Эффект плотности культуры тест-объекта в приборном биотестировании с использованием Paramecium caudatum

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015 27
УДК 504. 064:57. 084.5 ББК 26. 23−28. 080. 1
ЭФФЕКТ ПЛОТНОСТИ КУЛЬТУРЫ ТЕСТ-ОБЪЕКТА В ПРИБОРНОМ БИОТЕСТИРОВАНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PARAMECIUMCAUDATUM
М.Г. МОСКВИЧЕВА, ФГБОУВПО ЧелГУ, г. Челябинск, Россия Д. Ю. НОХРИН, Уральский филиал ФГБНУ & quot-ВНИИВСГЭ"-, г. Челябинск, Россия
e-mail: nokhrin8@mail. ru
Аннотация
С использованием прибора & quot-Биотестер-2"- и культуры инфузорий P. сaudatum оценена токсичность снегового покрова г. Челябинска и растворов нитрата кадмия в эксперименте. Показано, что при использовании плотности культуры свыше 300−500 клеток/мл распределение индекса токсичности Itox становится асимметричным, исчезает связь Itox с содержанием в пробах снега тяжёлых металлов, в эксперименте наблюдается рост Itox на сверхмалых концентрациях токсиканта. Рекомендуется продолжить исследование феномена.
Ключевые слова: биотестирование, Биотестер-2, инфузории, плотность культуры, методика.
Актуальность. Приборное биотестирование, распространившееся в нашей стране в начале 90-х годов, сочетает в себе точность и удобство аппаратных исследовательских методов с высокой чувствительностью, свойственной живым объектам [6]. Большую популярность в экологических, санитарно-эпидемиологических и ветеринарных службах получили методы, использующие в качестве тест-объекта различные виды инфузорий, а в качестве прибора — специализированный импульсный фотометр & quot-Биотестер-2"-. Принцип
биотестирования с его использованием заключается в измерении реакции хемотаксиса инфузорий — способности избегать неблагоприятных концентраций химических веществ в окружающей среде. Поскольку по своим биохимическим параметрам инфузории очень близки к высшим животным и человеку, результаты такого биотестирования могут быть экстраполированы на человека [3].
В то время как прикладные экологические исследования по биотестированию с использованием инфузорий широко
распространены и многочисленны, работы, посвящённые его методологическим аспектам почти не встречаются.
Цель данной работы заключалась в демонстрации обнаруженного нами эффекта влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования с использованием фотометра & quot-Биотестер-2"-.
Авторы благодарят А. Осинникова и к.г. -м.н. И. В. Грачёву за помощь на разных этапах работы.
Материал и методы исследования. Отбор проб снега на территории г. Челябинска был проведён в апреле 2006 г. сотрудниками НПТ & quot-Прогноз"-. Пробы отбирались вдоль основных магистралей (с отступлением от полотна дороги не менее 50 м) и внутри жилых массивов с помощью цилиндра 0 200 мм на всю глубину снегового покрова. Пробы фасовались в полиэтиленовые мешки и транспортировались в лабораторию, где снег растапливался при комнатной температуре, а талая вода разливалась в пластиковые бутыли для последующего анализа.
Оценка токсичности 150 проб была проведена на специализированном фотометре & quot-Биотестер-2"- (ЦНТТМ & quot-Квант"-, Санкт-Петербург, Россия) с использованием в качестве тест-объекта культуры инфузории-туфельки P. caudatum согласно методике [5]. Пробы анализировались в случайном порядке в 6 сериях определений, выполненных в разные дни с интервалом в несколько дней, необходимым для размножения культуры. Параллельно в лаборатории Уральского филиала ФГБНУ ВНИИВСГЭ были определены: рН проб, содержание взвешенных веществ и 13 элементов (Mg, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Sr, Cd, Pb).
В лабораторном эксперименте 2011 г. по оценке влияния рабочей концентрации
28 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015
культуры инфузорий на результаты
биотестирования использовались ГСО 7257−96 состава ионов хрома (водный раствор К2СГ2О7) и ГСО 7472−98 состава ионов кадмия (раствор Cd (NO3) 2 в азотной кислоте) производства ОАО & quot-Уральский завод химических реактивов& quot-. Растворы токсикантов готовились на
дистиллированной воде, которая была выбрана ввиду сходства с атмосферными осадками по водородному показателю.
В ходе статистической обработки данных использовались: точечная и интервальная
оценка среднего значения, непараметрический корреляционный анализ по Спирмену,
двухфакторный дисперсионный анализ и интерполяция пространственных данных методом минимального искривления (minimum curvature). 95%-ный доверительный интервал (95% ДИ) для средних значений индекса токсичности рассчитывался в предположении нормальности распределения данного показателя, а 95% ДИ для доли токсичных проб — методом Клоппера — Пирсона. Расчёты и графические построения выполнены в пакетах KyPlot (v. 2.0 beta 15- [10]) и Surfer (v. 9. 11- Golden Software Inc.).
Результаты и обсуждение.
1. Оценка токсичности снегового покрова, сформировавшегося на территории г. Челябинска в зимний период 2005—2006 гг. В ходе разведения культуры парамеций было отмечено, что их двигательная активность может заметно изменятся во времени под действием неконтролируемых факторов. Поэтому, учитывая, что исследование было выполнено за 6 подходов, важным представлялось убедиться в сопоставимости результатов биотестирования в сериях определений. В ходе иерархического двухфакторного дисперсионного анализа (случайные факторы: & quot-Серия"- и & quot-Проба внутри Серии& quot-) было установлено, что серии не различались статистически значимо по средним значениям индекса токсичности (/tox) проб: F [6/144] =1,70- p=0,126. Однако характер
распределения Itox в 6 сериях был различен (рис. 1): в исследованиях на невысоких
плотностях р культуры (серии 1, 3−5) оно было симметричным и по коэффициенту асимметрии (As=0,062) не отличалось от нормального (p=0,406), в то время как на более высоких плотностях (серии 2, 6) имело отчётливую отрицательную асимметрию (As= - 0,920-
p=0,0008). Следует пояснить, что отрицательные значения Itox получались для проб, в которые инфузории переходили более активно, чем в контрольную пробу (отстоянная и прокипячённая вода из водопровода г. Челябинска), т. е. пробы, демонстрировавшие положительный хемотаксис. Как видно из рис. 1., на высоких плотностях культуры смещение распределения Itox в область отрицательных значений компенсировалось параллельным увеличением доли наиболее токсичных проб, что проявилось появлением дополнительной моды на гистограмме распределения в области Itox=0,5−0,75.
га -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
5 30 г
С
¦2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
Индекс токсичности
Рисунок 1. Гистограммы распределения
индексов токсичности проб снега, проанализированных с использованием разных концентраций культуры инфузорий
Таким образом, на первом этапе анализа был выявлен эффект влияния концентрации
инфузорий (плотности культуры) на результаты биотестирования. Поскольку на высокой и низкой плотностях оценивалась токсичность хоть и случайных, но разных проб, пока можно
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015 29
лишь несколько спекулятивно предполагать увеличение контраста хемотаксической реакции инфузорий при использовании плотности культуры 800 шт. /мл и более. Тем не менее, учитывая существенные различия
распределений (критерий отношения правдоподобия G [8] =18,19- p=0,020), было
решено анализировать данные, полученные на низкой и высокой плотностях культуры раздельно.
В таблице 1 представлены результаты оценки корреляции Itox с показателями химического состава снега для материала, разделённого на 2 части.
Таблица 1
Связь между индексом токсичности и химическим составом снега в сериях определений с низкой и высокой плотностью культуры инфузорий: коэффициенты корреляции Спирмена rS и оценка значимости p____________________________________________________________________
Показатели Низкая плотность (n=84) Высокая плотность (n=66)
rS р rS р
pH 0,04 0,751 -0,04 0,751
Взвеси 0,11 0,310 0,00 0,994
Mg 0,20 0,074 0,10 0,408
Ca 0,27 0,013 0,05 0,715
Cr 0,23 0,037 0,07 0,565
Mn 0,19 0,081 -0,03 0,799
Fe 0,13 0,238 0,03 0,795
Co 0,04 0,722 -0,13 0,298
Ni 0,07 0,511 -0,14 0,249
Cu 0,06 0,576 -0,14 0,279
Zn 0,16 0,138 0,05 0,696
As 0,09 0,415 0,19 0,120
Sr 0,07 0,521 0,05 0,688
Cd 0,22 0,048 -0,11 0,396
Pb 0,15 0,182 -0,05 0,693
Видно, что в пробах, тестированных на культуре инфузорий невысокой плотности, были обнаружены 3 слабые (rS& lt-0,30) но статистически значимые связи (Ca, Cr, Cd), а также 2 тенденции к связям (Mg, Mn). Во второй группе проб ни связей, ни тенденций выявить не удалось. Хотя само по себе наличие связей между токсичностью и содержанием исследованных веществ не является доказательством правильности результатов биотестирования (токсичность могли обеспечить не исследовавшиеся нами компоненты состава проб и/или сложные сочетания веществ), их полное отсутствие во второй группе на фоне отчётливого наличия в первой представлялось сомнительным. Поэтому было принято решение отказаться от результатов анализа, полученных на высоких плотностях культуры и рассматривать в дальнейшем только 84 пробы.
Величина Itox варьировала в 84 пробах от-0,71
до 0,89 и составила в среднем 0,12±0,037 (95% ДИ: 0,04 — 0,19). Согласно инструкции к прибору & quot-Биотестер-2"- среднее значение индекса токсичности попадает в категорию & quot- нетоксично& quot-. При этом доля проб категории & quot-токсично"- (Itox& gt-0,35) составила 25,0% (95% ДИ: 16,2 — 35,6).
В ходе пространственной интерполяции значений индексов токсичности на территории г. Челябинска было выявлено 7 зон с Itox& gt-0,5 (рис. 2). Вероятно, 3 из них не связаны непосредственно с деятельностью
многочисленных промышленных предприятий города и являются скорее результатом высокой автотранспортной нагрузки. Это — небольшая зона в северо-западной части города (выезд из города по Свердловскому тракту), в западной части (район пос. Градский прииск, Терема и Интернационалист) и в южной части (выезд из города по Троицкому тракту). Остальные 4 зоны имеют чёткую привязку к промышленным
30 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015
зонам города: 1) в северной части — зона влияния Челябинского металлургического комбината, 2) в восточной — промзона и зона влияния Челябинского
электрометаллургического комбината, ЖБИ-1 и ряда др. заводов, 3) в северо-западной — самая крупная промзона и зона влияния Челябинского цинкового завода, лакокрасочного завода, Челябвтормета, электровозоремонтного завода, Уральского дроболитейного завода и др. предприятий, 4) в юго-западной — промзона и зона влияния Челябинского асфальтного завода, завода минеральных плит, завода железобетонных шпал, щебёночных и др. предприятий.
Таким образом, в ходе биотестирования снегового покрова, сформировавшегося на территории города в зимний период 2005—2006 гг., хорошо интерпретируемые результаты (характер распределения, связи с содержанием в пробах металлов, привязка к промзонам) удалось получить при исключении из анализа проб, оцененных с использованием культуры инфузорий в концентрациях 800−1100 шт. /мл. Учитывая, что методикой рекомендуется использовать концентрации порядка 500−1000 шт. /мл, полученные данные о
неинформативности результатов
биотестирования на плотностях культуры свыше 800 клеток/мл следует признать отчасти противоречащими методике. Поэтому нами был спланирован и проведён специальный эксперимент по оценке влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования.
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015 31
Рисунок 2. Распределение значений индекса токсичности снега по территории г. Челябинска (интерполяция методом минимального искривления)
31
32 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015
2. Экспериментальная оценка влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования. Для
эксперимента были выбраны 2 элемента: хром и кадмий. Оба они токсичны для гидробионтов [2, 7] и обнаружили статистически значимую корреляцию с Лох снега в 2006 г (см. выше). Опыту предшествовал пилотный поиск области концентраций токсикантов, охватывающей диапазон от максимальной токсичности до её отсутствия.
Для растворов бихромата калия близкие к нулю и отрицательные значения индекса токсичности регистрировались вплоть до увеличения концентрации до 100 мг/дм в расчёте на Cr (5000 ПДКВР [7]), после чего пилотный опыт был прекращён. Таким образом, такой известный токсикант, мутаген и канцероген как шестивалентный хром не проявил токсических свойств в биотестировании с использованием реакции хемотаксиса инфузорий. Положительная хемотаксическая реакция парамеций к слабым растворам солей и кислот известна более века и была подробно изучена Дженнингсом и Робертсоном. В частности, эффект был обнаружен для солей сульфата меди, хлорида ртути, серной кислоты, соляной кислоты, уксусной и азотной кислот в низких концентрациях [8, 9]. Это в очередной раз доказывает несостоятельность суждений о степени биокондиции среды на основании результатов её оценки лишь одной тестсистемой и о необходимости использования батареи тестов. Что же касается связи Itox снега с содержанием в нём хрома в натурных исследованиях 2006 г., то она не является простой. Её возникновение можно объяснить иной формой нахождения хрома в талом снеге (например, в виде ионов Cr) или его вхождением в паттерн токсикантов, обладающих выраженным острым токсическим эффектом.
Результаты лабораторного эксперимента с кадмием представлены на рис. 3. Величина индекса токсичности зависела от сочетания плотности культуры инфузорий и концентрации токсиканта, что проявилось в статистически значимом взаимодействии факторов & quot-Плотность х Концентрация& quot- в ходе
дисперсионного анализа: F [б-ю8] =27,11-
р& lt- 0,001.
Рисунок 3. Изменение индекса токсичности в зависимости от концентрации токсиканта плотности культуры (шт. /мл): 1 — 600, 2 — 300, 3 — 150
Как видно из рис. 3, ожидаемая динамика снижения Itox по мере разбавления токсиканта наблюдалась на минимальной плотности культуры инфузорий (около 150 шт. /мл). На более высоких плотностях отмечались: существенное расхождение оценок токсичности для концентрации нитрата кадмия 0,1 мг/л, а также статистически значимый рост Itox после десятикратного разбавления концентрации 0,01 мг/л. Таким образом, проведённый эксперимент, подтвердив само существование эффекта влияния плотности культуры тестобъекта на результаты биотестирования, не прояснил ситуацию с характером такого влияния и поставил ряд новых вопросов, обсуждение которых выходит далеко за рамки данной статьи. Отметим только, что явление нелинейности ответа в области воздействий физических и химических факторов сверхнизкой интенсивности хорошо известно, однако многочисленные гипотезы о его механизмах в настоящее время только обсуждаются [1]. Способ измерения хемотаксиса, применяемый в использованной методике биотестирования, указывает на то, что эффект плотности культуры реализуется не пассивно — через изменение физикохимических свойств раствора с инфузориями,
32
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015 33
что также возможно [4], а с активным участием самих инфузорий, демонстрирующих на высоких плотностях иные модели поведения, вероятно, — группового. Не исключено, что при высокой концентрации инфузорий их реакция на токсическое воздействие модифицируется известным как в макро-, так и микромире & quot-чувством кворума& quot- организмов.
Заключение. Натурные исследования токсичности снегового покрова г. Челябинска и результаты лабораторного эксперимента по оценке токсичности раствора нитрата кадмия с использованием измерения хемотаксической реакции инфузории-туфельки указывают на существование в области высоких концентраций тест-культуры (свыше 300−500
шт. /мл) эффектов, затрудняющих
интерпретацию результатов биотестирования. Полагаем, что исследования по оценке влияния плотности культуры инфузорий на восприятие ими химических веществ должны быть продолжены, для чего результаты экспериментов целесообразно дублировать с использованием низких концентраций тестобъектов. С практической точки зрения, во избежание влияния неконтролируемых зависящих от плотности факторов на оценку токсичности объектов окружающей среды в мониторинговых исследованиях, желательно использовать близкие концентрации культуры инфузорий, а исследование проводить, по возможности, в один рабочий день.
Список литературы
1. Бурлакова Е. Б., Конрадов А. А., Мальцева Е. Л. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов // Проблемы регуляции в биологических системах / Под ред. А. Б. Рубина. М. -Ижевск: НИЦ & quot-Регулярная и хаотическая динамика& quot-, 2006. С. 390−424.
2. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I — IV групп: Справ. изд./ А. Л. Бандман, Г. А. Гудзовский, Л. С. Дубейковская и др.- Под ред. В. А. Филатова и др. Л.: Химия, 1988. 512 с.
3. Ивашкин В. Т., Минасян Г. А., Уголев А. М. Теория функциональных блоков и проблемы клинической медицины. Л.: & quot-Наука"-, 1990. 303 с.
4. Лобышев В. И. Вода как сенсор слабых воздействий физической и химической природы // Рос. хим. ж-л. 2007. Т. LI, № 1. С. 107−114.
5. Методика экспресс-оценки степеней токсического загрязнения водных проб с помощью прибора & quot-Биотестер"-. Москва, 1991. 26 с.
6. Пожаров А. В., Шелемотов С. А. Использование экспресс-биотестирования для оценки антропоэкологической ситуации // Экология. 1992. № 2. С. 94−95.
7. Приказ от 28 апреля 1999 г. № 96 & quot-О рыбохозяйственных нормативах& quot- и & quot-Перечень предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов& quot-. Государственный комитет РФ по рыболовству.
8. Jennings H.S. Studies on reactions to stimuli in unicellular organisms. I. Reactions to chemical, osmotic and mechanical stimuli in the ciliate infusoria // J. Physiol. 1897. V. 21, № 4−5. P. 258−322. (URL: http: //jp. physoc. org/content/21/4−5/258. long)
9. Robertson T.B. Investigation on the reactions of Infusoria to chemical and osmotic stimuli // J. Biol. Chem. 1906. № 1. P. 185−202. (URL: http: //www. jbc. org/content/½/185. full. pdf)
10. Yoshioka K. KyPlot — a user-oriented tool for statistical data analysis and visualization // Computational Statistics. 2002. V. 17, № 3. P. 425−437.
33
34 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области № 3(10) 2015
DENSITY EFFECT OF THE TEST FACILITY'-S CULTURE IN THE INSTRUMENTAL BIOTESTING USING PARAMECIUM CAUDATUM
M.G. MOSKVICHEVA, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia D. YU. NOKHRIN, Ural Branch of All-Russia Research Institute of Veterinary Sanitary, Hygiene, and
Ecology, Chelyabinsk, Russia e-mail: nokhrin8@mail. ru
Abstract
The toxicity of snow cover in Chelyabinsk and cadmium nitrate solution in the experiment, using the device & quot-Biotester-2"- and the culture of the ciliates P. caudatum, were evaluated. It is shown, that by using the density of the culture more than 300−500 cells/ml, the distribution of the toxicity index Itox becomes asymmetric, the correlation between the Itox and the content of heavy metals in samples disappears, the Itox in the ultra-low concentrations of toxicant increases, in this experiment. It is recommended to continue the study of this phenomenon.
Keywords: biological testing, Biotester-2, ciliates, cell culture density, methodology.
34

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой