Изучение кинетики взаимодействия ДНК сионамимеди

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 577. 323, 544. 174. 7
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 1 (59). 2014. Вып. 4
С. В. Пастон, П. А. Ушков
ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК С ИОНАМИ МЕДИ*
Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199 034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7−9
Методом кругового дихроизма (КД) в УФ-диапазоне проведено исследование взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами меди в растворе. Ионы металлов играют ключевую роль в функционировании ДНК в клетке. Известно, что ионы переходных металлов способны связываться как с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК, так и с азотистыми основаниями. В данной работе изучали второй тип связывания. Комплексообразова-ние катионов меди с азотистыми основаниями приводит к существенным изменениям в спектре КД ДНК: с ростом концентрации Cu2+ наблюдается снижение интенсивности положительного максимума, а также батохромный сдвиг точки Де = 0. Обнаружено, что насыщение связывания наступает при молярном соотношении [азотистые основания]: [Cu2+] = 2,4. Равновесие в системе устанавливается через 3 ч после смешивания компонентов. Биб-лиогр. 10 назв. Ил. 5.
Ключевые слова: ДНК, ионы металлов, круговой дихроизм.
S. V. Paston, P. A. Ushkov
KINETICS OF DNA INTERACTION WITH COPPER IONS
St. Petersburg State University, 7−9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199 034, Russian Federation
A study of DNA interaction with divalent copper ions in a solution was carried out with the aid of UV circular dichroism (CD). Metal ions play the key role in DNA functioning in a cell. It is well known that there are two types of DNA complexation with transition metal ions — through the negatively charged phosphate groups and through the nitrogenous bases. We investigated the second type. Complexation of copper ions with nitrogenous bases leads to the significant alterations in the DNA CD spectrum: the decrease of positive maximum and bathochromic shift of Де = 0 point are observed at the Cu2+ concentration rise. The experiment has shown that satiation occurs at the molar ratio [bases]: [Cu2+] = 2.4. The equilibrium is formed in 3 hours after the components mixing. Refs 10. Figs 5.
Keywords: DNA, metal ions, circular dichroism.
Введение. Взаимодействие биологических макромолекул с ионами металлов играет важнейшую роль в функционировании клетки. Молекула ДНК является полиэлектролитом, и при нейтральном рН её фосфатные группы заряжены отрицательно. Известно, что ионы щелочных и щелочноземельных металлов взаимодействуют в основном с фосфатными группами двухцепочечной ДНК, а ионы переходных металлов могут взаимодействовать как с фосфатными группами, так и с азотистыми основаниями по эндоциклическим атомам азота [1, 2]. В результате комплексообразования катионов с ДНК в растворе происходят значительные конформационные изменения на уровне вторичной и третичной структуры макромолекулы: снижение удельного объёма и оптической анизотропии ДНК, а также спектральные изменения [2−4]. Связывание с катионами щелочных и щелочноземельных металлов сопровождается увеличением температуры плавления ДНК, тогда как комплексообразование с ионами переходных
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 13−03−1 192 и 12−08−1 134-а) а также СПбГУ (шифр проекта 11. 38. 644. 2013, номер госрегистрации 1 201 356 820).
металлов уменьшает термостабильность ДНК, что свидетельствует о нарушении её вторичной структуры [5−7]. В работах [2, 4] было показано, что наиболее вероятная позиция связывания ионов переходных металлов с основаниями в двухцепочечной ДНК — группа N7 гуанина.
Комплексообразование катионов с азотистыми основаниями приводит к характерным изменениям в спектрах кругового дихроизма (КД) ДНК [2, 4]: понижению интенсивности положительного максимума и сдвигу точки Де = 0 в длинноволновую область. По этим признакам можно следить за процессом взаимодействия компонентов в растворе ДНК, содержащем ионы переходных металлов. В работе с помощью метода КД проведено исследование комплексообразования ДНК с ионами Cu2+ в зависимости от времени и от концентрации катионов в растворе.
Материалы и методы. Использовали ДНК фирмы «Sigma» из тимуса телёнка молекулярной массой M = (10,5 ± 0,6) • 106 Да. Молекулярная масса ДНК определялась по значению характеристической вязкости (п) в растворе 0,15 М NaCl [8]. Использовали соли NaCl и CuCl2 марки х.ч. Концентрация поддерживающего электролита NaCl сохранялась постоянной во всех экспериментах (0,005M). Суммарная ионная сила исследуемых растворов увеличивалась с ростом концентрации Cu2+, но весьма незначительно (от 0,005 М до 0,006М). Подчеркнём, что, согласно [2], степень связывания ионов переходных металлов с азотистыми основаниями ДНК практически не зависит от ионной силы раствора.
Оптическое поглощение растворов ДНК измеряли на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Молярный коэффициент экстинкции ДНК, который позволяет судить о степени нативности макромолекулы [9], определяли по формуле
cm 31D260
?26О (Р)
0,099Cl'-
где D260 — оптическая плотность раствора ДНК при X = 260 нм- l — длина кюветы, см- 0,099 = 9,9% - процентное содержание фосфора в ДНК- 31 — атомный вес фосфора- C — концентрация ДНК в растворе. Использовали только те растворы, в которых 6000 М-1 •см-1 & gt- е260(Р) & gt- 6900 М-1 •см-1. Концентрацию ДНК в растворе определяли по методу Спирина [10]. Значение кругового дихроизма измеряли на ав-тодихрографе «Mark IV» (Jobin Yvon, Франция) и выражали в Де = eL — eR, где eL и eR — молярные коэффициенты экстинкции для лево- и правополяризованных компонент луча соответственно. Измерения проводили при 21 °C. Использовали кварцевую цилиндрическую кювету с длиной оптического пути 1 см. Концентрация ДНК составляла 0,004% = 1,2 • 10−4 Ма.о.
Результаты и обсуждение. Как уже упоминалось, комплексообразование катионов с основаниями можно наблюдать по характерным изменениям в спектре КД ДНК [2, 4]. Этот метод позволяет следить за изменениями на уровне вторичной структуры макромолекулы. На рис. 1 для примера показана одна из полученных в работе серий спектров КД ДНК в присутствии разных концентраций Cu2+ в растворе 0,005 М NaCl. Видно, что с ростом концентрации катионов меди интенсивность положительного максимума снижается и происходит сдвиг точки Де = 0 в длинноволновую область. На рис. 2, 3 обобщены изменения спектральных параметров ДНК в изучаемых системах. Видно, что при C (Cu2+) & lt- 0,5 • 10−4М наблюдается резкое снижение интенсивности положительного максимума и смещение точки Де = 0 в спектрах КД ДНК. При 0,5 • 10−4 М & lt- C (Cu2+) & lt- 2,5 • 10−4М спектральные параметры меняются слабо, что может свидетельствовать о насыщении связывания. Это соответствует соотношению
Де, М-1см-1 4-
-2
220 240
260 280 Я, нм
300
Рис. 1. Спектры К Д ДНК при разных концентрациях Си2+ в растворе, М:
0 (1) — 10& quot-5 (2) — 2,5 • 10& quot-5 (3) — 5 • 10& quot-5 (4) — 7,5 • 10& quot-5 (5) — 10& quot-4 (6) — 2,5 • 10& quot-4 (7)
Де275, М 1 см 2,4−1
2,0 1,61,20,8 0,4
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 С (Си2+), 10−4М
2,5
Рис. 2. Зависимость интенсивности положительного максимума в спектре КД ДНК от концентрации Си2+
Я (е = 0), нм 266
264
262
260
258
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 С (Си2+), 10−4М
Рис. 3. Зависимость положения точки Де = 0 в спектре КД ДНК от концентрации Си2+
концентраций взаимодействующих компонентов [ДНК]/[Си2+] = 2,4, т. е. в среднем 1 катион на 2,4 азотистых основания. Подчеркнём, что здесь имеется в виду не количество связанных катионов, а общее количество связанных и свободных катионов в растворе.
2
0
Результаты вискозиметрических исследований [2, 3] показывают насыщение связывания ДНК с катионами Си2+ при эти результаты отражают изменение объёмных эффектов в макромолекулярном клубке ДНК, которое вызвано экранировкой отрицательно заряженных фосфатных групп двухвалентными катионами меди независимо от их места связывания [3]. Таким образом, в спектральных и вискозиметрических исследованиях по-разному наблюдаются проявления двух типов связывания ДНК с катионами Си2+: по снижению удельного объёма ДНК можно судить о связывании катионов с макромолекулой по любым позициям [3], тогда как наблюдаемые изменения в спектрах КД ДНК вызваны комплексообразованием ионов с азотистыми основаниями [2].
Мы попытались проследить кинетику второго типа связывания. Для этого проводили измерения спектров КД ДНК в растворе через разное время после добавления раствора СиСЬ. Конечные концентрации компонентов в растворе были следующие: СДНК = 0,004%, С (СиС12) = 1 • 10−4М, С (ШС1) = 0,005 М. Конечная концентрация СиС12 лежит в области насыщения связывания с азотистыми основаниями. Полученные зависимости спектральных параметров от времени показаны на рис. 4, 5. Смешивание компонентов проводилось в кювете непосредственно перед измерением спектра. Регистрация спектра КД занимает 2 мин, так что погрешность ДЬ первой точки на рисунках довольно велика. При Ь & gt- 2 ч растворы хранились при +10 °С.
Рис. 4. Зависимость интенсивности положительного максимума в спектре КД ДНК от времени после добавления в раствор ОиО^
Де, М-1см-1 1,6-,
2 10 100 1000 г, мин
Рис. 5. Зависимость положения точки Де = 0 в спектре КД ДНК от времени после добавления в раствор ОиО^
X (е = 0), нм 268-
266 264 262 260 258 256
10
100 г, мин
1000
10 000
1
Видно, что сразу после добавления ионов меди в раствор начинаются резкие изменения в спектре КД ДНК, которые можно объяснить связыванием азотистых оснований с катионами Cu2+. Приблизительно через 3 ч после смешивания компонентов скорость изменения спектральных параметров становится существенно меньше — система приближается к равновесию. В дальнейшем спектральные параметры ДНК в данной системе не претерпевают заметных изменений за время порядка недели. Более длительное выдерживание подобных систем приводит к постепенному нарушению вторичной структуры ДНК. Как уже упоминалось, существуют литературные данные о том, что связывание ионов переходных металлов с ДНК приводит к дестабилизации вторичной структуры макромолекулы [5−7].
Таким образом, удалось проследить кинетику комплексообразования катионов меди с азотистыми основаниями ДНК. Равновесие в растворе наступает через 3 ч после смешивания компонентов.
Литература
1. ЗенгерВ. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М., 1987. 584 с.
2. Касьяненко Н. А., Дьяконова Н. Е., Фрисман Э. В. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами металлов // Молек. биология. 1989. Т. 23. С. 975−982.
3. Касьяненко Н. А. Конформационные изменения молекулы ДНК при её взаимодействии с биологически активными соединениями. I. Влияние катионов металлов на конформацию молекулы ДНК в растворе // Журн. структурной химии. 2006. Т. 47, № 1. С. 163−169.
4. Polyanichko A. M., Andrushchenko V. V., Chikhirzhina E. V. et al. The effect of manganese (II) on DNA structure: electronic and vibrational circular dichroism studies // Nucleic Acids Research. 2004. Vol. 32, N 3. P. 989−996.
5. Благой Ю. П., Сорокин В. А., ВалеевВ.А. Спектральное исследование связывания оснований ДНК с ионами магния и кальция // Молек. биология. 1980. Т. 14. С. 595−605.
6. Воскобойник А. Д., МонаселидзеД. Р., Мгеладзе Г. Н. и др. Исследование плавления ДНК в области относительной инверсии относительной стабильности AT- и ГЦ-пар // Молек. биология. 1975. Т. 9. С. 783−789.
7. Tan Zh. -J., Chen S. -J. Nucleic acid helix stability: Effects of salt concentration, cation valence and size, and chain length // Biophysical J. 2006. Vol. 90. P. 1175−1190.
8. EignerJ., Doty P. Native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid //J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 549−580.
9. Кантор Ч., ШиммелП. Биофизическая химия: в 3 т. М., 1984. T. 2. 496 c.
10. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. С. 656−662.
Статья поступила в редакцию 1 июля 2014 г.
Контактная информация
Пастон Софья Владимировна — кандидат физико-математических наук, доцент- e-mail: svpaston@list. ru
Ушков Павел Александрович — аспирант.
Paston S. V. — Candidate of Physics and Mathematics, Associate Professor- e-mail: svpaston@list. ru
Ushkov P. A. — post-graduate student.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой