Изучение белков конины с помощью протеомных технологий

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ КОНИНЫ
С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
Я. С. Манюхин, И. М. Чернуха, доктор техн. наук, ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова
Л. И. Ковалев, доктор биол. наук, А. В. Иванов, канд. биол. наук, М. А. Ковалева, доктор биол. наук,
С. С. Шишкин, доктор биол. наук
ФГБУ Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН
Конина как сырье для пищевых продуктов известна не одно тысячелетие, она используется для приготовления многих национальных блюд в странах Центральной Азии (например, в Киргизии, Казахстане и Монголии), а также в некоторых станах Западной Европы (во Франции, Швеции, Бельгии) и в Японии [1,2]. В нашей стране мясные продукты, содержащие конину популярны среди жителей Кавказа, Татарстана и ряда других регионов.
По сравнению с другими широко используемыми видами мясного сырья (говядиной, свининой, бараниной) конина характеризуется наиболее высоким содержанием белков с оптимальным аминокислотным составом и гипоаллергенными свойствами, набором липидов, обладающих пониженной атерогенностью, при минимальном уровне углеводов [1,2,3]. С учетом этих особенностей, а также данных о высоком содержании в конине витамина Е, витаминов группы В, ионов железа и целого набора важных микроэлементов ряд авторов относят конину к диетическим продуктам [2,3]. Вместе с тем, установлено, что заготовка и хранение конины сопряжены с различными трудностями и это сырье может быть источником различных паразитарных и инфекционных заболеваний человека [3,4]. Предпринимались даже попытки законодательно запретить применение конины для изготовления продуктов питания человека, например, в США [5].
В продолжение ранее начатых отечественных исследований белков мясного сырья и мясных продуктов с помощью протеомных технологий [6] в данной работе представлены результаты изучения белков конины и консервированного тушеного конского мяса и
их сравнение с соответствующими данными, полученными для других видов мясного сырья и некоторых мясных продуктов. При этом в исследованных образцах конины удалось идентифицировать ряд белков, которые могут быть использованы как потенциальные биомаркеры.
Материалы и методы
Образцы конины и другого мясного сырья были получены в ГНУ ВНИИМП им. В. М. Горбатова, консервированное тушеное конское мясо (произведенное по ГОСТ-Р54 033−2010) было приобретено в одном из супермаркетов Москвы.
В типичных экспериментах 100 мг измельченного образца гомогенизировали в 2 мл в системе тефлон-стекло в лизирующем растворе следующего состава: 9 М мочевины, 5% меркаптоэ-танола, 2% тритона Х-100, 2% амфоли-нов рН 3,5 — 10. Полученный гомогенат осветлялся центрифугированием при 800 g 5 мин и надосадочную фракцию, содержащую солюбилизированные белки (экстракт), использовали для фракционирования. При проведении протеомного анализа в иммоблиновом градиенте рН (IPG-PAGE) использовался лизирующий раствор, содержащий 9 М мочевины, 4% CHAPS, 2% амфоли-
УДК 637. 5'-61:547. 964.4 Ключевые слова:
конина, протеомика, мышечные белки, биомаркеры.
нов рН 3,5−10 и 0,6% дитиотрейтола.
В качестве основных протеомных технологий применяли двумерный электрофорез по OTarrell с изоэлек-трофокусированием в амфолиновом (IEF-PAGE) или иммобилиновом (IPG-PAGE) градиентах pH- последующую детекцию белков проводили окрашиванием Кумасси R-250 и азотнокислым серебром, как описано ранее [6].
Идентификацию белковых фракций на ДЭ осуществляли после трипсино-лиза методами MALDI-TOF MS и MS/ MS масс-спектрометрии на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия) с УФ-ла-зером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500−8000 Да с калибровкой их по известным пикам аутолиза трипсина. Анализ полученных масс-спектров триптических пептидов выполняли с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint («Matrix Science», США), с точностью определения массы МН+ равной 0. 01%, осуществляя поиск по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
При сравнительном анализе про-теомных профилей образцов конины и консервированного тушеного конского мяса с другими видами мясного сырья использовали информационные
модули «Белки скелетной мышцы коров (Bos taurus)» и «Белки скелетной мышцы свиньи (Sus scrofa)» базы данных «Протеомика мышечных органов» (http: //mp. inbi. ras. ru).
Результаты и обсуждение
Фракционирование двумя модификациями двумерного электрофореза с изоэлектрофокусированием в амфоли-новом (IEF-PAGE) или иммобилиновом (IPG-PAGE) градиентах pH белковых экстрактов из образцов конины (Рис. 1 А, Б, В) обеспечило получение до 130 белковых фракций при окраске Кумас-си R-250 и более 300 — азотнокислым серебром, количество которых автоматически определяли на цифровых изображениях двумерных электрофо-реграмм (ДЭ) с помощью программы ImageMaster 2D Platinum версия 7 («GE Healthcare», Швейцария), как описано ранее [6].
Белковые фракции, выявленные при анализе образцов конины, располагались в широком диапазоне молекулярных масс (Мм) и изоэлектрических точек (pI), причем большинство из них обладали Мм со значениями в диапазоне от 10 до 95 кДа. В целом, протеом-ные профили белков конины оказались сходными с профилями других видов мясного сырья. Так, на Рис. 1 Г, в качестве примера, представлена типичная ДЭ белков говядины, которая была получена двумерным электрофорезом в модификации IEF-PAGE (окраска Кумас-си R-250), а на Рис. 2 — фрагменты ДЭ разных видов мясного сырья, содержащие важные компоненты актомиозиного комплекса — тропомиозиновые белки (ТРМ) и миозиновые легкие цепи (МЛЦ).
Определенным подтверждением существующего сходства стали результаты масс-спектрометрической идентификации семи белковых фракций на ДЭ конины (показаны на Рис. 1а фракции 1а-7а). В таблице 1 суммированы материалы идентификации указанных фракций, свидетельствующие, в частности, о соответствии пяти из них с аналогичными белками, идентифицированными при протеомном анализе образцов говядины. Полные сведения
Рисунок 1. Результаты протеомного анализа белков конины и говядины. Красными овалами выделены фракции, принадлежащие тропомиозиновым белкам, а зелеными — миозиновым легким цепям.
А — фракционирование белков конины двумерным электрофорезом, модификация IEF-PAGE, окраска Кумасси R-250, стрелками и номерами (1а-7а) обозначены фракции, идентифицированные MALDI-TOF MS (см. Таблица 1), по левому краю ДЭ расположены белки-маркеры молекулярных масс, значения которых даны в кДа Б — фракционирование белков конины двумерным электрофорезом, модификация IEF-PAGE, окраска азотнокислым серебром.
В — фракционирование белков конины двумерным электрофорезом, модификация IPG-PAGE, окраска Кумасси R-250.
Г — фракционирование белков говядины двумерным электрофорезом, модификация IEF-PAGE, окраска Кумасси R-250 IPG-PAGE, стрелками и номерами (1−51) обозначены фракции, идентифицированные MALDI-TOF MS (см. информационный модуль «Белки скелетной мышцы коров (Bos taurus)» в общедоступной базе данных «Протеомика мышечных органов», интернет-адрес: http: //mp. inbi. ras. ru).
обо всех белках говядины, которые показаны на Рис. 1 Г (фракции 1−51), имеются в информационном модуле «Белки скелетной мышцы коров (Bos taurus)» общедоступной базы данных «Протеомика мышечных органов» (http: //mp. inbi. ras. ru).
Как видно из Таблицы 1, идентификация всех семи белков конины была осуществлена по сведениям, полученным при изучении соответствующих транскриптов лошади или генов, выявленных в геноме Equus саЬа!^. Хотя среди идентифицированных белков
Таблица 1. Результаты масс-спектрометрической идентификации (MALDI-TOF М^) семи белковых фракций на ДЭ конины и данные о аналогичных белках говядины (серым цветом выделены белки, для которых не оказалось аналогов среди белков говядины
БЕЛЕН жзяшны Бншипвцршы
Ншер на РНЕ-I, А НдУгнщПНЕ беощ, НЕЕСПО- pHfi Г. Н rfWi м iJH (логая янн) I loitrpi в Рпк tnNCm s/м/ С** Мы/pi Номф на Рис I Г Ннн1И1Л1ДПР белц, наше-(сингмаш) S/MJ С**
1а Мшнвшш! лошцшь 2 рн-уширил шечвжк СУШ5*)* 194 219 044 209/ 58/95 19,0/ 4J81 2S Мизндти кпаюш^ роупжгорнжя ¦-¦^ш^штМ-IIIWIMB QaSLPF) 295/ 28/78
2а Фрагмент С-конпевой последовательности гипотетического белка (локус LOCI 147 688) 194 214 317*** 259/ 45 ! 30 57.5 / 918****
За Мшишаим ШППШШ Ш, кпффпМЬЫ СИШГ 33S725579*** 216/ 25/87 17J0/ 4,79 22 Мнзппвш ¦ншшш 1/3, нэофарш MLC3 (АОХ/)* 173/ 17/70
4а Миозиновая легкая цепь 3 CMHJ)* 149 728 704 266! 39! 90 22,3/ 5. 02
5а Глуншюв- S- трансферта, взофсрвМюЛ, ищрбнам (GSTMiy* 147 708 716 354/ 36/86 25,7/ 8,20 41 Гжугагиан S трансфер!" Р (GSTPT) 329 /7 /66
ба Трнзэафосфщи-эгакржи (ТР11У* 194 211 639 380/ 28/75 30,6/ 6Д5 41 Трпнпфпф- ТНЭ (9КрЖи (ТРИ)* 164/ 19/77
7а Трнзаафосфщи- э (я"раза, взо- ФчвнСПР/Я* 194 211 629 176/ 23/69 30,6/ 6Д5
* Предсказаны по транскриптам или генам.
** S / M/ C — традиционные показатели идентификации, принятые в англоязычной литературе: Score — показатель соответствия или «счет очков" — Match peptides -количество совпавших пептидов- Coverage — % покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами.
*** эти записи удалены при создании обобщенной аннотации генома Equus caballus, но они имеются в предыдущей версии базы данных Protein NCBI. **** расчет показателей Мм/pI сделан по предсказанной аминокислотной последовательности по записи, удаленной из последней версии базы данных Protein NCBI.
были, например, миозиновые легкие цепи (МЛЦ), относящиеся к наиболее представленным мышечным белкам, прямые исследования даже таких белков у лошади оказались крайне ограниченными. Так, с помощью библио-метрического анализа в базе данных РиЬМЫ удалось обнаружить только одну публикацию, в которой сообщалось о миозиновой легкой цепи 3, выявленной в биоптатах мышц лошади протеомными технологиями и идентифицированной по сходству с соответствующим белком человека [7]. Таким
образом, большинство представленных результатов протеомного анализа белков конины можно считать новыми.
При этом особого внимания, по нашему мнению, заслуживают данные, полученные при идентификации фракции 2а. Биоинформационный анализ масс-спектра триптических пептидов, выполненный с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint („Matrix Science“, США) показал, что из 20-ти наиболее вероятных белков — кандидатов только один относится к лошадиным белкам, а именно это так
называемый гипотетический белок, предсказанный по нукпеотидной последовательности соответствующего гена (Таблица 2, выделен красной рамкой). Хотя у данного гипотетического белка предполагается молекулярная масса ~ 57 кДа, а белок фракции 2а существенно меньшего размера (~ 16,5 кДа), но в ходе проведенного исследования оказались только пептиды соответствующие участку полипептидной цепи из 372−530 аминокислотных остатков. Иными словами, можно думать, что удалось выявить С-концевой фрагмент данного гипотетического белка, и Мм этого фрагмента оказалась ~ 17,0 кДа. Надо отметить, что с началом постгеномной эры изучение гипотетических белков стало одним из весьма актуальных направлений в биохимии [8]. Соответственно, белок фракции 2а представляет значительный интерес с этой стороны.
С другой стороны, 17 из 20-ти белков кандидатов были охарактеризованы как миозиновая регуляторная легкая цепь 2 различных млекопитающих и других животных, а именно изоформа, характерная для желудочков сердечной мышцы (Таблица 2). Правда, большинство из этих белков — кандидатов оказались предсказанными по транскриптам, но показатели идентификации являлись достаточно высокими. Особенно надо отметить идентификацию по прямым данным о соответствующем белке домашней собаки (canis lupus familiaris). Показатели S / М / С (см. примечание к Таблице 1) в данном случае соответствовали 217 / 31 / 66. При этом электрофоретиче-ские свойства фракции 2а практически совпадают со свойствами других миозиновых регуляторных легких цепей 2 (Рис. 2). Таким образом, можно предположить, что фракция 2а — это миозиновая регуляторная легкая цепь 2 лошади, изоформа, характерная для желудочков сердечной мышцы, и полученный результат является первым прямым сообщением об указанном белке.
Надо отметить также, что среди белков конины была идентифицирована ещё одна изоформа миозино-
Таблица 2. 20 наиболее вероятных белков — кандидатов выявленных по результатам биоинформационного анализа масс-спектра триптических пептидов фракции 2а (Рис. 1 А).
index
Results List
AltCCJIT 1& lt-Л1
1.: ri I 504 171 542
2, TI |ддги& quot-жо л. iii |. чядинн"-а
gj jH*2nllT i- Дi bT1396S6g I. iri H1S5115I6 Т. gi
i. fljJMjgMjl i. ^щпрт-*]*
С .J LI 14 335
i. au5M333i
I. ji нзвзяпд? 3. if LI 504 663 225 A- ?IIJilZMmij
5. nijaiiagnas
6. j! jSUJdIIJl
i. ?л тле^гн
i. I^MBWiH
is. aij^awnui
:o л |2slii?7: ?
Uni
18 919 18 909
Scure Diitirb etiati
271 PBLELICTED: ilyssir regulatory light cr. ain J. 1TI PREDICTED: ПДОЭШ ГСЦИМОГУ lljit с!& quot- a IT! 2,
_Z2J_^СТТ. ТГГГП: iry^ain г l^.i 1 Л- fi& quot- ^ lj^lC f: Kj i n J J
veutricnlar/cardiac ¦rle isiforn rOchutcaia prir: ceprl vtitrlfrjlar/carainc tukI* isoEorn lioloim XI [Ictlfloeyi udEMUiiitul „& quot-'-Ч'-1 navffji'-fli if leafom ГСЫЫЙИНа lailutta]
S1S41 219 IEtEDICTED: hjpDtSietical protciu WCIOIH-ШМ [iquua caballu=]
I6ID6 239 PREDICTED: Ki'-isiTi regilau5: y llihc chali 2, TiitrKyjlar/caiiJLac nuscle i& amp-aConi [IilChecbus nanatua lidiasen*]
1SI9I 23t PEXEICTED: aycain rtq-ilaiDry light cr. a iji 2j veutricular/cardiac nurrle isoEam [CeratotberrjiL Tiarjn. ji. -jl"-
1IS65 J31 PREDICTED: Hyojljl TIVJ-. I]a-tiiy light Chi 1T1 1, vnitrlaileE^CUdiw wycl“ l *& gt-rnni-11 Ir [Orycwlnus -jiii n: 1-.1 j |
1S90? 233 PREDICTED: nyidiTi reaulHory lij. lt rbain Z, nur lealu/cnrfiM nusele ijocai» UofniM XJ f? fe i ei- -a alaieiL
lutl 333 PREDICTED: nyoiHl Tpq-Jliinry light ci-. am J, '-. TTiLrKrj I ar. '-cardi nc WKl- isnmrn [ftlu CStltf]
lfTs- 215 RtcJf-ane: FjIL=ujC3?L legulatory llgbt ciuib 2, sEJLCiACuLai/ciidlie mjscLe isuio: «- Eticni^ULC-Z: J1™-=?LC-1 v
1S891 ?17 ayzair. raq'-jiatiiy light cham 2. imaele iiiEcn-. [Cacii lupus Eamliaris]
liS5? 217 PREDICTED! nyosm renJlMory Lijuc chain 2, iJiiarlcrjUr/ciraiac iwjcle i soten» [Disypufl no^irciDscjfJ
IESTJ 219 PREDICTED- ayuaii] rrjJilKf lijhL ch. niji Jj HlIUitfu/"llll" ma-le isctcin ijaEeim II [OetadSL dejuaJ
I0j99 2It9 fuEDICTED: h^dsiti light diadn 2, HDtrliHtie/cciduc nuiclc iroCoTD «ofDTn K1 [-Het. rr^r?Fhniji gintcr!
1364L 2C5 PEICICTED! n^'-DBlii legUibiy light cbaln? j vanxmiu^cmUn: itiscle iBoCora: Halela pluiiiue IjiuI
j L j PEL? DICTED: ryzai. r re^'-ilutDry light chaiu JH ven i 11 mler/cardi ac nizili isoEani Cavu parctlluaj
15I6E 2M PREDICTED! WD3ln njuu^oiy UCht cbain 2, YintrlcjlAr/cirdlnc luaclc isoCsm [^tolcnrjx caintidl]
1EII2 13S DIETED- ayDUs req'-iilAtDry lifhL cbaiu Jj TCHtricdlar/caLdiajc ---i'--'--n. idafu^m SU ?2aj tai-'-jrl
IST^I 149 Hyoam req& quot-jlatDTy lighr chjiin 3 °F n. iffjitri (rjlai/cirdiac imaclc iac? unar partial [tea grur. Tiieca ikjlui]
1991D 135 b-Tietba^lc-il p: atelE PM1DA JOPEE n? AllU-upuld aalaMUauetj_
вых легких цепей — предсказанная по транскрипту миозиновая легкая цепь 3, которую кодирует ген MYL3. Интересно, что эта изоформа МЛЦ не детектировалась среди белков говядины, но была ранее обнаружена среди белков свинины (Рис. 2).
В целом, можно сделать заключение, что идентифицированные белки семейства МЛЦ, а также некоторые, не идентифицированные пока белковые фракции, но с соответствующими электрофоретическим характеристикам, составляют достаточно специфичные паттерны (Рис. 2). В каждом из приведенных паттернов отмечаются характерные качественные и/или количественные особенности. Например, среди белков говядины выявлена изоформа МЛЦ, кодируемая геном MYL6 (детали в информационном модуле «Белки скелетной мышцы коров (Bos taurus)» общедоступной базы
Рисунок 2. Фрагменты двумерных элек-трофореграмм, содержащих тропомио-зиновые белки и белки семейства МЛЦ, которые были получены при протеом-ном анализе образцов конины (А), консервированного тушеного конского мяса (Б), говядины (В), свинины (Г), курятины (Д) и индюшатины (Е). Идентифицированные изоформы МЛЦ обозначены символами соответствующих генов и зеленым шрифтом, а тропомиозиновые белки — красным шрифтом. Остальные обозначения такие же, как на Рис. 1.
данных «Протеомика мышечных органов», http: //mp. inbi. ras. ru). Более того, тропомиозиновые и МЛЦ белки удалось выявить при протеомном анализе консервированного тушеного конского мяса (Рис. 2Б). Из представленных данных, очевидно, что белки семейства МЛЦ в сочетании с тро-помиозиновыми белками можно рассматривать как систему биомаркеров,
пригодных для анализа разных видов мясного сырья и мясных продуктов, содержащих конину.
Таким образом, проведенные протеомные исследования можно рассматривать как основу для дальнейшего изучения мышечных белков конины и различных мясных продуктах, изготовленных с её использованием. |
КОНТАКТЫ:
Ярослав Сергеевич Манюхин Ирина Михайловна Чернуха +7 (495) 676−72−1 1 Алексей Викторович Иванов Марина Анатольевна Ковалева Сергей Сергеевич Шишкин Леонид Иванович Ковалев + 7 (495) 952-58-86
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1.
2.
3.
4.
5.
6. 7.
8.
Lorenzo JM, Sarries MV, Tateo A, Polidori P, Franco D, Lanza M. Carcass characteristics, meat quality and nutritional value of horsemeat: a review. // Meat Sci. 2014 Apr-96(4): 1478−88. doi: 10. 1016/j. meatsci. 2013. 12. 006. http: //foodinformer. ru/products/myaso/polza-i-vred-koniny http: //www. abcslim. ru/articles/881/konina/
Pomares C, Ajzenberg D, Bornard L, Bernardin G, Hasseine L, Darde ML, Marty P. Toxoplasmosis and horse meat, France. // Emerg Infect Dis. 2011 Jul-17(7): 1327−8. doi: 10. 3201/eid1707. 101 642
Whiting TL. The United States'- prohibition of horsemeat for human consumption: is this a good law? // Can Vet J. 2007 Nov-48(11): 1173−80.
Ковалев Л. И., Шишкин С. С., Ковалева М. А., Иванов А. В., Вострикова Н. Л., Чернуха И. М. Протеомное изучение белков
в образцах свинины и выработанных из нее мясных продуктах. // Все о мясе 2013, № 3, С. 32−34.
Bouwman FG, van Ginneken MM, van der Kolk JH, van Breda E, Mariman EC. Novel markers for tying-up in horses by proteomics
analysis of equine muscle biopsies. // Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics. 2010 Jun-5(2): 178−83. doi: 10. 1016/j.
cbd. 2010. 03. 009.
Lubec G, Afjehi-Sadat L, Yang JW, John JP Searching for hypothetical proteins: theory and practice based upon original data and literature. // Prog Neurobiol. 2005 Sep-0ct-77(1−2): 90−127.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В. М. Горбатова Россельхозакадемии
Более В О лет ВнИИМП и-v к м. Сорбдгдндвляетш ведущей научной оргвни^адиен млсной атрии еоБлвгти оав-рвботки фундаментальна * и прцкладнь ч проблем би-плргич, *vivhh чяса, tixhwh и технологии производств- мяса и мясопродуктов, переработки побочного сырья.
Институт прелагает следующие услуги:
* всестороннее гааопитенкн гок^лйтаггЛвое сопровождение првдп рияти u м. ксоперерзбЕтыв- юц=5 стграсп и,
* ипнкимак зг-спер-иэв и арбитражный контроль йога видов пищевой продукции, убавок, матери злое и ннфедин-ггав-
* ризрабсти и анедрен ие в производство у ника. пьнык продуктов питан ий и текнологин-еск ик рени. чоэ в соответствии с требованиями заказчика-
«проведение работ го отбора и тестированию сенсорной чувствительности соттрудникоЕ предприятии и формированию группы дегустаторов дпй срганолептической оценки мясной продукции
* выполнение проекты* работ то строите. -ьстпу нозык и реконструкции действующих клясоперерабэтывзюцкк предприятий, предприятий по первичной переработке скота, предприитий по выпуску (лнш н мйсораститыь-нын консервов, произоод-ственных лабораторий на п редпринггий^ заводов по утилизации биологически* отводов,
* немвнсимая э -: -ла р-н ач оцен ка проектов ~ ред- рилтий пншевой отрасли-
* подгоноака к аведеник и сертификаиия предприятий на соответс-в"е системе обеспечения безопасности и управлении качеством е системе добровсл ь"ой сертификации XMlCiI-MflЩ. SMWTOCI Р Ы7Й5. 1, I OLI J1 ИСО? JCIC 1. ОС. ^ HL J?? O'-.Y.s. 5-
Институт также занимается обучением и повышением квалификации специалистов и руко& amp-чдинелей чясоперерабать ранних предприятий, как на собстве ннсй на^и о-техныческой база. так и на базе компан пи каз& gt-. икз.
Всю интересующую вас информации йь монете найти на нашем, сайте lvLvw. ,* inp. ru. Ответы на псе интересующие ваг вопросы вы можете получить на форуме www. vi (np. ru/farusn.
ШУ flcipuctiiucKiiu вдуиго-йсстеЛтг^рльскии- ijtioniATiym W^TOU Адрес I ИЗ li? MG-C/ют. jit. Tavamimjtro. itif
brtfintvuf*-Jfttf ii*i H JM. i^rtm^vi A3 Ахло^.м iifciirtpчиш III-.- + 3}57i-IB ?!. -Zir.:. + TTiiiifJi ¦ П5Т1, p^mnift рсймч/пр fit? i?f& amp-itt>-rWAftp т

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой