Obtaining of recombinant low molecular weght streptokinase fragments

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 577. 112. 083+579. 69
ОТРИМАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ФРАГМЕНТІВ СТРЕПТОКІНАЗИ
київський національний університет імені Тараса Шевченка 2Shijir International LLC., Улан-Батор, Монголія 3Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
Е-mail: ominchenko@yahoo. com
Фрагменти гена стрептокінази (CK), що кодують протеїнові продукти СК1−50 та СК1−60, було ампліфікова-но та клоновано у плазмідному векторі. Експресію рекомбінантних фрагментів стрептокінази, кодованих цими генетичними конструкціями, здійснено в клітинах Escherichia coli Tuner (DE3) під контролем Т7- промотору. Для отримання чистих фрагментів стрептокінази було проведено двостадійний процес їх хроматографічного очищення з бактеріальних лізатів у денатуруючих умовах. За допомогою імуноблотингу з використанням анти-стрептокіназних антитіл підтверджено автентичність отриманих фрагментів стрептокінази.
Ключові слова: фрагменти стрептокінази, клонування, експресія, тільця включення, хроматографічне очищення.
Л. Л. Карбовський1 2 В. В. Скалка2 О. Г. Мінченко3
На сьогодні стрептокіназа є одним з найпоширеніших протеїнів, препарати якого досить ефективно застосовують для тромбо-літичної терапії. Використання стрептокінази в клінічній практиці обумовлює необхідність глибокого вивчення складних механізмів взаємодії цього протеїну з плаз-міногеном та іншими компонентами системи гемостазу.
Стрептокіназа продукується деякими видами роду Streptococcus і здатна активувати систему фібринолізу, перетворюючи плазмі-ноген на плазмін [1]. Встановлено, що стрептокіназа може зв’язуватися з плазміногеном і внаслідок конформаційних змін індукувати утворення активного центру в протеїназ-ному домені плазміногена [2, 3]. Утворений активний центр каталізує перетворення плазміногена на плазмін шляхом розщеплення пептидного зв’язку Arg561 — Val562 [4, 5].
Молекула стрептокінази синтезується у вигляді одноланцюгового поліпептиду, що складається з 440 амінокислотних залишків і не містить дисульфідних зв’язків [6]. Під час дозрівання відбувається відщеплення сигнального пептиду і утворення зрілого протеїну, що містить 414 амінокислот та має молекулярну масу близько 47 кДа [7]. СК має три гомологічних домени: а (залишки 1−146),? (залишки 147−290), у (залишки 290−414), фолдинг яких відбувається неза-
лежно [8]. Кожен домен зв’язується з плазміногеном, водночас жоден із них не здатен активувати плазміноген окремо [9, 10, 11].
Амінокислотні залишки 1−59 а-домену стрептокінази (СК1−59) відіграють важливу роль в активації плазміногена. У процесі інкубування стрептокінази з плазміногеном пептидний зв’язок Lys59 — Ser60 швидко гідролізується, а утворений N-кінцевий пептид СК1−59 залишається асоційованим з комплексом стрептокіназа — плазміноген [12]. Встановлено, що під час часткового протеолізу стрептокінази за допомогою а-хімо-трипсину можна отримати фрагмент стрептокінази СК1−63, близький за структурою до фрагмента стрептокінази СК1−59, однак він не виявляє активуючої дії щодо плазміногена in vitro [13, 14]. Стрептокіназа, що не містить залишків 1−59 (СК60−414), формує стабільний комплекс із плазміногеном, який характеризується значно меншою здатністю перетворювати плазміноген на плазмін [15]. Разом з тим було встановлено, що інкубація фрагментів стрептокінази СК1−63 або СК1−59 із фрагментом СК60−414 призводить до відновлення активації плазміногена [12]. Послідовність амінокислот 1−59 також зумовлює здатність стрептокінази активувати плаз-міноген за відсутності фібрину, що й відрізняє стрептокіназу від тканинного активатора плазміногена. А низька активність фрагмен-
та стрептокінази СК60−414 значно підвищується у присутності фібрину [16].
Метою цієї роботи було створення екс-пресійних генетичних конструкцій для отримання коротких N-кінцевих фрагментів стрептокінази в Escherichia coli та розроблення способів їх очищення.
Матеріали і методи
Створення генетичних конструкцій для експресії коротких N-кінцевих фрагментів стрептокінази в E. coli. Послідовність гена стрептокінази, що кодує N-кінцевий фрагмент (амінокислоти 1−60), підбирали відповідно до послідовності гена стрептокінази Streptococcus equisimilis, штаму H46A (GenBank accession number K02986). Фрагмент гена та олігонуклеотиди були хімічно синтезовані компанією Eurofins MWG Operon (Німеччина).
Для клонування фрагментів гена стреп-токінази використовували плазміди pET-Blue-1, pET-23b (Novagen, США) і штам E. coli NovaBlue (Novagen). Для дизайну олігонуклеотидних праймерів та інтерпретації одержаних результатів застосовували програму Vector NTI.
Для ампліфікації фрагмента гена стреп-токінази СК1−60 завдовжки 180 п.н., який включав послідовності старт- та стоп-кодо-нів, використовували пару праймерів: SK7 прямий праймер (5'--atgattgctggacctgagtgg-3'-) та SK7 зворотний праймер (5'--ttatgattttg-gacttaagccttgc-3'-). Продукт полімеразної ланцюгової реакції клонували у лінеаризо-ваному рестрикційною ендонуклеазою EcoRV векторі pET-Blue-1.
Фрагмент гена стрептокінази СК1−50 ампліфікували за допомогою праймерів: SK5 прямий праймер (5'--tatcatatgattgctg-gacctgagtg-3'-) і SK5 зворотний праймер (5'--acctcgagttatcctccatgagcaggtcg-3'-), які містили сайти рестрикції ендонуклеаз NdeI і XhoI (підкреслені). Вектор pET-23b та продукт полімеразної ланцюгової реакції гідролізу-вали зазначеними вище рестрикційними ен-донуклеазами, очищали і зшивали, використовуючи Т4 -ДНК-лігазу (Sigma, США).
Рекомбінантними плазмідами трансформували E. coli NovaBlue методом електропо-рації на приладі Multiporator (Eppendorf, Німеччина). Скринінг отриманих клонів проводили методом ПЛР з використанням праймерів T7 Promoter, T7 Terminator, pETBlueUP, pETBlueDOWN (Novagen). Додатковий аналіз здійснювали за допомогою рестрикційного картування.
Експресія рекомбінантних протеїнів. Для отримання фрагментів стрептокінази використовували штам E. coli Tuner (DE3), який є похідним від штаму BL21 (DE3) і створений шляхом делеції гена мембранного переносника лактози (lacY), що дозволяє знизити не індуковану експресію цільових протеїнів до мінімального рівня, а також точніше контролювати експресію рекомбі-нантних протеїнів за допомогою зміни концентрації індуктора IPTG. Клітини E. coli Tuner (DE3) (Novagen, США) трансформували плазмідними конструкціями pET-Blue-1-СК1−60 та pET^b1−50.
Одиночну колонію інокулювали в 50 мл середовища LB (1%-й бактотриптон, 0,5%-й дріжджовий екстракт, 1%-й NaCl) з додаванням 50 мкг/мл карбеніциліну та 34 мкг/мл хлорамфеніколу і нарощували упродовж ночі. Попередньо нарощену культуру інокулювали в свіже середовище 2YT (1,7%-й бактотриптон, 1%-й дріжджовий екстракт,
0,5%-й NaCl) та культивували при 37 °C, інтенсивно струшуючи до досягнення оптичної густини 0,6 за довжини хвилі 600 нм. Індукування експресії здійснювали, вносячи в середовище ізопропіл^^-тіогалак-топіранозид (IPTG) до кінцевої концентрації 1 мМ. Після трьох годин культивування клітини збирали центрифугуванням при 5 000 g протягом 10 хв і осад клітин заморожували при -86 °С.
Тест на стабільність плазмідної трансформації. Бактеріальну культуру нарощували до OD600 = 0,6 та розводили в культуральному середовищі. По 100 мкл розведення 10−6 висівали на чашку з LB-агаром з додаванням 50 мкг/мл карбеніциліну та на чашку без антибіотика. Також по 100 мкл розведеної культури висівали на чашку з IPTG (1 мМ) і на чашку з IPTG та карбеніциліном. Інку-бували в термостаті при 37 °C. Колонії підраховували наступного дня.
Виділення тілець включення. Осад клітин E. coli Tuner (DE3) розморожували в лі-зуючому буферному розчині (0,1 М Tris-НСІ і 10 мМ EDTA, рН 8,0), додаючи інгібітор PMSF до концентрації 1 мМ. Для дезінтеграції клітин і руйнування хромосомної ДНК суспензію бактерій обробляли ультразвуком. Нерозчинні протеїни відділяли центрифугуванням (5 000 g, 10 хв). Тільця включення ресуспендували на ультразвуковому дезінтеграторі в лізуючому буферному розчині з 0,5% Triton X-100 та осаджували центрифугуванням. Процедуру відмивання повторювали декілька разів. Частково відмиті тільця включення використовували
для хроматографічного очищення фрагментів стрептокінази або заморожували і зберігали при -86 °С.
Хроматографічне очищення фрагментів стрептокінази. Хроматографію проводили з використанням системи для рідинної хроматографії AKTA Purifier (Amersham Biosciences, Швеція).
На першому етапі очищення фрагментів стрептокінази СК1−60 та СК1−50 застосовували катіонообмінну колонку HiPrep 16/10 CM FF (Amersham Biosciences) об'ємом 20 мл. Тільця включення розчиняли в буфері для нанесення (20 мМ цитрат натрію, рН 3,0, та 8 М сечовина) і наносили на врівноважену буфером колонку. Для елюції використовували лінійний градієнт NaCl (0−1 М) у тому самому буфері. Швидкість потоку становила 5 мл/хв.
Для наступного очищення фрагментів стрептокінази застосовували хроматографію з оберненими фазами, використовуючи колонки Resource RPC (Amersham Biosciences) об'ємом 3 мл. Колонки врівноважували буфером для нанесення (0,1% трифтороцто-вої кислоти з 5% ацетонітрилу). Фракції, що містили фрагмент стрептокінази, змішували з двократним буфером для нанесення (0,2% трифтороцтової кислоти з 10% ацетонітрилу) в рівних об'ємах. Елюцію протеїнів здійснювали лінійним градієнтом ацетонітрилу (5−60%) у буфері для нанесення. Швидкість потоку — 1 мл/хв.
Протеїнові фракції аналізували за допомогою електрофорезу методом Laemmli [12] в 15%-му поліакриламідному гелі з доде-цилсульфатом натрію. Кількісний вміст протеїнів в окремих фракціях визначали методом денситометрії електрофореграм з наступним їх аналізом у програмі Total Lab (Amersham Biosciences). Для визначення концентрації фрагмента стрептокінази в очищених препаратах послуговувались теоретично розрахованим коефіцієнтом поглинання за довжини хвилі 280 нм.
Імуноблотинг. Після електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі з до-децилсульфатом натрію протеїни з гелю переносили на нітроцелюлозну мембрану Hybond-C. Мембрану інкубували 1 год при 37 °C у фосфатно-сольовому буфері, рН 7,4, який містив 5% знежиреного молока. Після цього мембрану промивали і вміщували в розчин кролячих антистрептокіназних антитіл та інкубували протягом 1 год при 37 °C. Після промивання вносили розчин антитіл проти імуноглобулінів кроля, кон’югованих з пероксидазою хрону, й інку-
бували за тих самих умов. Для візуалізації протеїнових смужок мембрану переносили в розчин, що містив субстрат 3,3-діамінобен-зидин (Sigma, США).
Результати та обговорення
Дослідження мультифункціональних протеїнових молекул часто здійснюють шляхом отримання окремих їхніх частин та вивчення функціональних особливостей цих фрагментів. Існують різні підходи, що дозволяють одержати різноманітні протеїнові фрагменти: хімічний та ензиматичний гідроліз, а також технологія рекомбінант-них ДНК. Хімічний гідроліз здійснюється в денатуруючих умовах і характеризується малою специфічністю, що значною мірою обмежує його використання в біохімічних дослідженнях. Ензиматичний гідроліз має високу специфічність дії, яка залежить від використаного для гідролізу ензиму та гід-ролізованого протеїну. Під час ензиматичного гідролізу першими гідролізуються легкодоступні пептидні зв’язки, які часто бувають між функціонально відокремленими ділянками молекули. У міру розщеплення з’являються нові доступні ділянки, раніше закриті для гідролізу. Таким чином, змінюючи ензими та варіюючи умовами гідролізу (час реакції, кількість ензиму та субстрату), можна одержати велику кількість фрагментів, що в сумі повністю репрезентують протеїнову молекулу. Останнім часом дедалі частіше застосовують технологію ре-комбінантних ДНК, яка відкриває можливості отримання будь-якої частини молекули протеїну потрібної довжини, незалежно від сайтів протеолізу, розміщених у поліпеп-тидному ланцюзі. Крім того, сайт-спрямова-ний мутагенез уможливлює заміну або ж видалення окремих амінокислот чи певної амінокислотної послідовності.
Існуючі технології отримання фрагментів стрептокінази базуються на частковому її протеолізі за допомогою різних гідролітичних ензимів: трипсину [18], термолізину [19], плазміну [11], комплексу стрептокіна-за — плазмін (оген) [10], хімотрипсину [13, 14]. Зокрема, використовуючи а-хімотрип-син авторам вдалось отримати фрагменти стрептокінази з молекулярною масою 2 кДа (СК381−397), 7 кДа (СК1−63), 11 кДа (СК288−380),
16 кДа (СК147−287), 17 кДа (СК147−192), 26 кДа
(СК64−292), 27 кДа (СК147−380), 36 кДа (СК64−380) та дослідити їх вплив на перетворення плазмі-ногена на плазмін.
Для експресії рекомбінантних фрагментів стрептокінази СК1−50 та СК1−60 нами було отримано плазмідні конструкції pET-23b-СК1−50 і pETBlue-1-СК1−60. Ці конструкції аналізували на присутність вставки методом полімеразної ланцюгової реакції. Клони, в яких підтвердилась наявність вставки, додатково перевіряли рестрикційним гідролізом за допомогою ендонуклеаз EcoRI та HincII (pETBlue-1-СК160), а також NdeI та HincII (рЕТ-23Ь-СК150). Для встановлення нуклеотидної послідовності та виявлення можливих мутацій здійснювали секвенуван-ня обох ланцюгів ДНК. Конструкції, що не містили помилок, відбирали для подальшої роботи.
У зв’язку з невеликими розмірами N-кін-цевих фрагментів стрептокінази та необхідністю подальшого їх використання для дослідження впливу на систему гемостазу було вирішено експресувати ці пептиди без додаткових амінокислотних залишків як з N-, так і С-кінця молекули у клітинах E. coli Tuner (DE3).
Електрофоретичний аналіз бактеріальних лізатів після індукції показав наявність додаткових протеїнових смуг з приблизною молекулярною масою 5 та 7 кДа, що збігається з теоретично розрахованою масою СК1−50 та СК1−60 відповідно. Накопичення цільових протеїнів відбувалося переважно у вигляді нерозчинних тілець включення, що часто спостерігається під час експресії чужорідних протеїнів у клітинах E. coli. Отримання біологічно активного протеїну з таких тілець включення потребує денатурації поліпептиду і подальшої ренатурації очищеного протеїну. Зважаючи на малі розміри фрагментів стрептокінази, відсутність складних структурних елементів та дисуль-фідних зв’язків у молекулі, цілком прийнятною є їх експресія в нерозчинній формі.
Першим етапом хроматографічного очищення фрагментів стрептокінази було обрано метод іонообмінної хроматографії на слабкому катіонообміннику CM — Sepharose FF. Вибір цього методу зумовлений тим, що на катіонообміннику не відбувається сорбція негативно заряджених нуклеїнових кислот, вміст яких є досить високим у лізатах бактеріальних культур. Окрім того, за кислих значень рН та низької іонної сили відбувається максимально ефективне видалення бактеріальних ендотоксинів [15].
Обидва параметри (вміст нуклеїнових кислот і ендотоксинів) досить жорстко регламентуються нормами Європейської фармакопеї для рекомбінантних протеїнових препаратів. Оскільки теоретично розрахована ізоелектрична точка фрагмента стрептокінази СК1−50 становить 4,58, а СК1−60 — 5,05, то для розчинення тілець включення й нанесення на колонку було обрано 20 мМ натрій-цитратний буфер, що містив 8 М сечовини
і мав рН 3,0. За таких умов обидва фрагменти були позитивно заряджені і зв’язувалися із сорбентом. Елюцію матеріалу, що зв’язався із сорбентом, здійснювали в тому самому буфері лінійним градієнтом NaCl (0−1 M).
Тільця включення, що містили фрагменти стрептокінази СК1−50 та СК1−60, наносили на колонку HiPrep 16/10 CM FF (рис. 1 і 2) й отримані хроматографічні фракції аналізували за допомогою електрофорезу. Цікавим виявився той факт, що в таких умовах відбувається повне зв’язування протеїнового матеріалу, а елюція бактеріальних протеїнів починається лише при 0,4 М NaCl. Таким чином, навіть після однієї стадії хроматографії нам вдалося досягнути високого ступеня чистоти цільових протеїнів.
Наступним етапом хроматографічного очищення фрагментів стрептокінази було обрано метод зворотно-фазової хроматографії. Такий вибір зумовлений тим, що сорбція протеїнів у даному разі може проводитися за високої концентрації солі, а відтак потреби у зміні буфера перед нанесенням зразка нема.
Фракції, збагачені фрагментами стреп-токінази СК1−50 та СК1−60, наносили на колонку
Resource RPC (рис. 3). Зв’язаний матеріал елюювали лінійним градієнтом ацетонітри-лу (5−60%), що дозволило отримати протеїни з високим ступенем чистоти (рис. 4).
Автентичність одержаних рекомбінант-них протеїнів було підтверджено за допомогою імуноблотингу з використанням анти-стрептокіназних антитіл (рис. 4, Б).
Таким чином, нами було отримано ре-комбінантні фрагменти стрептокінази, чистота яких після двох стадій хроматографічного очищення становила не менше 99%, що дає можливість використовувати їх для подальших наукових досліджень.
'-280
mAU
NaCl. M
кДа
135P 95 72 52 42 34
26 M
I
A280'-m*U
NaCl, M
кДа
97
66
45
30
UUUIJUI
Б
10
12 3 4
Рис. І. Очищення фрагмента стрептокінази СК1−50 із бактеріальних лізатів на колонці HiPrep 16/10 CM FF та електрофорезом отриманих фракцій:
А — фракція, що містить СК1−50 (1) — протеїнові домішки (2) —
Б — протеїни-маркери молекулярної маси (І) — відмиті тільця включення, що містять СК1−50 (2) — хроматографічний пік № 1, що містить очищений протеїн СК1−50 (З), хроматографічний пік № 2 (4)
Б
20
14,4
Рис. 2. Очищення фрагмента стрептокінази СК1−60 із бактеріальних лізатів на колонці HiPrep 16/10 CM FF та електрофорезом отриманих фракцій:
А — фракція, що містить СК1−60 (І) — протеїнові домішки (2) —
Б — протеїни-маркери молекулярної маси (1) — тільця включення, що містять СК1−60 (2) — фракція протеїнів, що не зв’язались із сорбентом (З) — хроматографічний пік № 1, що містить СК1−60 (4) — хроматографічний пік № 2 (5)
Рис. 3. Очищення фрагментів стрептокінази (фракції № 1), отриманих під час розділення на колонці HiPrep 16/10 CM FF, що містить СК1−50 (А) та СК1−60 (Б), на Resource RPC
LJ U U I
-
¦
:
кДа
170
130
95
72
52
42
34
26
17
10
І*
кДа 97
66
* 45
w 30
— 20
to 14. 4
кДа
—. 130 -95 72 52
42
М 34 «м 26
«10
1 2 А
2
Б
2
В
Рис. 4. Характеристика отриманих фрагментів стрептокінази:
А — електрофореграма хроматографічно очищеного СК1−50 (1) та маркери молекулярної маси (2) —
Б — електрофореграма хроматографічно очищеного СК1−60 (1, 2) та маркери молекулярної маси (3) — В — блотограма СК1−50 (1), СК1−50 (2) та маркери молекулярної маси (3)
1
3
1
3
ЛІТЕРАТУРА
1. Christensen L. Streptococcal fibrinolysis: A proteolytic reaction due to a serum enzyme activated by streptococcal fibrinolysin // J. Gen. Physiol. — 1945. — V. 28. — P. 363−383.
2. Fuentes M., Valero E, Garcia-Moreno M. et al. Kinetic analysis of the mechanism of plasminogen activation by streptokinase // J. Math. Chem. — 2006. — V. 42, N. 4. — P. 753−774.
3. Yadav S., Datt M., Singh B., Sahni G. Role of the 88−97 loop in plasminogen activation by streptokinase probed through site-specific mutagenesis // Biochim. Biophys. Acta. — 2008. — V. 1784. — P. 1310−1318.
4. Boxrud P., Bock P. Coupling of conformational and proteolytic activation in the kinetic mechanism of plasminogen activation by streptokinase // J. Biol. Chem. — 2004. — V. 279. — P. 36 642−36 649.
5. Tharp A., Laha M., Panizzi P. et al. Plasminogen substrate recognition by the streptokinase-plasminogen catalytic complex is facilitated by Arg253, Lys256, and Lys257 in the streptokinase beta-domain and kringle 5 of the substrate // Ibid. — 2009. — V. 284. — P. 19 511−19 521.
6. Lizano S., Johnston K. Structural diversity of streptokinase and activation of human plasminogen // Infect. Immun. — 2005. — V. 73. — P. 4451−4453.
7. Reddy K. Streptokinase — Biochemistry and clinical application // Enzyme. — 1988. — V. 40. — P. 79−89.
8. Wang X., Lin X., Loy J. et al. Crystal structure of the catalytic domain of human plasmin complexed with streptokinase / / Science. — 1998. — V. 281. — P. 1662−1665.
9. Conejero-Lara F., Parrado J., Azuaga A. et al. Analysis of the interactions between streptokinase domains and human plasminogen // Protein Sci. — 1998. — V. 7. — P. 2190−2199.
10. Rodriguez P., Fuentes P., Barro M. et al. Structural domains of streptokinase involved in the interaction with plasminogen // Eur. J. Biochem. — 1995. — V. 229. — P. 83−90.
11. Shi C., Chang B., Chen S. et al. Function of streptokinase fragments in plasminogen activation // Biochem. J. — 1994. — V. 304. — P. 235−241.
12. Nihalani D., Kumar R., Rajagopal K., Sahni G. Role of the amino-terminal region of streptokinase in the generation of a fully functional plasminogen activator complex probed with synthetic peptides // Protein Sci. — 1998. — V. 7. — P. 637−648.
13. Parrado J., Conejero-Lara F., Smith R. et al. The domain organization of streptokinase: Nuclear magnetic resonance, circular di-chroism, and functional characterization of proteolytic fragments // Ibid. — 1996. — V. 5. — P. 693−704.
14. Гаврилюк С. П., Савчук О. М., Остапченко Л. І. Вплив нетоксичного 7 кДа фрагменту
стрептокінази на параметри системи гемостазу // Совр. пробл. токсикол. — 2008. — № 4. — С. 52−55.
15. Fay W. P., Bokka L. Functional analysis of the amino and carboxyl termini of streptokinase // Thromb. Haemostasis. — 1998. — V. 79.- P. 985−991.
16. Reed G., Houng A., Liu L. et al. A catalytic switch and the conversion of streptokinase to a fibrin-targeted plasminogen activator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — V. 96. — P. 8879−8883.
17. Laemmli K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680−685.
18. Nakashima A, Okada T., Sugie R. Fibrin-dependent activation of plasminogen by a proteolytic digest of streptokinase // Fibrinolysis. — 1990. — V. 227. — P. 279−284.
19. Misselwitz R., Kraft R., Kostka S. et al. Limited proteolysis of streptokinase and properties of some fragments // Int. J. Biol. Macromol. — 1992. — V. 14. — P. 107−116.
20. Petsch D., Anspach F. Endotoxin removal from protein solutions // J. Biotechnol. — 2000. — V. 76. — P. 97−119.
21. Magalhaes P., Lopes A, Mazzola P. et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review // J. Pharm. Pharma-ceut. Sci. — 2007. — V. 10. — P. 388−404.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАГМЕНТОВ СТРЕПТОКИНАЗЫ
Л. Л. Карбовский1, 2 В. В. Скалка2 А. Г. Минченко3
1Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко
2Shijir International LLC., Улан-Батор, Монголия 3Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: ominchenko@yahoo. com
Фрагменты гена стрептокиназы, кодирующие протеиновые продукты СК1−50 и СК1−60, были амплифицированы и клонированы в плаз-мидном векторе. Экспрессия рекомбинантных протеинов проведена в клетках Escherichia coli Tuner (DE3) под контролем Т7-промотора. Разработан двухэтапный процесс хроматографической очистки целевых протеинов с бактериальных лизатов в денатурирующих условиях. Аутентичность полученных протеинов подтверждена с помощью иммуноблотинга с использованием антистрептокиназных антител.
Ключевые слова: фрагменты стрептокиназы, клонирование, экспрессия, тельца включения, хроматографическая очистка.
OBTAINING OF RECOMBINANT LOW MOLECULAR WEGHT STREPTOKINASE FRAGMENTS
L. L. Karbovskyi1,2 V. V. Skalka2 O. G. Minchenko3
1Taras Shevchenko Kyiv National University
2Shijir International LLC,
Mongolia, Ulaanbaatar
3Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: ominchenko@yahoo. com
Streptokinase gene fragments, which encodes peptide products SK1−50 and SK1−60, where amplified and cloned into plasmid vector. Expression of recombinant protein fragments was performed in Escherichia coli strain Tuner (DE3) cells under T7- promoter control. Two step chromatography purification processes of desired proteins from bacterial lysates under denaturing conditions were developed. Authenticity of obtained proteins has been confirmed using immune blotting with antistreptokinase antibody.
Key words: streptokinase fragments, cloning, expression, inclusion bodies, chromatographic purification.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой