5GG-51G.
13. Luo H.L. et al. Characterization of development-related genes for the ces-tode Bothriocephalus acheilognathi // Parasitol. Res. — 2GG4. — V. 94. — P. 265−274.
14. Prichard R.K. Genetic variability following selection of Haemonchus contortus with anthelmintics // Trends of Parasitol. — 2GG1. — V. 17. — P. 445−453.
15. Robinson M. W et al. Characterisation of a P-tubulin gene from the liver fluke Fasciola hepatica // Intern. J. for Parasitol. — 2GG1. — V. 31. — P. 1264−1268.
16. Robinson M.W. et al. The comparative metabolism of triclabendazole sul-phoxide by triclabendazole-susceptible and triclabendazole-resistant Fasciola hepatica // Parasitol. Res. — 2GG4. — V. 92. — P. 2G5−21G.
17. Robinson M. W, Dalton J.P. Zoonotic helminth infections with particular emphasis on fasciolosis and other trematodiases // Philosophical Transactions of The Royal Society. Biol. Sci. — 2GG9. — V. 364. — P. 2763−2776.
18. Ryan L.A. et al. Fasciola hepatica expresses multiple a- and P-tubulin isotypes // Mol. And Biochem. Parasitol. — 2GG8. — V. 159. — P. 73−78.
19. Silvestre A., Gabaret J. Mutation in position 167 of isotype 1 beta-tubulin gene of Trichostrongylid nematodes: role in benzimidazole resistance? // Mol. and Biochem. Parasitol. — 2GG2. — V. 12G. — P. 297−3GG.
2G. Swofford, D. L. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. — Sinauer Associates. Sunderland. Massachusetts. -2GG2.
21. Teofanova D. et al. Genetic diversity of liver flukes (Fasciola hepatica) from Eastern Europe // Infection, Genetics and Evolution. — 2G11. — V. 11. — P. 1G9−115.
22. Vara-Del Rio M.P. Gentic heterogeneity of Fasciola hepatica isolates in the northwest of Spain // Parasitol. Res. — 2GG7. — V. 1G1. — P. 1GG3−1GG6.
Differentiation of geographical populations of liver fluke Fasciola hepatica on the grounds of tubulin-02 gene polymorphism (tubb2)
A.S. Gulyaev, V.A. Vasilyev, N.Y. Filimonov, S.K. Semyonova, I.A. Arkhipov
For the first time it is shown Fasciola hepatica tubulin-p2 gene structure, the product of which is probably the main target of the benzimidazoles. The suitability of the gene for differentiation of geographical populations of F. hepatica from Russia and Great Britain is shown. It is discussed the causes of mutations in coding regions of the gene and association of observed polymorphism with action of an-thelminthics.
Keywords: Fasciola hepatica, tubulin gene, polymorphism, mutation, dendro-gramme, differentiation.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой