Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Украгнсъкий нейрох1рург1чний журнал, № 2, 2003
11
Орипнальы статт
УДК 611−013. 7/. 8−018. 82:591.8. 085. 25
Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека
Зозуля Ю. А., Лисяный Н. И., Любич Л. Д., Грищенко В. И., Петренко А. Ю., Бабийчук Г. А.
Институт нейрохирургии им. акад. А. П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев Институт криобиологии и криомедицины А Н Украины, г. Харьков
При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в бессывороточную среду ДМЕМ происходит сокращение их количества в 3−4 раза до 9-х суток культивирования, после чего содержание клеток стабилизируется, что свидетельствует о наличии в культуре популяции самоподдерживающихся стволовых клеток. Добавление в среду дополнительных факторов (ретинола ацетата) способствует пролиферации нейроклеток-предшественников. Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получить обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro. Ключевые слова: нервные стволовые клетки, предшественники нейроклеток, суспензионные кулъ-туры, ретинола ацетат.
Введение. Нервные стволовые клетки (НСК) рассматриваются как многообещающие источники для клеточной и генной терапии заболеваний нервной системы, благодаря своей способности дифференцироваться во все клеточные типы структур нервной системы. В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на проблемах идентификации, выделения, размножения и сохранения НСК и изучения их дифференцировки в культуре и при трансплантации в мозг.
На долю стволовых клеток приходится не более 0,1−0,01% клеток всей клеточной массы органа (в головном мозге и печени насчитывается примерно по 10 млрд. клеток, в иммунной системе — 300 млрд.) [4]. В отличие от мозга взрослых особей мозг эмбрионов человека I триместра беременности на 90% состоит из эмбриональных стволовых и прогениторных клеток [6]. Даже в постнатальном мозге человека и млекопитающих присутствуют два пула проге-ниторных нейробластов, способных повторно интегрироваться в нейронные сети эмбриона после экспериментальной трансплантации. Стволовые и мультипотентные клетки присутствуют в герминативных областях (паравентрику-лярной и субэпендимарной зонах) мозга не только в эмбриональном и раннем постнатальном периоде онтогенеза, но и в течение всей жизни млекопитающих и человека.
Разработаны несколько способов получения региональных стволовых клеток нервной ткани в культуре клеток [8, 9, 10]. Общий принцип заключается в том, что при добавлении ростовых факторов в специально подобранную культуру происходит деление стволовых клеток, тогда как убирая ростовые факторы, длительно культивируя и добавляя индукторы клеточной дифференцировки, можно получить обогащенную культуру нейробластов. Цитодиф-ференцировка нейробластов сопровождается образованием агрегатов клеток с формированием нейритов, аксонов и специфических межклеточных контактов [1, 2, 7]. Значительная часть стволовых прогениторных клеток в условиях такого культивирования погибает, остальные приспосабливаются к условиям среды и длительное время переживают в культуре клеток.
Целью данного исследования явилось изучение влияния условий культивирования на динамику переживания нейроклеток-предше-ственников, полученных из различных источников, при длительном культивировании in vitro в бессывороточной среде ДМЕМ.
Материалы и методы. Материалом исследований служили: 1) криоконсервированные нейроклетки человека 7, 8, 9, 10, 11−12 нед гестации, полученные из банка клеток Института криобиологии и криомедицины АН Укра-
12
Зозуля Ю. А., Лисяный Н. И., Любич Л. Д., Грищенко В. И., Петренко А. Ю., Баббийчук Г. А.
ины (г. Харьков) — 2) нейроклетки человека из нативного абортивного материала (табл. 1).
Получение суспензионных культур клеток-предшественников. Запечатанные контейнеры с криоконсервированными клетками извлекали из жидкого азота, помещали в водяную баню
Таблица 1 Сфнн экспериментальных наблюдений
Манфют Сфня Ц& gt- о дал^мтальнос ть кулынгаро*ання, сут
Криоюнсервиро ванные нейроклетки человека. (7−12 нед гестации), п=14 1 2118
Нейро кпв тки человека из нативного абортивного материала (3−12 нед гестации), п. =4 2 21
для оттаивания при температуре 38−40°С. Затем клетки переносили в стеклянные флаконы со средой ДМЕМ. Каждых 3 дня половина куль-туральной среды обновлялась.
Нативную эмбриональную мозговую ткань переносили в раствор ОМЕ или изотонический раствор натрия хлорида, освобождали от оболочек, помещали в среду ДМЕМ и суспендировали с помощью шприца с толстой иглой. Отстаивали 3 мин и надосадок переносили в стеклянные флаконы и чашки Петри. Каждых 3 дня половина культуральной среды обновлялась.
Изучение кинетики популяции клеток проводили путем тщательного суспендирования и отбора образцов клеточной взвеси из культу-рального объема. Определяли количество и жизнеспособность клеток согласно рекомендациям [5] по исключению трипанового синего.
Изучение влияния состава культуральной среды на переживаемость предшественников нервных клеток осуществляли в бессывороточной среде ДМЕМ и при добавлении в культу-ральную среду ретинола ацетата (0,2 мг/мл, АО «Киевский витаминный завод»).
Результаты и их обсуждение. Кинетика суспензионных культур предшественников нейроклеток при культивировании в среде ДМЕМ представлена в табл.2 (данные приведены в процентном выражении от первона-
чального количества клеток, внесенных в питательную среду).
Как видно из табл. 2, при культивировании нейроклеток человека 8−12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ происходило снижение количества клеток. На 5−7-е сутки культивирования количество клеток снизилось в 1,52 раза- на 9-е сутки — в 3−4 раза, в дальнейшем в культуре сохранялась тенденция к снижению количества клеток.
Кинетика суспензионных культур криокон-сервированных нейроклеток человека 8−12 нед гестации представлена на рис. 1 и в табл.3., из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, на 9-е сутки культивирования снижалось в 5 раз по сравнению с первоначальным их количеством и продолжало снижаться до конца наблюдения (19-е сутки). При культивировании клеток в среде ДМЕМ+рети-нола ацетат, который вводили в питательную среду на 5-е сутки, значительного снижения количества клеток в культуре не происходило, их количество начинало возрастать с 7-х суток культивирования и увеличивалось на 9−12-е сутки культивирования в 2 раза и больше, достигая исходного количества клеток. По мере увеличения срока культивирования количество жизнеспособных клеток возрастало. При этом количество клеток, культивируемых в среде ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало содержание клеток, помещенных в среду ДМЕМ, в 3−4 раза на 5−7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата) и в 9 раз — на 14-е сутки. Таким образом, добавление в культуральную среду ретинола ацетата значительно увеличивало выживание и размножение нейрогенных клеток.
Кинетика суспензионных культур нативных нейроклеток человека 8−12 нед гестации (абортивный материал) представлена на рис. 2 и в табл. 4, из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, снижалось в 3 раза на 9-е сутки культивирования по сравнению с первоначальным количеством, а на 19-е сутки — в 5 раз. При добавлении в среду ДМЕМ ретинола ацетата исходное содержание клеток сохранялось и несколько возрастало с
Таблица 2. Динамика количества клеток-предшественников в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ, %
Источник клеток Продолжительность культивирования, сутки
0 1-е 3-и 5-е 7-е 9-е 12-е 19-е
Криоконсерви-рованные нейроклетки человека, п=14 100,00±0,00 89,23±6,11 80,53±13,93 63,76±10,86* 50,20±12,40* 24,07±8,44* 35,29±7,34* 11,50±6,40*
Нативные нейроклетки человека, п=4 100,00±0,00 — - 58,10±14,83* - 30,94±11,76* 43,98±19,37* 22,43±10,19*
Примечание. *
— различия достоверны по сравнению с показателем 0 сут культивирования (Р& lt-0,05).
Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов челове к& lt-3
сутки
¦ - ДМЕМ (n= 11) -¦- - ДМЕМ+ ретинола ацетат (n= 4)
Рис. 1. Динамика суспензионной культуры криоконсервированных нейроклеток человека 8−12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ и при влиянии ретинола ацетата
12-х по 21-е сутки культивирования. При этом количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ, в 1,7−1,8 раза на 3-и-7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата). Однако к 21-м суткам содержание нейроклеток уменьшалось.
Таким образом, суммируя результаты длительного культивирования in vitro нейрокле-ток-предшественников, полученных из различ-
ных источников, можно заключить, что к 9-м суткам в бессывороточной среде ДМЕМ происходит снижение их количества в 3−4 раза. Мы считаем, что к этому сроку все дифференцированные клетки погибают, а остаются преимущественно только жизнеспособные переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки, предположительно,
нск.
При добавлении в культуральную среду дополнительных факторов (ретинола ацетата), очевидно, происходит стимуляция пролиферации клеток-предшественников или дифферен-цировка стволовых клеток и увеличение их количества в 2−5 раз, причем прирост количества клеток был выше в культурах криокон-сервированных нейроклеток по сравнению с таковым с культурами нативных нейроклеток эмбриона человека. Такое стимулирующее пролиферацию клеток-предшественников действие ретинола ацетата объясняется, по-видимому, известными биологическими свойствами препаратов витамина А, включающих ретинол, ре-тиналь, ретиноевую кислоту, ретинола ацетат и ретинола пальмитат. Известно, что ретинол необходим для роста, дифференцировки и сохранения функций эпителиальных и костных тканей, а также для их размножения, тогда как ретиноевая кислота — для клеточной диффе-ренцировки и она в 10 раз активнее ретинола, но менее активна в процессах размножения.
Полученные результаты согласуются с известными данными коллектива авторов [3] о том, что при культивировании клеток мозга, полученных от 8−12-недельных плодов человека, в
Таблица 3. Динамика количества и жизнеспособности криоконсервированных нейроклеток человека в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ и при добавлении ретинола ацетата, %
Состав среды Показатели Продолжительность культивирования, сут
1-е (+ретинола ацетат) 3-и 5-е 7-е 14-е 21-е 42-е
ДМЕМ+ ретинола ацетат, n=14 Количество 68,71±10,66 46,40±14,42 94,61±18,44# 106,19±9,94# 104,73±30,36# 108,48±29,56 46,15± 11,47
Жизнеспособность 19,83±6,68 16,69±7,29 27,00±10,06 36,31±11,88 89,65±0,85 92,40±0,57 96,75±3,25
ДМЕМ, n=14 Количество 63,76±10,86 50,20±12,40 24,07±8,44*# 35,29±7,34# 11,50±6,40*# - -
Жизнеспособность 19,08±7,58 20,95±0,05 16,88±4,54 22,68±9,87 50,00±50,00 — -
Примечание:* - различия достоверны по сравнению с показателями 1-х суток культивирования (Р& lt-0,05).
# - различия достоверны по отношению к соответствующей группе сравнения (Р& lt-0,05).
Таблица 4. Динамика количества нативных нейроклеток человека в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ при добавлении ретинола ацетата, %
Состав среды Продолжительность культивирования, сут
1-е (+ ретинола ацетат) 3-и 7-е 21-е
ДМЕМ + ретинола ацетат, n=4 35,95±13,55 40,08±14,93 46,95±20,85 20,55±5,14
ДМЕМ, n=4 43,98±19,37 22,43±10,19 27,60±9,05 44,78±31,34
14
Зозуля Ю. А., Лисяный Н. И., Любич Л. Д., Грищенко В. И., Петренко А. Ю., Бабийчук Г. А.
сутки
¦ - ДМЕМ (n= 4) -¦- - ДМЕМ+ ретинола ацетат (n= 4)
Рис. 2. Динамика суспензионной культуры нативных ней-роклеток человека 8−12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ и при влиянии ретинола ацетата
селективной бессывороточной среде количество клеток уменьшается в течение 1-й недели культивирования, а после добавления стандартного парепарата ростовых факторов (включающего hFGF, hEGF, NSF-1) восстанавливается до исходного уровня, сохраняя жизнеспособность и способность дифференцироваться в нейральные клетки.
Выводы. 1. При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в обедненной бессывороточной среде ДМЕМ происходит резкое (в 3−4 раза) снижение их количества к 9-м суткам культивирования, после чего отмечается стабилизация содержания клеток в течение 10−12 сут, что свидетельствует о наличии в культуре длительноживущей популяции стволовых клеток.
2. Добавление в среду дополнительных факторов (ретинола ацетата) способствует пролиферации клеток-предшественников: в течение 7 сут содержание клеток увеличивается в 1,31,5 раза, причем количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало количество клеток в культурах, помещенных в среду ДМЕМ, в 3−4 раза н а
5−7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата) в культурах криоконсервированных нейроклеток и в 1,7−1,8 раза в культурах нативных нейроклеток эмбриона человека.
Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получать обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro.
Список литературы
1. Анализ развития стволовых нейральных клеток человека in vitro / Полтавцева P.A., Марей М. В., Дубровина И. В. и др. // Цитология. — 2001. — Т. 43, № 9. — С. 884−885.
2. Морфологические аспекты дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в культуре / Гор-деева О.Ф., Мануилова Е. С., Гуляева Д. В. и др. / / Цитология. — 2001. — Т. 43, № 9. — С. 851.
3. Развитие и дифференцировка мультипотентных нейральных клеток человека in vitro / Полтав-цева P.A., Марей М. В., Дубровина И. В. и др. // Докл. PAH. — 2001. -Т. 379, № 6. — С. 845−849.
4. Репин B.C., Сухих Г. Т. Медицинская клеточная био-
логия. — М.: БЭБиМ, 1998. — 199 с.
5. Руководство по культивированию нервной ткани: Методы. Техника. Проблемы // В. П. Божкова, Л. А. Брежетовский, В. М. Буравлев и др. — М.: Наука, 1988. — 318 с.
6. Сухих Г. Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее // Бюл. экспе-рим биол. — 1998. — Т. 126. Прил.1. — С. 3−13.
7. Эмбриональные стволовые клетки: плюрипотент-ность, коммитирование, регуляция дифферен-цировки / Мануилова Е. С., Гордеева О. Ф., Зиновьева Р. Д. и др. // Цитология. — 2001. — Т. 43, № 9. — С. 876.
8. Barami K., Zhao J., Diaz F.G., Lyman WK. Gamparison
of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord // Neurol. Res. — 2000. — 23(2−3). — P. 260−266.
9. Caldwell M. A, He X., Wilhe N. et al. Growth factors regulate the survival and fate of cells derived from human neurospheres // Nat. Biotech. — 2001. — 19(5). — P. 475−479.
10. Ciccolini F. Identification of two distinct types of multi potent neural precursors that appear sequentially during CNS development // Mol. Cell Neurosci. — 2001. — 17(5). — P. 895−907.
Тривале культивування in vitro крюконсервованих i нативних нейрокл1тин ембрюшв людини
Зозуля Ю. П, Лгсяний М.1., Любич Л. Д., Грищенко B.I., Петренко А. Ю., Бабтчук Г. А. При тривалому культивуванш in vitro нейроклгшн-попереднишв у збгдненому безсироватковому середовищi ДМЕМ зменшуэться 1х кшьшсть у 3−4 рази до 9−1 доби культивування, шсля чого вмют клгтин стабшзуеться, що свгдчить про наявшсть у культурi популяцп стовбу-рових клггин, якг самотдтримуються. Додавання до се-редовища ретинола ацетату сприяе пролГферацп нейро-клиин-попереднишв. Розроблена методика тривалого культивування нейроклгтин людини дозволяе отримати збагачену популяцш нейроклгшн-попереднитв, здатних до пролГферацп in vitro.
The long-term cultivation in vitro of the cryopreserved and native nerve cells of human embryo
Zozulya Yu.P., Lisyany N.I., Lyubych L.D., Grischenho V. I, Petrenho A. Yu., Babiychuh G.A. The long-term cultivation in vitro of neuroprecursors in KMEM without serum lead to the 3−4-fold decrease of the number of cells on the 9-th day of cultivation. Then the number of cells become consistent evidencing about the presence in culture of self-renewing population of stem cells. Retinolacetate stimulate the proliferation of precursors. The method of long-term cultivation of human nerve cells allow to get the enriched population of neuroprecursors with capacity to proliferation in vitro.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой