Изучение возможности направленной доставки липосомальных препаратов в органы и ткани макроорганизма

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

© Коллектив авторов, 2008 УДК 577. 125:616. 951−084
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОРГАНЫ И ТКАНИ МАКРООРГАНИЗМА
Д. В. Ефременко, Т. В. Таран, А. С. Кочарян, Т. М. Головинская,
И. В. Кузнецова, А. М. Бабий, А. А. Ефременко Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Вопросы доставки лекарств непосредственно в пораженные органы, ткани и клетки макроорганизма в настоящее время актуальны для фармакологической индустрии. Особое внимание уделяется разработке путей и средств доставки известных лекарственных препаратов с помощью липосом, а также механизмам их взаимодействия с биологическими объектами [1]. Так, обычно большая часть содержимого липосом поглощается клетками печени и селезенки путем эндоцитоза носителя, который заканчивает свой путь в лизосомальном аппарате. Интенсивность захвата может изменяться в зависимости от размера, поверхностного заряда и состава липосом. Таким образом, липосомы особенно привлекательны как средство направленной доставки препаратов во внутриклеточную среду органов ретикуло-эндотелиальной системы, в частности, в купферовские клетки (звездчатые ретикулоэн-дотелиоциты) печени и макрофаги селезенки, которые являются основными областями конечной локализации липосом [3]. Способность бислойных липидных везикул при определенных условиях преодолевать желудочно-кишечный барьер, сохраняя нативность иммобилизованных в них веществ, создает возможность введения многих ли-посомальных препаратов перорально. Введение в состав липидных везикул холестерина повышает их стабильность в желудочно-кишечном тракте, что предотвращает гидролиз иммобилизованных в липосомы препаратов. Целостность мембраны липосом нарушается в присутствии желчи, однако, добавление белка или фосфолипидов к суспензии стабилизирует их, предотвращая разрушение. Если липиды, из которых готовят липо-сомы, выделены из каких-либо органов и тканей, то способность бислойных везикул соединяться с их клетками значительно возрастает, так как каждому типу мембран соответствует определенное, характерное только для него соотношение полярных липидов. Липиды в какой-то степени определяют узнавание клеток.
Была поставлена цель изучения возможности на-
правленной доставки липосомальных форм препаратов в органы и ткани макроорганизма, имеющие клетки ретикулоэндотелиальной системы, для чего был использован бычий сывороточный альбумин (БСА) в свободной и липосомальной формах, распределение которого изучали в организме опытных животных белых мышей.
Материал и методы. Одним из способов изучения распределения липосомальных форм препаратов в макроорганизме является использование в качестве маркера радиоактивного препарата йода-125. В эксперименте использовали йодид натрия йод-125 ФГУП НПО «Радиевый институт им. В.Г. Хлопина» Федерального агенства по атомной энергии с паспортной активностью основного радионуклида 40 МБк, объемной активностью 1000 МБк/мл, рН 10. Необходимыми предпосылками для мечения белков и пептидов йодом-125 является присутствие в них тирозиновых или гистидиновых остатков аминокислот или наличие свободной аминогруппы [2]. Введение внешней метки йод-125 обычно используется при работе с белками и крупными пептидами, так как при этом способе маркирования можно получить соединения с высокой радиоактивностью.
В эксперименте использован хлорамин Т-метод -самый популярный метод мечения белков и полипептидов. Принцип реакции состоит в окислении йодида натрия с последующим электрофильным замещением атома водорода в тирозиновом или гистидиновом кольце.
В ходе эксперимента нами были использованы следующие материалы — фосфатидилхолин, холестерин, бычий сывороточный альбумин, йод-125, хлорамин-Т L-цистеин, сефадекс 0−25, трихлоруксусная кислота.
Для проведения реакции радиоактивного мечения БСА йодом-125 в пробирку отобрали 2 мкл 0,05 М натрий фосфатного буфера (НФБ) рН 7,4. Добавляли 2 мкл раствора БСА в 0,05 М НФБ рН 7,4 (содержание БСА 5 мкг в 2 мкл раствора). В ту же пробирку добавляли 4 мкл (4 МБк) йода-125. Для связывания белка с радиоактивным препаратом добавляли 2 мкл раствора хлорамин-Т в 0,05 М НФБ рН 7,4 (содержание хлорамина-Т 0,24 мкг в 2 мкл раствора). Через 10 минут для
И оригинальные исследования. экспериментальная МЕДИЦИНА
Таблица
Среднее содержание липосомального (опыт) и интактного (контроль) бычьего сывороточного альбумина на орган при пероральном введении в дозе 6,8 мкг на белую мышь
Орган или ткань Среднее содержание препарата (мкг на орган) и соотношение опыт/контроль по срокам вскрытия, ч
1 4 12 30
Кровь опыт 0,11±0,001 0,245±0,049 0,138±0,019 0
конт. 0,216±0,058 0,268±0,062 0,154±0,019 0,001±0,001
о/к 0,51 0,91 0,9 —
Печень опыт 0,059±0,01 0,045±0,006 0,022±0,007 0,08±0,002
конт. 0,043±0,014 0,035±0,007 0,016±0,005 0
о/к 1,37 1,29 1,38 —
Селезенка опыт 0,068±0,004 0,076±0,023 0,025±0,008 0,01±0,002
конт. 0,036±0,013 0,049±0,022 0,02±0,008 0,001±0,001
о/к 1,89 1,55 1,25 10
Желудок опыт 0,265±0,005 0,193±0,083 0,098±0,044 0,057±0,016
конт. 0,241±0,084 0,141±0,065 0,078±0,025 0,038±0,018
о/к 1,1 1,37 1,26 1,5
Легкие опыт 0,109±0,019 0,232±0,017 0,052±0,012 0,014±0,011
конт. 0,047±0,024 0,083±0,01 0,033±0,006 0,003±0,001
о/к 2,32 2,8 1,58 4,67
Кишечник с брыжеечным лимфоузлом опыт 1,004±0,134 0,386±0,183 0,318±0,095 0,112±0,039
конт. 0,879±0,178 0,245±0,025 0,126±0,018 0,077±0,011
о/к 1,14 1,58 2,52 1,45
Примечание. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили, используя программу MS Office Excel XP.
остановки реакции в пробирку помещали 2 мкл раствора L-цистеина в дистиллированной воде (содержание L-цистеина 0,48 мкг в 2 мкл раствора). На заключительном этапе добавляли 12 мкл элюирующего буфера с БСА (0,05 М НФБ рН 7,4 с 0,1% БСА).
Для определения процента связывания радиоактивной метки с белком из реакционной смеси отобрали в отдельную пробирку 1 мкл, добавляли 300 мкл элюирующего буфера с БсА (0,05 М НФБ рН 7,4 с 0,1% БСА). Из данного разведения отобрали 2 пробирки по 10 мкл, в каждую из них добавили по 200 мкл стабилизирующего буфера (0,1 М НФБ с 1% БСА). Измерили радиоактивность в этих двух пробирках на Y-счетчике колодезного типа. Активность в первой пробирке -5000 Бк (Т1). Активность во второй пробирке — 5000 Бк (Т2). Средняя активность в двух пробирках (Т1 + Т2)/2 = (5000+5000)/2) составила 5000 Бк (Тср). В каждую пробирку добавили по 200 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Центрифугировали пробирки при 2000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Надосадок удалили. Измерили радиоактивность осадка в пробирках. Активность осадка в первой пробирке — 3400 Бк (Т01). Активность осадка во второй пробирке — 3300 Бк (Т02). Средняя активность осадка в двух пробирках (Т01+Т02)/2 = (3400+3300)/2) составила 3350 Бк (Т0ср). Связывание радиоактивной метки с белком (Т0ср х 100/Тср = 3350×100/5000) составило 67%. Удельная активность реакционной смеси (внесенная активность (Бк) х коэффициент связывания радиоактивной метки с белком/количество внесенного белка (мкг) = 4 000 000×0,67/5) составила 536 000 Бк на 1 мкг внесенного БСА.
Для разделения йодированного белка и несвязав-шегося йода-125 был использован метод гель-хро-мотографии. Реакционную смесь нанесли на колонку, заполненную сефадексом 0−25. Собрали фракции по 1 мл в пробирки. Пик выхода меченого белка фиксировался двумя проточными детекторами, регистрирующими радиоактивность и наличие белка.
Дополнительно провели определение процента связывания белка в тех фракциях, в которых был зафиксирован пик выхода меченного БСА. С этой целью из каждой фракции в отдельные пробирки были отобраны по 10 мкл. В каждую пробирку добавили по 200 мкл стабилизирующего буфера (0,1 М НФБ с 1% БСА). Определение процента связывания белка провели по вышеизложенному методу. Во всех исследуемых фракциях связывание белка составило 98−100%. Эти фракции были объединены между собой.
В дальнейшем полученный радиоактивно меченный раствор белка был использован для приготовления липосомальной и свободной форм БСА.
Для приготовления липосомальной формы БСА, липосомы, полученные из фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 9: 1, приготовили методом ручного встряхивания. Смешали раствор радиоактивно меченного йодом-125 БСА с раствором БСА в 0,05 М НФБ рН 7,4. Полученный раствор иммобилизировали в липосомы. Затем для увеличения процента включения БСА в липосомы и стабилизации свойств полученного липосомального радиоактивно меченного препарата провели 6 циклов «замораживания-оттаивания». Конечная концентрация БСА в его липосомальной форме составила 6,8 мкг/мл, активность полученного раствора — 19 000 Бк/мл.
Для приготовления свободной формы препарата йодированный раствор БСА смешивали с раствором БСА в 0,05 М нФб рН 7,4. Конечная концентрация БСА в интактной форме составила 6,8 мкг/мл, активность полученного раствора — 19 000 Бк/мл.
В качестве экспериментальных животных были выбраны белые мыши. Для изучения распределения БСА в их организме были применены физико-химические, микробиологические, радиологические, патоморфологические методы.
Интактную форму БСА ввели перорально 45 белым мышам (контроль), по 1 мл на мышь.
Липосомальную форму БСА ввели перорально 45 белым мышам (опыт), по 1 мл на мышь.
Вскрыли по 5 контрольных и по 5 опытных мышей через 1ч, 2ч, 4ч, 8ч, 12ч, 18ч, 24ч, 30ч после введения препарата.
Взвесили кусочки органов экспериментальных животных (кровь, печень, селезенка, желудок, легкие. кишечник с брыжеечными лимфоузлами), измерили их активность на Y-счетчике колодезного типа для определения радиоактивности, рассчитали среднюю массу для каждого органа, удельную активность, среднюю удельную активность, активность целого органа, процент от введенной дозы, содержание БСА в органе, среднюю арифметическую и среднюю ошибку средней арифметической (по количественному содержанию белка на орган), соотношение опыт/контроль содержания белка на орган.
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили используя программу MS Office Excel XP
Результаты и обсуждение. Из данных таблицы видно, что максимальная концентрация липосомальной и интактной форм БСА в исследуемых органах и тканях экспериментальных животных наблюдалась через 1−4 часа после перорального введения препарата. При этом концентрация липосомальной формы БСА превышала концентрацию его свободной формы во всех органах и тканях имеющих клетки ретикулоэндо-телиальной системы (желудок, печень, селезенка, легкие, кишечник с брыжеечными лимфоузлами), тогда как в крови преобладало количественное содержание БСА в интактной форме, не обеспечивающей преимущественную тропность препарата к клеткам ретикуло-эндотелиальной системы. Время пребывания бСа в липосомальной форме в организме экспериментальных животных по сравнению со свободной формой также увеличивалось. Высокое содержание липосомальной и интактной форм БСА в желудке и кишечнике экспериментальных животных также связано с их участием в выделительной функции организма.
Таким образом, липосомальная форма БСА позволяет при введении в организм экспериментальных биологических моделей достигать больших концентраций содержания БСА по сравнению с интактной формой в органах и тканях, имеющих в своем составе клетки ретикулоэндотелиальной системы. Такой эффект достигается благодаря тому, что клетки ретикулоэндотелиальной системы являются мишенями для липосом и содержащихся в них веществ.
Заключение. На примере липосомальной формы БСА показана возможность направленной доставки различных препаратов, в качестве носителей которых будут использованы липосомы, в органы и ткани макроорганизма, имеющие клетки ретикулоэндотелиальной системы.
Литература
1. Васильев, А. Е. Наноносители лекарственных веществ / А. Е. Васильев // Новая аптека. — 2003. — № 1. — С. 21−23.
2. Вуд, У. Г. Теория и практика радиоиммуноанализа. Руководство для персонала лабораторных служб / У. Г. Вуд, Г. Соколовский. — Вена, 1981. — 232 с.
3. Ефременко, В. И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). / В. И. Ефременко. — Ставрополь, 1999. — 236 с.
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОРГАНЫ И ТКАНИ МАКРООРГАНИЗМА
Д.В. ЕФРЕМЕНКО, Т.В. ТАРАН, А.С. КОЧАРяН, т.м. головинская, И.В. КУЗНЕЦОВА,
А.М. БАБИЙ, А.А. ЕФРЕМЕНКО
Проведено изучение возможностей направленной доставки липосомальных форм препаратов в органы и ткани макроорганизма, имеющие клетки ретикулоэндотелиальной системы с использованием физико-химических, микробиологических, радиологических, патоморфологических методов.
Максимальная концентрация липосомальной и интактной форм бычьего сывороточного альбумина в исследуемых органах и тканях опытных животных наблюдалась через 1−4 часа после перорального введения. Концентрация липосомальной формы препарата превышала концентрацию свободной формы в органах и тканях, имеющих клетки ретикулоэндотелиальной системы (желудок, печень, селезенка, легкие, кишечник с брыжеечными лимфоузлами). В крови преобладало количественное содержание препарата в интактной форме, которая не обеспечивает преимущественную тропность к клеткам ретикулоэндотелиальной системы.
Таким образом, показана возможность направленной доставки различных препаратов, в качестве носителей которых использованы липосомы, в органы и ткани, имеющие клетки ретикулоэндотелиальной системы.
Ключевые слова: липосомы, клетки ретикулоэндотелиальной системы, направленная доставка, тропность
STUDYING OF THE OPPORTUNITY OF DIRECTED DELIVERY OF LIPOSOMAL PREPARATIONS TO MACROORGANISM ORGANS AND TISSUES
EFREMENKO D.V., TARAN T.V., KOCHARYAN A.S., GOLOVINSKAYA Т.М., KUZNETSOVA I.V. ,
BABIY А.М., EFREMENKO А.А.
Study of opportunities of the directed delivery of liposomal forms of preparations to organs and tissues of a macroorganism, having reticuloendothelial system cells with use of physico-chemical, microbiological, radiological, pathomorphological methods is carried out.
The maximal concentration of liposomal and intact forms of bull serum albumin in studied organs and tissues of experimental animals was observed in 1−4 hours after peroral introduction. Concentration of liposomal preparation form exceeded concentration of free form in organs and tissues having reticuloendothelial system cells (stomach, liver, spleen, lungs, intestines with mesenterium lymph nodes). The quantitative contents of a preparation in intact form which does not provide primary directivity to reticuloendothelial system cells prevailed in blood.
Thus, the opportunity of the directed delivery of various preparations, the carriers of which liposomes are used, to organs and tissues, having reticuloendothelial system cells, is shown.
Key words: liposomes, reticuloendothelial system cells, the directed delivery, directivity

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой