Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении бактерий с лекарственной устойчивостью, на примере Bacillus pumilus продуцента антибиотика амикумацина а

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 579. 66
Ефименко Т. А. 1, Маланичева И. А. 1, Зенкова В. А. 1, Королев А. М. 1, Остерман И. А. 2, Сергиев П. В. 2, Ефременкова О. В. 1
1Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. ГФ. Гаузе Российской академии медицинских наук 2Московский Государственный университет им. М. В. Ломоносова E-mail: efimen@inbox. ru
ИЗЫСКАНИЕ АНТИБИОТИКОВ, ЭФФЕКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ С ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ, НА ПРИМЕРЕ BACILLUS PUMILUS -ПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА АМИКУМАЦИНА А
Изыскание продуцентов антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость патогенных бактерий, проводили с применением на ранних этапах отбора резистентных тест-штаммов -метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) и сапрофита Leuconostoc mesenteroides с высоким уровнем устойчивости к гликопептидным антибиотикам группы ванкоми-цина. Среди отобранных природных изолятов исследован штамм, отнесенный на основании морфологических и генетических данных к виду Bacillus pumilus. Показано, что из трех образуемых им антибиотиков эффективным в отношении обоих устойчивых тест-штаммов является амикумацин А.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, Leuconostoc mesenteroides, лекарственная устойчивость бактерий, MRSA, устойчивость к гликопептидным антибиотикам, амикумацин А.
Введение
За прошедшие годы после открытия в 1928 году пенициллина описано более 30 000 природных антибиотиков [1], из которых в медицине применяется примерно 150. Однако развитие механизмов устойчивости у патогенных бактерий в настоящее время привело к критической черте — многие возбудители инфекционных заболеваний становятся невосприимчивыми к современным лекарственным средствам. Такое положение требует поиска новых антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость бактерий, а также анализа известных антибиотиков на соответствие современным вызовам и возможности их использования в медицине. В настоящей работе проводили поиск продуцентов антибиотиков, основанный на использовании при отборе тест-штаммов с определенной лекарственной устойчивостью, и описание выделенного из почвы штамма Bacillus pumilus INA 1 087 — продуцента антибиотика амикумацина А.
Материалы и методы
Тест-штаммы. В качестве тест-штаммов для определения антимикробной активности использовали следующие микроорганизмы: грам-положительные бактерии — Bacillus subtilis АТСС 6633, B. pumilus NCTC 8241, B. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177 (штамм, устойчивый
к гликопептидным антибиотикам группы ван-комицина, с минимальной подавляющей концентрацией (МПК) 400 мкг/мл), Staphylococcus aureus FDA 209P (штамм, чувствительный к бета-лактамным антибиотикам, — meticillin-sensitive S. aureus — MSSA), S. aureus INA 761 (штамм, устойчивый к бета-лактамным антибиотикам, -meticillin-resistant S. aureus — MRSA, с МПК 32 мкг/мл), грамотрицательные бактерии -Escherichia coli ATCC 25 922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27 853, и грибы — Aspergillus niger INA 760, Saccharomyces cerevisiae RIA 259.
Условия культивирования. На агаровой среде штамм INA 1 087 выращивали при температуре 37 °C, глубинное культивирование проводили при 28 °C. Для поверхностного культивирования использовали модифицированную агаровую среду № 2 Гаузе следующего состава (%): глюкоза — 1, пептон — 0,5, триптон — 0,3, NaCl — 0,5, агар — 2- рН 7,2−7,4. Для глубинного культивирования использовали ту же среду без агара. Глубинное культивирование осуществляли в колбах Эрленмейе-ра объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (220 об/мин). Среду засевали суспензией спор в количестве 105 мл.
Грибные тест-штаммы и L. mesenteroides выращивали при температуре 28 °C, все другие штаммы — при 37 °C.
Выделение штаммов бактерий из почвы. Водную суспензию почвы тщательно перемешивали на шейкере и рассевали на агаровую
среду. Отдельные колонии пересевали в пробирки на скошенный агар, инкубировали несколько суток, подтверждали гомогенность культуры с помощью микроскопирования и высевали в колбы. На 2, 4, 7 и 9 сутки культивирования культуральную жидкость исследовали на антимикробную активность методом диффузии в агар в отношении 11 тест-штаммов.
Продуцент антибиотика. Бактериальный штамм — продуцент антибиотика амикумаци-на А, был выделен из образца выщелоченного чернозема (Краснодарский край, Россия). Штамм депонирован в Коллекции культур Института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН под номером INA 1 087.
Микроскопирование. Исследование проводили с помощью светового микроскопа Olympus BX41TF (Япония). При окрашивании по Граму в качестве положительного и отрицательного контроля использовали штаммы B. subtilis АТСС 6633 и E. coli ATCC 25 922, соответственно.
Определение антимикробной активности. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агар. Об уровне антимикробной активности в культуральной жидкости судили по диаметрам зон задержки роста тест-культур вокруг лунок в агаровой среде диаметром 9 мм, в которые закапывали испытуемый раствор. По ходу выделения и очистки антибиотика испытуемые образцы наносили на бумажные диски, которые помещали на поверхность агаровой среды с высеянной тест-культурой.
Анализ нуклеотидных последовательностей части гена 16S рРНК бактериальных штаммов. ДНК выделяли методом [2]. Для амплификации ДНК гена 16S рРНК методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали универсальные консервативные прайме-ры прокариот 27f и 1492 г. Были выбраны режимы проведения ПЦР: (1) 94 °C — 5 мин, (2) 30 циклов с чередованием температурных интервалов 94 °C — 1мин, 51 °C — 1 мин, 72 °C -2мин, (3) 72 °C — 7мин. Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1% ага-розном геле при напряженности электрического поля 5 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР осуществляли методом спиртового переосаждения ДНК в мягких условиях (0,125 М ацетата аммония в 70% этиловом спирте). Секвенирование ДНК очищенных фрагментов проводили на автоматическом секве-
наторе Genetic Analyzer 3500 (Applied biosystems, США). Для анализа последовательностей и построения дерева родства использовали базы данных GenBank (www. ncbi. nlm. nih. gov) [3] и Ribosomal Database Project (http: //www. cme. msu. edu) [4].
Выделение и очистка амикумацина А. Фильтрат культуральной жидкости, содержащей антибиотики амикумацины, А и В, наносили на сорбент Amberlyte XAD-2 и элюиро-вали смесью н-бутанол-ацетон-вода (1: 1:1). Полученные элюаты упаривали в вакууме досуха при 37 °C, сухой остаток растворяли в 60%-м водном этаноле. Дальнейшую очистку амикумацина, А проводили на колонке размером 14×180 мм, заполненной силикагелем Kieselgel 60 (Merck, США). Антибиотики последовательно элюировали системами растворителей — этилацетат-этанол (4: 1) и хлороформ-метанол (7: 3). Полученные фракции анализировали методом UV-VIS-спектрофо-тометрии на приборе Thermo Scientific™ NanoDrop 2000 (США) и методом диффузии в агар для выявления антимикробного действия в отношении тест-бактерии S. aureus INA 761 (MRSA). Окончательную очистку проводили с помощью препаративной ВЭЖХ, используя хроматограф Agilent1200 (США) на колонке Luna 5u C18(2) 100A размером 250×4,60 мм (Phenomenex, США). Объем петли инжектора — 20 мкл. Детектирование проводили при длине волны 240 нм (^max выделяемых антибиотиков). Элюирование проводили системой 0,2 М ацетат аммония рН 7,5 — ацетонитрил в градиентном режиме, повышая содержание ацетонитрила от 0 до 80% при скорости потока — 1мл/мин-1. Раствор амикумацина, А лиофилизировали и хранили в сухом виде в темноте при -70°С. Структуру амикумацина, А подтвердили методом MALDI-TOF-TOF масс-спектрометрии на приборе Ultraflextreme (Германия).
Результаты и обсуждение
Одними из самых распространенных опасных патогенов, устойчивых к антибиотикам, в настоящее время являются метициллинрезис-тентный золотистый стафилококк (MRSA). Последнее десятилетие для лечения заболеваний, вызванных MRSA, применяют гликопеп-тидные антибиотики группы ванкомицина, од-
Ефименко Т. А. и др.
Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении…
нако стали все чаще фиксироваться патогенные бактерии, устойчивые также и к этой группе антибиотиков. Учитывая это, мы на раннем этапе поиска проводили отбор продуцентов антибиотиков для химического изучения на основании эффективности их культуральной жидкости в отношении тест-штаммов S. aureus INA 761 и L. mesenteroides VKPM B-4177.
Среди выделенных штаммов нами был отобран для дальнейшего исследования штамм INA 1 087, культуральная жидкость которого проявляет на высоком уровне антимикробную активность в отношении S. aureus INA 761 и L. mesenteroides VKPM B-4177 начиная со вторых суток роста. Выделение и очистку проводили при анализе антибиотической активности в отношении тест-штамма S. aureus INA 761. Показано, что штамм INA 1 087 образует не менее трех антибиотиков, из которых один представляет наибольший интерес, проявляя активность в отношении как S. aureus INA 761, так и L. mesenteroides VKPM B-4177, но не в отношении грамотрицательных бактерий и грибов (табл. 1).
Морфологическое исследование показало, что клетки штамма INA 1 087 грамположитель-
ны, палочковидны, размером 1х (3−4) мкм, на вторые сутки культивирования на агаровой среде формируют характерные для бацилл эндоспоры, содержание которых на 11 сутки близко к 100%. Штамм формирует круглые бежевые блестящие колонии с ровным краем, экзопигмент отсутствует.
Таблица 1. Спектр антибиотической активности культуральной жидкости штамма INA 1 087.
Тест-штаммы Зоны задержки роста (мм)
Bacillus subtilis АТСС 6633 (=RIA 445) 11
Bacillus mycoides 537 11
Bacillus pumilus NCTC 8241 0
Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177 25
Micrococcus luteus NCTC 8340 30
Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA) 28
Staphylococcus aureus INA 761 (MRSA) 28
Escherichia coli ATCC 25 922 21
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27 853 0
Aspergillus niger INA 760 12
Saccharomyces cerevisiae RIA 259 14
98
Ё1 34
45
ЭЭ
100
47j- AJ276351.1 _ 51 [L HQ223107.1 -AF074970.1. — АВ21 191.1 -АВ21 198.1. -GQ281299.1 АВ255 669.1 EU194897.1. АВ21 181.1 СР2. 3
5о|__| бсП-
92
90|KF717600. 1
AY876289.1. — AF234854. 2_ AJ831844.2. AJ831842. 1_ AJ831841.2. AY904033. 1
ЭЭ
Bacillus_subtilis_(T)_DSM10 _Bacillus_tequilensis_(T)_10b _Bacillus_subtilis_(T)_NRRL_B-23 049 _Bacillus_niojavensis_(T)_IF015718 _Bacillus_vallisniortis_(T)_DSM11031 _Bacillus_siamensis_(T)_PD-A10 _Bacillus_arriyloliquefaciens_(T)_NBRC_15 535. Bacillus jriethylotrophicus_(T)_CBMB205 _Bacillus_atrophaeus_(T)_JCM9070 _Bacillus_licheniforrni s_(T)_ATC C_14 580_D S M13
_B, а с 111 u s_p u mi I u s_(T)_ATC C_7061 _Bacillus_safensis_(T)_FO-036b Bacillus_aerophilus_(T)_1y pe_strain: 2BK Bacillus_altitudims_(T)_type_stram: 41 KF2b Bacillus_stratosphericus_(T)_type_strair: 41 KF2a _Bacillus_idriensis_(T)_SMC_4352−2
4
0. 020
0. 015
0. 010
0. 005
0. 000
Рисунок 1. Филогенетическое положение штамма Bacillus pumilus INA 1 087 на основе последовательности гена 16SpPHK (последовательность гена депонирована в Genbank под номером KF17600. 1). Масштаб — 5 нуклеотидных замен на 1000 нуклеотидов. Цифры — достоверность ветвления по «bootstrap^-анализу 100 альтернативных деревьев
Для дальнейшего изучения штамма ампли-фицировали ДНК гена 16S рРНК с помощью ПЦР и провели ее секвенирование. Была проанализирована последовательность гена длиной 1503 н.о., депонированная в GenBank под номером KF717600. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что анализируемая последовательность ДНК на 100% идентична с последовательностями штаммов B. pumilus. Последовательность была выровнена с соответствующими последовательностями типовых штаммов ближайших видов бактерий из базы данных RPD. С помощью программы Mega 5.2.2 на основе типовых штаммов было построено дерево филогенетического родства (рис. 1).
На основании морфологических и генетических данных штамм был отнесен к виду Bacillus pumilus и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН под номером INA 1 087.
Выделение и очистка антибиотика с последующим анализом методом MALDI-TOF-TOF масс-спектрометрии показали наличие двух ранее описанных антибиотиков — амикумаци-нов, А и В (рис. 2), из которых указанной биологической активностью обладает амикумацин А.
Структура амикумацина, А и его антибиотическое действие в отношении грамположи-тельных бактерий впервые были описаны в 1981 году, при этом авторы особое внимание отдавали не антибактериальным свойствам вещества, а его способности купировать отеки конечностей и язву желудка у мышей [5]. В настоящее время известно 11 антибиотиков
OR, О
R, = н. R-=NH- -423 (амикуиацин А) R, = Н, — ОН -424 (амикуиацин В)
ОН О. ?(об (иетабошгг-
пре щнес твенник или продукт расще пленил амикумацина В)
Рисунок 2. ВЭЖХ н структуры антибиотиков амикумацинов, А и В, выделенных из культуральной жидкости штамма Bacillus pumilus INA 1 087
амикумацинов — аналогов амикумацина А, которые наряду с антибактериальной активностью обладают разнообразным спектром биологической активности, включая противоопухолевую, антивирусную, антигельминтную, ре-тардантную. В соответствии с потребностью времени в 2012 году опубликована информация об эффективности этого антибиотика в отношении штаммов MRSA и VISA (vancomycin intermediate Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus с умеренным уровнем устойчивости в ванкомицину) [6], [7]. Нами установлено, что амикумацин, А эффективен как в отношении MRSA, так и штамма L. mesenteroides VKPM B-4177 с высоким природным уровнем устойчивости к гликопептид-ным антибиотикам группы ванкомицина. Таким образом, амикумацин, А является примером «старых новых антибиотиков», интерес к которым возник на современном этапе.
14. 10. 2014
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 13−04−1 658 А) и Российского Научного Фонда (грант номер 14−24−61)
Список литературы:
1. Berdy J. Bioactive microbial metabolites // J. Antibiot. — 2005. — V. 58. — № 1. — Р. 1 — 26.
2. PCR protocols: a guide to methods and applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White- New York: Academic Press. 1990. — 26 с.
3. The National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Электронный ресурс] // Maryland, USA. GenBank. URL: (www. ncbi. nlm. nih. gov) (дата обращения 18. 09. 2014).
4. The Center for Microbial Ecology (CME) [Электронный ресурс] // Michigan State University. RDP (Ribosomal Database Project). URL: (http: //www. cme. msu. edu). (дата обращения 18. 09. 2014).
5. Itoh J., Omoto S., Shomura T., Nishizawa N., Miyado S., Yuda Y., Shibata U., Inouye S. Amicoumacin-A, a new antibiotic with strong antiinflammatory and antiulcer activity // J. Antibiot. — 1981. — V. 34. — № 5. — Р. 611−613.
6. Lama A., Jan Pane-Farre J., Chon T., Weirsma AM, Sit C.S., Vederas J.C., Hecker M, Nakano M.M. Response of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus to Amicoumacin A // PLoS One. — 2012. — V. 7. — № 3. — Р. 1−13.
7. Li Y., Xu Y., Liu L., Han Z., Lai P.Y., Guo X, Zhang X, Lin W, Qian P. Five new amicumacins isolated from marine-derived bacterium Bacillus subtilis // Mar. Drugs. — 2012. — V. 10. — № 2. — Р. 319−328.
Ефименко Т. А. и др.
Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении.
Сведения об авторах:
Ефименко Татьяна Александровна, младший научный сотрудник, аспирант Сектора поиска природных соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: efimen@inbox. ru
Маланичева Ирина Алексеевна, старший научный сотрудник Сектора поиска природных
соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: malanicheva. irina@yandex. ru
Зенкова Валентина Александровна, старший научный сотрудник лаборатории химического изучения биологически активных соединений микробного происхождения Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: ovefr@yandex. ru
Королев Александр Михайлович, ведущий научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: korolev_am@mail. ru
Ефременкова Ольга Владимировна, руководитель сектора поиска природных соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, кандидат биологических наук, е-mail: ovefr@yandex. ru
119 021, г. Москва, Б. Пироговская, 11, стр. 1
Остерман Илья Андреевич, старший научный сотрудник факультета биоинформатики и биоинженерии Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, кандидат биологических наук, е-mail: osterman@yandex. ru
Сергиев Петр Владимирович, профессор факультета биоинформатики и биоинженерии Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова, доктор химических наук,
е-mail: petya@mail. genebee. msu. ru
119 991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 73

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой