Изучение взаимодействия молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов в присутствии катехина, эпикатехина и кофеина

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

А. О. Пучкова, Н. А. Касьяненко
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЫ ДНК С ИОНАМИ ДВУХВАЛЕНТНЫХ МЕТАЛЛОВ В ПРИСУТСТВИИ КАТЕХИНА, ЭПИКАТЕХИНА И КОФЕИНА
Введение. Используемые в работе соединения — катехин, эпикатехин (стереоизомер катехина) и кофеин (рис. 1) представляют собой природные антиоксиданты, содержащиеся в чае, кофе, некоторых фруктах. Исследования последних лет на животных и в системах in vitro показали, что полифенолы чая проявляют антиоксидантную, антиканцерогенную, антимикробную и пробиотическую активность [1]. Употребление в пищу богатых флавоноидами продуктов способствует предупреждению развития сердечно-сосудистых заболеваний, раковых опухолей, воспалительных процессов [2−6]. Такая биологическая активность полифенольных соединений позволяет применять их в качестве лекарственных средств, причём некоторые катехины могут быть использованы как противоопухолевые препараты [7]. Растительное происхождение этих соединений выгодно отличает их от имеющихся высокотоксичных противоопухолевых лекарственных форм. Следует отметить важную особенность катехинов защищать генетический аппарат клетки от поражающего действия УФ- и ионизирующего излучений [8].
HO
OH
CH
OH
OH
Эпикатехин
Катехин
Рис. 1. Структура используемых в работе соединений
Кофеин, относящийся к пуриновым алкалоидам, повышает физическую и умственную работоспособность, снимает усталость, ускоряет процесс выведения жиров, мягко тонизирует и регулирует общий обмен веществ. Содержание кофеина в зёрнах кофе и листьях чая колеблется от 1 до 4% от сухой массы и может достигать 1500 и 350 мг/л соответственно. Стимулирующее действие на головной мозг кофеина связано с его способностью блокировать аденозиновые рецепторы клеточных мембран. Чем интенсивней работает клетка, тем больше в ней расходуется АТФ и накапливается аденозина, который оказывает тормозящую функцию, защищая нервные клетки от истощения при интенсивной работе [9]. На основе кофеина и ароматических фенаксазоновых антибиотиков проводится синтез противоопухолевых препаратов [10].
Таким образом, необходимость активного использования огромного потенциала биологически активных веществ растительного происхождения в медицине и для профилактики различных заболеваний не вызывает сомнений. Важно, что эти вещества содержатся в пищевых продуктах, это обеспечивает отсутствие серьезных побочных
© А. О. Пучкова, Н. А. Касьяненко, 2011
эффектов, затрудняющих применение даже самых эффективных лекарственных препаратов.
Катехин и кофеин обладают высоким сродством к ионам металлов. Связывание с ионами металлов может предотвращать их участие в окислительных реакциях. Действительно, существуют сведения о том, что повышенная концентрация биологически активных компонентов чая в организме приводит к ингибированию усвоения микроэлементов. В частности, кофеин является антиалиментарным фактором к Ca, Mg и Na.
Полифенольные соединения находят также свое применение при синтезе металлических наночастиц. Показано, что катехин, эпикатехин и другие биологические компоненты чая можно использовать как восстановители и стабилизаторы при создании золотых наночастиц [11]. Причем стабилизирующая оболочка из биофлаваноидов способствует проникновению наночастиц через мембрану раковых клеток. Кроме того, подобная модификация частиц снижает их токсичность. Данный метод получения наночастиц золота соответствует развиваемым в настоящее время принципам «зелёной химии».
Ионы металлов принадлежат к весьма распространённым в биологических системах и активным лигандам, влияющим на структуру ДНК [12]. Молекула ДНК в клетке и в растворе окружена водой, при этом она функционирует в виде полианиона, и для стабильности её нативной двуспиральной структуры необходимо присутствие определенной концентрации катионов. Вместе с тем при повышенном содержании ионов металлов в организме проявляются отрицательные эффекты. Ионы некоторых металлов в больших количествах являются сильными мутагенами и даже канцерогенами. Так, при избыточном содержании ионов магния, никеля и меди число мутирующих бактерий и бактериофагов увеличивается в сотни раз. Было показано, что образование злокачественных опухолей сопровождается увеличением содержания металлов в ДНК раковых клеток [13].
Молекула ДНК имеет несколько активных центров, координирующих ионы металлов. Прежде всего, это ионы кислорода фосфатных групп, несущие отрицательные заряды. Некоторые атомы азотистых оснований, выходящие в бороздки, также могут вступать во взаимодействие с ионами металлов. Наиболее благоприятной позицией для связывания положительных лигандов с основаниями ДНК является выходящий в большую бороздку седьмой атом азота гуанина.
Характер взаимодействия ионов металлов с различными сайтами связывания на ДНК определяется зарядом иона и строением его электронной оболочки. Ионы щелочных (Na+, Li+, K+) и щелочноземельных (Mg2+, Ca2+, Ba2+) металлов взаимодействуют преимущественно с фосфатными группами ДНК, а ионы переходных металлов Mn2+, Zn2+, Ni2+, и Cu2+ активно связываются также и с основаниями [15].
Цель работы заключается в анализе возможного влияния некоторых катехинов на взаимодействие молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов (Ni2+, Mn2+, Mg2+). Водные растворы ДНК в некоторых случаях являются удобной модельной системой для предварительного тестирования препаратов на биологическую активность. Так как содержание воды в живых системах велико, изучение водных растворов ДНК может дать информацию о характере структурных изменений макромолекулы in vivo.
В настоящее время известно, что присутствие ионов металлов в растворе вызывает изменение конформации ДНК, которое можно зафиксировать с помощью спектральных методов и вискозиметрии [12−14]. Рассматривая водные растворы ДНК, содержащие ионы металлов и катехины, можно сделать вывод о взаимном влиянии компонентов на их биологическую активность.
D
Я, нм
Я, нм
Я, нм
Рис. 2. Спектры УФ-поглощения кофеина (а), С = 1,4 • 10 4 М, катехина (б), С = 2 • 10~4M и эпикатехина (в), С = 2 • 10^^:
1 — в присутствии ионов марганца С = 1,04М- 2 — никеля С = 1,06М- 3 — магния С = 1,04М- 4 — в 0,005 М ^С1
Приборы и материалы. В работе использованы соединения: катехин, эпикате-хин, кофеин и высокомолекулярная тимусная ДНК фирмы Sigma, плазмидная ДНК PRS 425 (6000 пар оснований). Молекулярная масса тимусной ДНК (8 • 106 Да) была определена вискозиметрически. Использовали спектрофотометр СФ-56, автодихрограф «Mark 4» (Jobin Ivon), атомный силовой микроскоп «NanoScope 4a» (Veeco), низкоградиентный ротационный вискозиметр. В экспериментах концентрация ДНК составляла 0,001% для спектрофометрических, 0,008% для вискозиметрических исследований и 0,5% для атомно-силовой микроскопии. При металлизации ДНК использовали водные растворы 0,001 М катехина, 0,001 М гидрохинона и 0,002M AgNO3.
Результаты и их обсуждение. Изучали взаимодействие ДНК с ионами металлов в присутствии катехинов и кофеина. Спектры поглощения соединений в 0,005M NaCl представлены на рис. 2. Растворы готовили, добавляя необходимое количество раствора NaCl рассчитанной концентрации. Такая ионная сила была ранее использована при изучении взаимодействия молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов [14]. Спектры поглощения соединений не изменялись со временем при хранении растворов при комнатной температуре, что указывало на стабильность их состояния в рассматриваемых условиях.
Как отмечалось выше, используемые в работе соединения могут служить перехватчиками ионов металлов в живых системах. Данные, представленные на рисунке, свидетельствуют о том, что присутствие в растворе ионов никеля и марганца приводит к небольшому увеличению максимума спектра поглощения кофеина, спектр поглощения катехина изменяется в присутствии ионов магния, марганца и никеля, а спектр эпи-катехина — только в присутствии ионов никеля. На этом основании можно заключить, что происходит взаимодействие кофеина, катехина и эпикатехина с ионами металлов в растворе.
Ранее было показано, что молекула ДНК в растворе не взаимодействует с катехи-ном, эпикатехином и кофеином [8], тогда как двухвалентные ионы металлов связываются с макромолекулой, причём магний взаимодействует с фосфатными группами, а марганец и никель — с фосфатами и азотистыми основаниями (по группе N7 гуанина)
[12, 14].
Рис. 3. Спектры К Д ДНК: в 0,005M NaCl (1) — в сутствии ионов Mg (2), = 1,25 • 10~3M, Ni (3), = 1,25 • 10~3M, Mn (4), = 5 • 10~4M
при-
C =
C = C=
220
240
260 Я, нм
280
300
C ¦ 104, M
C ¦ 104, M
Рис. 4- Зависимость относительного изменения специфической вязкости раствора ДНК в 0,005M NaCl (а) и в тех же условиях в присутствии катехина (б), C = 5,3 • 10~6М от концентрации двухвалентных ионов Mg (2), Mn (3), Ni (4)
На рис. 3 приведены спектры КД ДНК в присутствии магния, марганца, никеля. Видно, что магний не влияет на спектральные свойства ДНК, а марганец и никель изменяют спектр ДНК, что отражает их взаимодействие с азотистыми основаниями макромолекулы.
Молекула ДНК является полианионом, поэтому её взаимодействие с заряженными двухвалентными ионами металлов должно приводить к уменьшению размеров молекулярного клубка из-за экранировки фосфатных групп. Действительно, специфическая вязкость раствора ДНК уменьшается с увеличением концентрации двухвалентных ионов С (Ме2+) (рис. 4, а). Этот рисунок демонстрирует, что изменение специфической вязкости (а значит, и объёма ДНК) для всех ионов сходно, но магний несколько меньше влияет на эту величину. Существует область концентраций двухвалентных ионов
Рис. 5. Зависимость относительного изменения специфической вязкости раствора ДНК в 0,005 М МаС1 от концентрации М^СЬ (1), та же зависимость в присутствии ка-техина (2) — эпикатехина (3), С = 5,57 • • 10_6М и кофеина (4), С = 9,33 • 10_6М
а б в г
Рис. 6. АСМ-изображения плазмидной ДНК (а), ДНК в присутствии катехина (б-г), магния (а, б), никеля (в) и марганца (г):
С (кат.) = 10−3 М, С = 5 • 10"4 М (а), 3 • 10"4 М (б), С (N1) = 2,2 • 10"4 М,
С (Мп) = 1,1 • 104 М- размер риски 1 мкм, С (ДНК) = 4 • 105 %
в растворе ДНК С (Ме2+) & gt- 5 • 10_4М, где изменения прекращаются, что отражает заполнение ионами металлов возможных мест связывания на ДНК. Это хорошо коррелирует с полученными ранее данными [14]. В присутствии катехина зависимость меняется (рис. 4, б), что может быть связано с его взаимодействием с двухвалентными ионами — в результате последние оказывают меньшее влияние на конформацию ДНК. Этот же результат получен для эпикатехина и кофеина (рис. 5).
Таким образом, мы рассмотрели результат взаимодействия ДНК с ионами металлов в присутствии катехина, эпикатехина и кофеина, которые конкурируют с ДНК за связывание с ионами Mg2+. Они перехватывают ионы двухвалентных металлов в растворе и мешают им связываться с ДНК.
На рис. 6 представлены результаты исследования систем методом атомной силовой микроскопии. Можно проследить тенденцию ухудшения высаживания ДНК на слюду в присутствии катехинов. Это также подтверждает вывод о том, что катехины в растворе ДНК захватывают ионы двухвалентных металлов, что, в частности, препятствует выполнению их связующей роли при фиксации ДНК на отрицательно заряженную поверхность слюды.
В этих экспериментах были выявлены восстановительные свойства катехина. На рис. 7 представлен результат восстановления связанных с ДНК ионов Ag+ до металлического состояния катехином. Видно, что катехин может конкурировать с гидрохиноном — традиционным восстановителем серебра. Такая особенность катехина может
Рис. 7. Результат восстановления ионов Ag+, связанных с молекулой ДНК, при помощи катехина (а) и гидрохинона (б): АСМ-изображение- размер риски 500 нм
быть использована при изготовлении ДНК-шаблонных нанопроволок. Катехин может быть для этого более пригоден, чем другие восстановители. Он не взаимодействует с ДНК и, следовательно, не меняет её конформацию, как гидрохинон. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ионы двухвалентных металлов взаимодействуют с катехинами и кофеином в растворе. Присутствие катехинов и кофеина оказывает влияние на взаимодействие двухвалентных ионов с ДНК.
Литература
1. Middleton E., Kandaswami C, Theoharides T. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer // Pharmacol. Rev. 2000. Vol. 52. N. 4. P. 673−751.
2. Mukhtar H., Ahmad N. Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health // Am. J. Clin. Nutr. 2000. Vol. 71. P. 1698−1702.
3. Pisters K., Newman R., Coldman B. et al. Phase I trial of oral green tea extract in adult patients with solid tumors // J. Clin. Oncol. 2001. Vol. 19. P. 1830−1838.
4. ChowH., Cai Y., Alberts D. et al. Phase I pharmacokinetic study of tea polyphenols following single-dose administration of epigallocatechin gallate and polyphenon E // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2001. Vol. 10. P. 53−58.
5. OhnoY., WakaiK., Genka K. et al. Tea consumption and lung cancer risk: a case-control study in Okinawa, Japan. // J. Cancer Res. 1995. Vol. 86. P. 1027−1034.
6. Naasani I., SeimiyaH., Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomere shortening, and senescence of cancer cells by tea catechins // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 249 P. 391−396.
7. MimotoJ., KiuraK, Matsuo K. et al. (-)-Epigallocatechin gallate can prevent cisplatin-induced lung tumorigenesis in A/J mice // Carcinogenesis. 2000. Vol. 21. P. 915−919.
8. Ершов Д. С., Зырянова И. М., Пастон С. В., Касьяненко Н. А. Изучение радиопротектор-ных свойств катехина при гамма- и УФ-облучении растворов ДНК // Вестн. С. -Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2007. Вып. 2. С. 3−9.
9. FredholmB. Caffeine and the biological role of adenosine receptors // Anales de la Real Academia Nacional de Farmacia. 2003. Vol. 69. N 4. P. 685−717.
10. Веселков А. Н., Лантушенко А. О. H-ЯМР-анализ гетероассоциации кофеина с антибиотиком актиноцил-бис (З-диметиламинопропиламином) в водном растворе // Биоорганическая химия. 2002. Т. 28. № 5. C. 474−480.
11. Satish K. Nune, Nripen Chanda, Ravi Shukla et al. Green nanotechnology from tea: phytochemicals in tea as building blocks for production of biocompatible gold nanoparticles // J. Materials Chem. Vol. 19. P. 2912−2920.
12. Касьяненко Н. А., Сельман-Хусейн Соса Г., Уверский В. Н., ФрисманЭ.В. Исследование влияния ионов Mn2+ и Mg2+ на конформацию молекулы ДНК // Молекулярная биология. 1987. Т. 23. № 1. С. 140−146.
13. Андроникашвили Э. Л. Малигнизация и изменение физико-химических свойств биомолекул и надмолекулярных структур // Биофизика. 1987. № 5. С. 782−799.
14. Касьяненко Н. А., Дьяконова Н. Е., ФрисманЭ.В. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами металлов // Молекулярная биология. 1989. Т. 23. № 4. С. 975−982.
Статья поступила в редакцию 18 января 2011 г.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой