Эффекты мужского полового гормона (тестостерона) на функциональную активность Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ЭФФЕКТЫ МУЖСКОГО ПОЛОВОГО ГОРМОНА (ТЕСТОСТЕРОНА)
НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ
РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
В. В. Шуплецова, О. Г. Хазиахматова, А. А. Гуцол, Н. А. Сохоневич, К. А. Юрова, Л.С. Литвинова
Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия
The effects of the male sex hormone (testosterone) on the functional activity of T-lymphocytes different degrees of differentiation.
V.V. Shupletsova, O.G. Khaziakhmatova, АА. Gutsol, NA. Sokhonevich, KA. Yurova, L.S. Litvinova I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, Russia
Проводили комплексную оценку эффектов тестостерона на функциональную активность Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки (наивных — CD45RA+ и прими-рованных — CD45RO+).
Материал и методы. В экспериментах in vitro использовали Т-лимфоциты разной степени дифференцировки (CD45RA+ и CD45RO+), полученные из взвеси мононукле-арных клеток здоровых доноров (n = 48) методом иммуно-магнитной сепарации. Для оценки дозозависимых эффектов тестостерона на функциональную активность Т-клеток использовали активационную модель, отражающую процесс взаимодействия Т-лимфоцитов с антиген-презентиру-ющими клетками (активация CD2/CD3/CD28-комплексом). Оценку жизнеспособности и определение поверхностных молекул (CD25, CD71, CD95) на Т-клетках проводили методом проточной цитометрии- определение концентрации IL-2 в супернатантах клеточных культур — методом имму-ноферментного анализа- оценку относительного уровня экспрессии мРНК гена каталитической единицы фермента теломеразы — hTERT в клетках — методом полимеразной цепной реакции. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences).
Результаты. Установлен проапоптогенный эффект тестостерона на CD2/CD3/CD28-активированные примиро-ванные (CD45R0+) Т-клетки, что может быть обусловлено негеномными эффектами мужского полового гормона. Тестостерон-индуцированные изменения параметров системы IL-2/IL-2Ra активированными Т-клетками разной степени дифференцировки носят однонаправленный характер, имеют разную степень выраженности и зависят от концентрации гормона. Супрессивные эффекты тестостерона, в большей степени, затрагивают наивные (CD45RA+) Т-клетки. Дозозависимые эффекты тестостерона на экспрессию гена hTERT на фоне антигеннезависимой активации носят разнонаправленный характер и определяются степенью дифференцировки Т-клеток.
Ключевые слова: иммунная память, функциональная активность, тестостерон- маркеры активации, пролиферации, апоптоза
The aim of the study was a comprehensive assessment of testosterone effects on the functional activity of T lymphocytes of different differentiation degrees (naive -CD45R + and primed -CD45RO+).
Material and methods. CD45RA+ and CD45RO+ T cells obtained from a suspension of mononuclear cells from healthy donors (by immunomagnetic separation) were used as a study material (n = 48). The activation model which reflects the interaction of T lymphocytes of different differentiation degrees with antigen-presenting cells (CD2/CD3/CD28-complex activated T cells) was used to assess dose-dependent effects of testosterone on functional activity of T memory cells of different differentiation degrees. Viability assessment and identification of surface molecules CD25, CD71, CD95 on T cells of different differentiation degrees were performed by flow cytometry- the concentration of IL-2 in supernatant cell cultures was performed by enzyme immunoassay- assessment of the relative mRNA expression level of the telomerase catalytic subunit hTERT gene was performed by polymerase chain reaction. Statistical analysis was made using IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences).
Results. The proapoptotic effect of testosterone on CD2/ CD3 / CD28-activated primed (CD45RO+) T cells has been established that may be due to nongenomic effects of the male sex hormone. Testosterone-induced changes of the system parameters IL-2/IL-2Ra induced by activated T-cells different degrees of differentiation is unidirectional, have different rates and depend on concentration of the hormone. Suppressive effects of testosterone largely affect naive (CD45RA+) T cells. Dose-dependent effects of testosterone on the telomerase catalytic subunit (hTERT) gene expression in the background of antigen-independent activation are multidirectional and determined by the degree of T cells differentiation.
Keywords: immune memory, functional activity, testosterone, activation markers, proliferation, apoptosis
Введение
Участие андрогенов и их рецепторов (AR) в регуляции развития и функционирования иммунной системы на сегодняшний день является доказанным, поскольку экспрессия AR, помимо клеток гормон-зависимых органов и тканей, обнаружена в различных иммунных клетках, включая нейтрофилы, тучные клетки, макрофаги, Т- и В-лимфоциты [1−3]. Тимус уже давно признан в качестве мишени действия андрогенных гормонов [4, 5]. Относительно недавно было установлено, что уровень половых гормонов может влиять на выход Т-клеток из тимуса [6]. Выявлена взаимосвязь между структур-
е-таП: larisalitvinova@yandex. ru
ной и функциональной атрофией тимуса, связанная в частности с секрецией половых гормонов [7].
Для человеческой популяции и животных характерен иммунологический половой диморфизм, который является результатом взаимодействия нейро-эндокринной и иммунной систем [3]. Установлено, что самки по сравнению с самцами имеют сильный клеточно-опосредованный иммунный ответ с более значительной продукцией антител при антигенной стимуляции и обладают высокой склонностью к развитию аутоиммунных заболеваний [3, 8, 9]. В отличие от женщин, мужчины имеют более высокий риск развития сепсиса, острых респираторных
заболеваний, нарушений функций внутренних органов вследствие травм мягких тканей, геморрагического и термического шока [9].
Андрогены оказывают свои эффекты посредством разных механизмов в зависимости от стадии развития клеток и состояния их активации [10−12]. Становится очевидным, что влияние стероидных гормонов на иммунитет прямо или косвенно связано с их действием) на генерацию, жизнеспособность и функциональную активность Т-клеток. В связи с вышесказанным, принципиально важным становится исследование физиологических механизмов, лежащих в основе регуляции первичного и вторичного иммунного ответов.
Целью исследования явилась комплексная оценка эффектов тестостерона на функциональную активность Т-лимфоцитов разной степени диффе-ренцировки (наивных — CD45RA+ и примированных — CD45RO +).
Материал и методы
Материалом исследования служила венозная кровь 48 условно здоровых доноров (24 мужчины и 24 женщины, в возрасте от 19 до 39 лет). Все доноры подписывали добровольное информированное согласие. Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете (протокол № 5 от 05 ноября 2013 г.).
Мононуклеарную фракцию крови выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Urografin (Schering, Испания- Pharmacia, Швеция) (р = 1,077 г/см3). Далее, из выделенных моно-нуклеарных клеток получали популяции CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов методом иммуномагнит-ной сепарации с использованием технологии MACS (Miltenyi Biotec, Германия), согласно протоколу фирмы-производителя. Из венозной крови одного донора получали 2 культуры — CD45RA+ и CD45RO + -клетки. Чистоту выделенных клеток определяли с помощью моноклональных антител (МКАТ), конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) или фикоэри-трином (PE) (Abcam, Великобритания). Содержание целевой фракции CD45RA+ и CD45RO±клеток в исследуемых образцах (n = 96) составляло не менее 95%.
В своей работе мы использовали активационную модель, которая отражает процесс взаимодействия Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки с антиген-презентирующими клетками (АПК) (активация Т-клеток через CD2, CD3 и CD28). Для активации Т-лимфоцитов использовали реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (CD2/CD3/ CD28-активатор, CD2/CD3/CD28-комплекс, Exp) -(Miltenyi Biotec, Германия), который представляет собой антибиотиновые частицы с биотинилирован-ными антителами против CD2 + CD3 +, CD28+.
Для определения влияния тестостерона на функциональную активность Т-лимфоцитов популяции CD45RA+ (n = 48) и CD45RO+ (n = 48) Т-клеток культивировали в 48-луночных планшетах в среде Искова (Sigma, США), содержащей 5×10−5 M мер-каптоэтанола (Acros Organics, США) и 30 мкг/мл ген-тамицина, в присутствии CD2/CD3/CD28-активатора и разных концентраций тестостерона (Test) (Sigma, США), в течение 48 ч. при 37 °C, во влажной атмосфере, содержащей 5% Ш2. Начальная концентра-
ция клеток в пробе составляла 1×106кп/мл. Реагент Сй2/Сй3/Сй28-активатор, содержащий 0,5×106 антибиотиновых MACSiBead™ частиц, добавляли в образцы в количестве 5 мкл. Соотношение клеток и активирующих частиц составляло 1:2.
В эксперименте были использованы следующие варианты культивирования:
1) интактная проба-
2) проба с добавлением Сй2/Сй3/Сй28-активатора (Exp) —
3) пробы с добавлением Exp и Test (10−7 М) —
4) пробы с добавлением Exp и Test (10−6 М) —
5) пробы с добавлением Exp и Test (10−5 М).
Дизайн исследования представлен на рис. 1.
Отсутствие популяций моноцитов (CD14+) и В-лимфоцитов (CD19 +) в культурах CD45RA+ и CD45R0+ клеток до и после культивирования подтверждали c помощью проточной цитоме-трии с использованием МКАТ, конъюгированных с FITC, PE, PE-Cy7 и PerCP (Abcam, Великобритания, e-Bio-science, США). В работе были использованы клеточные культуры, в которых содержание CD3 + CD45RA+CD14-CD19- и CD3 + CD45RO + CD14-CD19- клеток составляло в среднем 97,5±2,12%.
Для оценки воздействия тестостерона на функциональную активность Т-клеток разной степени диф-ференцировки были использованы следующие показатели: определение числа клеток, несущих на своей поверхности молекулы активации — CD25 (IL-2Ra), пролиферации — CD71 (рецептор к трансферрину) и поздней активации, апоптоза — CD95. Исследования фенотипических особенностей Т-клеток (популяций CD45RA+ и CD45RO +) проводилось с одновременной оценкой продукции Т-клетками IL-2, поскольку ранний этап активации Т-клеток является IL-2 зависимым и тесно ассоциирован с продукцией IL-2 и мембранной экспрессией молекулы CD25/IL-2Ra [14, 20, 21], тогда как экспрессия клеткой молекулы CD71 — характеризует наступление так называемой IL-2-независимой стадии активации, то есть собственно пролиферацию.
Содержание CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, экспрессирующих молекулы CD25, CD71 и CD95, определяли методом проточной цитофлуориметрии с помощью МКАТ, конъюгированных с FITC, PE, PE-Cy7 и APC (Abcam, Великобритания, e-Bioscience, США). Анализ поверхностных маркеров проводили на проточном цитофлуориметре «MACS Quant» (Miltenyi Biotec, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты цитометриче-ского анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman Coulter, США).
Процентное соотношение живых и мёртвых CD45RA+ и CD45RO+ лимфоцитов и общее количество клеток в пробе (в мл) определяли методом проточной цитофлуориметрии на аппарате Guava Easy Cyte Plus (Millipore, США) с использованием реагента и программы Guava Via Count (Millipore, США).
Содержание IL-2 в культуральных супернатантах определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем (Вектор-Бест, Россия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе Lasurit (Dynex Technologies, США). Все реакции были проведены в двух повторах.
ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ
=
я ¦о «
В
•¦J
о
г
S ¦S —
я =
& lt-
Проточная цитометрия
Оценка числа С025-позитивных клеток (п = 96)
Оценка числа CD71-позитивных клеток (п = 96)
Оценка числа С095-позитивных клеток (п = 96)
Оценка жизнеспособности клеток (п = 96)
Иммуноферментный -> Исследование содержания IL-2 в супернатантах
анализ клеточных культур
Рис. 1. Дизайн исследования
Известно, что цитокины принимают непосредственное участие в регуляции пролиферации и экспансии Т-клеток in vivo, путём регуляции экспрессии фермента теломеразы через пути сигнальной транс-дукции. Предполагают, что IL-2-зависимая активация промотора гена hTERT может быть необходима для предотвращения репликативного старения в результате интенсификации пролиферативной активности клеток [34]. В связи с этим, возникла необходимость оценить влияние тестостерона на экспрессию мРНК гена hTERT в популяциях активированных Т-клеток разной степени дифференцировки.
Для определения уровня относительной экспрессии мРНК гена hTERT выделяли тотальную РНК из клеточных культур с использованием водного раствора фенола и гуанидин-изотиоцианата (ExtractRNA kit, Евроген, Россия), согласно протоколу фирмы-производителя. Концентрацию полученной РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoVue Plus (GE Healthcare, США). Степень очистки препаратов РНК определяли по соотношению /4260/4280. Концентрации полученных образцов РНК были приведены к одному значению для получения равного количества
кДНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов MMLV RT kit (Евроген, Россия), согласно протоколу фирмы-производителя. В качестве затравки использовали олигонуклеотид-ный праймер (oligo (dT), 20 мкМ) (Евроген, Россия).
Для определения уровня относительной экспрессии hTERT проводили ПЦР в режиме реального времени с использованием специфичных гидролизуемых проб. ПЦР проводили с применением реагентов qPCRmix-HS („Евроген“, Россия). Концентрация праймеров составляла 900 нМ, гидролизуемых проб — 250 нМ. В качестве референсного гена использовали RPLPO, кодирующий рибосомальный белок P0 (табл. 1).
ПЦР была проведена в трех повторах с использованием амплификатора LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Швейцария) в следующем режиме: 95 °C, 5 мин.- 95 °C, 20 с.- 60 °C, 30 с.- 72 °C, 60 с. -45 циклов, 72 °C, 5 мин.
Расчеты уровней относительной экспрессии исследуемых генов производили с помощью модифицированной формулы Пфаффла для разных эффективностей амплификации. В нашем случае эффективность реакции (Е) была равна 2.
Таблица 1. Нуклеотидная последовательность праймеров и проб
TERT_for 5'--TGACACCTCACCTCACCCAC-3'-
TERT_rev 5'--CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC-3'-
RPLPO_for 5'--GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3'-
RPLPO_rev 5'--CCATCAGCACCACAGCCTTC-3'-
TERT_probe FAM-5'--ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG-3'--BHQ-1
RPLPO_probe HEX-5'--ATCTGCTGCATCTGCTTGGAGCCCA-3'--BHQ-1
Относительный уровень экспрессии исследуемого гена вычисляется, исходя из его эффективности ПЦР в реальном времени (Е) и разности (А) точек пересечения (CP) неизвестного образца по сравнению с контрольным (ACP = CP исследуемого образца — CP контрольного образца):
Относительный _ ?исслАСРиссл (к°& quot-тр-иссл)
уровень экспрессии? рефАСРРеф (контр-иссл)
Показатели, полученные при анализе образцов с добавлением Exp, сравнивали с аналогичными значениями интактной пробы, тогда как для образцов с добавлением комбинаций Exp и Test (в разных концентрациях), контролем служили показатели, полученные в пробах только с добавлением Exp.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Socia l Sciences). Рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (ст). Достоверность различий оценивали с использованием критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Различия считались статистически значимыми при р& lt-0,05.
Результаты и обсуждение
Данные литературы свидетельствуют, что андро-гены в целом обладают супрессивным, антипроли-феративным действием на клетки иммунной системы [3, 8, 9].
При проведении сравнительного анализа действия тестостерона на функциональную активность наивных (CD45RA+) и примированных (CD45RO +) Т-клеток, у условно здоровых лиц в зависимости от гендерных критериев, достоверных различий тестируемых параметров выявлено не было.
Test в использованном диапазоне концентраций (10−5-10−7 М) существенно не влиял на жизнеспособность активируемых CD2/CD3/CD28-комплексом наивных (CD45RA+) Т-лимфоцитов. Напротив, в отношении CD45RO+ Т-клеток его эффекты носили проапоптогенный характер, что сопровождалось достоверным увеличением мертвых Т-клеток и лимфоцитов с фенотипом CD45RO+CD95+ (в среднем, в 1,5 раза) по сравнению с пробами с добавлением только CD2/CD3/CD28-активатора (табл. 2).
Разнонаправленное действие мужских половых гормонов на активацию программированной гибели клеток-мишеней, безусловно, зависит от типа и стадии их дифференцировки [7, 10−14], а также связано с передачей сигнала внутрь клетки (геномные и негеномные эффекты стероидов) [15]. Данные, касающиеся распространённости AR на клетках
иммунной системы весьма противоречивы и имеют дискуссионный характер. Исследования N.J. Olsen и W.J. Kovacs (2001) свидетельствуют, что экспрессия AR зарегистрирована в лимфоидных и нелимфоидных клетках тимуса и костного мозга, но не в зрелых лимфоцитах периферической крови [16]. Другие авторы не обнаружили экспрессии AR на тимоцитах [17, 18]- напротив, выявлена слабая экспрессия мРНК гена АР в периферических Т-клетках [19].
Проапоптогенный эффект тестостерона, на наш взгляд, может быть обусловлен его прямым действием на примированныеD45RO +) Т-клетки, опосредованным через негеномные механизмы. Последние реализуются через быструю активацию киназ-сигнальных каскадов и модуляцию внутриклеточных уровней кальция и могут осуществляться в клеточных типах, которые не имеют функционального ядерного АР [10−12].
Далее нами были проанализированы данные, характеризующие эффекты Test на этап ранней активации наивных (CD45RA+) и примированных (CD45RO+) Т-клеток, ассоциированный с продукцией IL-2 и мембранной экспрессией молекулы CD25 [20, 21]. Молекула CD25 представляет собой а-цепь рецептора IL-2 (IL-2Ra). Появление а-цепи в составе Рус рецептора приводит к значимому возрастанию сродства рецептора к IL-2 [22, 23]. Взаимодействие IL-2 с высокоаффинным IL-2R обеспечивает запуск сигнальных событий, регулирующих вступление покоящихся Т-лимфоцитов в клеточный цикл [14, 21, 24, 25,].
Было показано, что Test на фоне активации CD45RA+ Т-лимфоцитов, независимо от концентрации (10−5-10−7 М), равномерно (в среднем, в 1,4 раза) подавлял продукцию IL-2 (p& lt-0,05). Одновременно с этим снижалось число CD25-позитивных CD45RA+ Т-клеток. На активированные CD45RO+ Т-лимфоциты действовала только максимальная концентрация гормона (10−5 М) (р1& lt-0,05) (табл. 2, 3).
Полученные результаты представляются вполне закономерными, поскольку примированные Т-лимфоциты (CD45RO +) менее зависимы от эффектов IL-2 [14, 26]. Кроме того, как уже упоминалось, на зрелых периферических Т-клетках экспрессия андрогеновых рецепторов менее выражена, чем на наивных (CD45RA+) Т-клетках [16, 19].
Ключевая функция IL-2 заключается в обеспечении перехода антиген-активированных CD4+ и СD8± лимфоцитов из G1 в S-фазу клеточного цикла, что, в конечном итоге, приводит к их пролиферации [21, 27, 28]. Эта стадия ассоциирована с экспрессией молекулы CD71 (рецептор к транс-феррину) [14, 21, 29].
Таблица 2. Содержание CD95+, CD25+, CD71+ клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, культивируемых с Т-клеточным активатором (Exp) и разными концентрациями тестостерона (Test) (М±ст)
Варианты культивирования CD45RA+ CD45RO+
Число CD95+ клеток (%)
Интактная проба 7,12±2,06 10,62±4,11
+ Exp 18,23±6,15 p0& lt-0, 05 22,16±5,11 p0& lt-0,05
Exp + Test (10−5 M) 15,43±4,54 34,21±6,15 р1& lt-0,05
Exp + Test (10−6 M) 12,45±2,31 32,34±2,99 р1& lt-0,05
Exp + Test (10−7 M) 14,32±4,39 30,42±7,30 р1& lt-0,05
Число CD25+ клеток (%)
Интактная проба 7,16±3,44 8,43±2,11
+ Exp 44,13±8,21 p0& lt-0,05 39,41±7,32 p0& lt-0,05
Exp + Test (10−5 M) 24,85±6,11 р1& lt-0,05 18,93±3,23 р1& lt-0,05
Exp + Test (10−6 M) 28,75±5,35 р1& lt-0,05 35,51±9,13
Exp + Test (10−7 M) 27,04±3,41 р1& lt-0,05 38,01±6,49
Число CD71+ клеток (%)
Интактная проба 23,78±2,06 20,62±2,11
+ Exp 32,05±6,43 p0& lt-0,05 30,42±6,12 p0& lt-0,05
Exp + Test (10−5 M) 23,76±3,28 р1& lt-0,05 22,29±2,11 р1& lt-0,05
Exp + Test (10−6 M) 25,44±4,35 р1& lt-0,05 29,07±5,20
Exp + Test (10−7 M) 29,93±4,48 р1& lt-0,05 29,05±3,09
Здесь и в таблице 3:
р0 — достоверность различий по сравнению с интактной пробой- р1 — достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением активатора Exp- р2 — достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением Exp + Test (10−5 M) — р3 — достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением Exp + Test (10−6 M).
Таблица 3. Содержание IL-2 (пг/мл) в супернатантах CD45RA+ и CD45RO+ культур лимфоцитов, культивируемых с Т-клеточным активатором (Exp) и разными концентрациями тестостерона (Test) (М±а)
Варианты культивирования Количество IL-2 (пг/мл) в супернатантах клеточных культур
CD45RA+ CD45RO+
Интактная проба 12,72±3,12 82,87±10,13
+ Exp 684,9±121,43 p0& lt-0,05 715,19±98,34 p0& lt-0,05
Exp + Test (10−5 M) 464,3±106,1 р1& lt-0,05 565,21±87,48 р,& lt-0,05
Exp + Test (10−6 M) 472,0±98,5 р1& lt-0,05 679,83±89,11
Exp + Test (10−7 M) 456,0±112,8 р1& lt-0,05 681,64±68,61
В связи с вышесказанным, вполне закономерным явилось выявленное нами снижение числа Сй71±клеток в культурах наивных (СD45RA+) и примиро-ванных (CD45RO +) Т-лимфоцитов (по сравнению с пробами с добавлением только Т-клеточного активатора). Наивные Т-клетки были чувствительны ко всему спектру действующих концентраций гормона
(10−5-10−7 М), тогда как примированные — только к максимальной концентрации (10−5 М) (см. табл. 2).
Угнетающее влияние тестостерона на этап ранней активации Т-клеток, ассоциированный с системой IL-2-IL-2R, а также на более поздний, связанный с экспрессией молекулы пролиферации CD71, в культурах Т-лимфоцитов может быть связано как
с его прямым антипролиферативным эффектом на Т-клетки [3, 8, 13, 14], так и с его ингибирующим влиянием на продукцию цитокинов на уровне транскрипции за счет подавления экспрессии фактора NF-kB [30]. В экспериментальных моделях геморрагического шока и ожога, выполненных на мышах, при которых пролиферация Т-клеток и гиперчувствительность замедленного типа были подавлены, блокада AR восстанавливала T-клеточную реакцию, которая сопровождалась увеличением продукции IL-2 и экспрессией IL-2R в Т-клетках [31, 32]. Кроме того, в эксперименте in vitro показано, что иммунокомпе-тентные клетки кастрированных мышей пролифери-руют более интенсивно, чем Т-клетки нормальных мужских особей, независимо от моделей активации [3, 8].
Таким образом, можно сделать вывод, что тестостерон подавляет T-клеточную активацию, ассоциированную с системой IL-2 и его рецептора IL-2R и следующую за ней пролиферацию за счет уменьшения сигнализации основного ростового фактора — IL-2.
Активность фермента теломеразы определяет ре-пликативный потенциал клеток, в том числе высоко-пролиферирующей популяции лимфоцитов [33−36]. В связи с этим, наибольший интерес представляла оценка влияния тестостерона, обладающего супрессивным и антипролиферативным эффектами, на экспрессию мРНК гена каталитической субъединицы hTERT, косвенно отражающей активность фермента теломеразы [35, 36].
При добавлении Test (10−5-10−7 М) в культуры наивных активированных Т-клеток регистрировалось повышение уровня экспрессии мРНК гена каталитической субъединицы фермента теломеразы — hTERT. Интересно, что самый высокий уровень экспрессии hTERT регистрировался при добавлении супрафизио-логической концентрации (10−5 М) Test. Несмотря на то, что выявленные нами изменения уровня экспрессии мРНК гена hTERT (в сторону повышения) происходили на фоне угнетения IL-2-зависимых ранних этапов активации (снижение числа CD25±Т-клеток) и пролиферации (снижение CD71±Т-клеток), тестостерон не оказывал проапоптогенный эффект на наивные Т-клетки (рис. 2, см. табл. 2).
Исходя из вышесказанного, мы сделали предположение, что тестостерон может оказывать протек-тивное влияние на репликативный потенциал CD2/ CD3/CD28-стимулированных наивных (CD45RA+) Т-клеток.
В случае примированных (CD45RO +) Т-клеток, значимое снижение экспрессии мРНК гена hTERT под действием высоких концентраций гормона (10−5-106 М) было ассоциировано с угнетением раннего, связанного с системой IL-2-IL-2R и IL-2-независимого этапов активации и сочеталось с проапоптогенным эффектом тестостерона.
Выявленные изменения могут быть опосредованы антипролиферативным эффектом тестостерона на зрелые Т-клетки [7, 10−14]. Вероятно, что тестостерон обладает способностью подавлять реплика-тивный потенциал примированных Т-клеток.
Более низкие концентрации тестостерона (10−7 М) снижали негативные эффекты гормона на CD4RO + Т-клетки, что сопровождалось повышением экспрессии мРНК гена hTERT (в среднем, в 13 раз) и увеличением числа CD45RO + CD25+ и CD45RO + CD71 + Т-клеток до уровня контрольных значений (рис. 2, см. табл. 2).
Учитывая выявленные изменения функциональной активности, индуцируемой тестостероном, можно предположить, что роль тестостерона в иммуногенезе направлена, прежде всего, на сдерживание избыточного роста примированных Т-клеток памяти и на поддержание клонального клеточного баланса в лимфоидной ткани.
Наши данные частично согласуются с другими данными других исследований. В серии экспериментов R.T. Calado и соавт. (2009) продемонстрировали стимулирующий эффект андрогенов на экспрессию гена теломеразы и ее ферментативную активность в нормальных и мутантных TERT-лимфоцитах периферической крови человека и в CD34-клетках костного мозга [37]. Они доказали, что эффекты тестостерона могут быть предотвращены блокадой рецептора эстрогена (ER) или добавлением ингибитора ароматазы [37]. Выявлено, что в условиях in vivo имеет место следующий механизм: андрогены ферментативно, под действием ароматазы, способны превращаться в эстрогены [37, 38]. Эстрадиол пассивно диффундирует в клетки и связывается с а-изоформой рецептора эстрогена (ERа), которая действует в качестве активатора транскрипции путем связывания с чувствительными элементами эстрогена в геномной ДНК [38, 39]. Авторы предполагают, что таким образом андрогены и эстрогены увеличивают экспрессию hTERT, что в конечном итоге приводит к увеличению активности теломеразы в кроветворных клетках [37].
80 70 60 50 40 30 20
? CD45RA ¦ CD45RO
J=L-
k/exp
exp t-5
exp t-6
exp t-7
Рис. 2.
Изменение относительного уровня транскрипции гена каталитической субъединицы фермента теломеразы — hTERT в наивных (CD45RA+) и примированных (CD45R0+) Т-клетках под влиянием активатора (exp) и тестостерона (test) (кратность). k/exp — отношение уровня экспрессии мРНК в контрольных образцах (без воздействия) и образцов с добавлением Т-клеточного активатора (exp) — exp t-5-t-7 — отношение уровня экспрессии мРНК в образцах с добавлением Т-клеточного активатора (exp) и в образцах с добавлением тестостерона (10−5, 10−6, 10−7 М)
Заключение
В целом, влияние тестостерона на функциональную активность наивных и примированных Т-клеток носит угнетающий характер. Более чувствительными к его проапоптогенному действию оказались CD45RО+Т-клетки. Эффекты тестостерона на продукцию-2 и экспрессию молекулы активации CD25 Т-клетками носят однонаправленный характер и не зависят от концентрации гормона. Супрессивные эффекты тестостерона в отношении системы IL-2-IL2R,
в большей степени затрагивают наивные (CD45RA+) Т-клетки (рис. 3).
Эффекты тестостерона на экспрессию мРНК гена каталитической субъединицы фермента теломера-зы hTERT определяются степенью дифференцировки Т-клеток. Выявленные нами изменения свидетельствуют о протективном влиянии высоких концентраций тестостерона на репликативный потенциал стимулированных (CD2/CD3/CD28-комплексом) наивных клеток, и, напротив, его действие на примированные Т-клетки носит угнетающий характер (рис. 3).
Обозначения:
— мембранные рецепторы-
— концентрация стероидных гормонов 109−105 М-
— дозозависимые эффекты гормонов-
— равномерное изменение значении показателей во всем спектре действующих концентраций гормонов-
— отсутствие изменений изучаемых показателей-
— однонаправленные изменения показателей-
Г
разнонаправленные изменения показателей-
•г» — секреция цитокинов- RP — репликативный потенциал
Рис. 3.
Схематичное изображение влияния тестостерона на функциональную активность Т-клеток разной степени дифференцировки (по результатам собственных исследований)
В целом, установление тонких молекулярно-кле-точных механизмов влияния стероидных гормонов на Т-клетки разной степени дифференцировки позволит расширить представления о регулирующих механизмах адаптивного иммунитета на разных этапах его реализации.
Благодарности
Исследование выполнено в рамках субсидии на выполнение государственной работы «Организация проведения научных исследований» (№ 603).
ЛИТЕРАТУРА:
1. Viselli S.M., Reese K.R., Fan J. et al. Androgens alter B cell development in normal male mice. Cell. Immunol. 1997- 182(2): 99 104.
2. Mantalaris A., Panoskaltsis N., Sakai Y. et al. Localization of androgen receptor expression in human bone marrow. J. Pathol. 2001- 193(3): 361−6.
3. Lai J.J., Lai K.P., Zeng W. Androgen receptor Influences on body defense system via modulation of innate and adaptive immune systems lessons from conditional AR knockout mice. A. J. Pathol. 2012- 181(5): 1504−12.
4. Kovacs W.J., Olsen N.J. Androgen receptors in human thymocytes. J. Immunol. 1987- 139(2): 490−3-
5. Olsen N.J., Watson M.B., Henderson G.S. et al. Androgen deprivation induces phenotypic and functional changes in the thymus of adult male mice. Endocrinology 1991- 129(5): 2471−6.
6. Olsen N.J., Kovacs W.J. Evidence that androgens modulate human thymic T cell output. J. Investig. Med. 2011- 59(1): 32−5.
7. Hince M., Sakkal S., Vlahos K. et al. The role of sex steroids and gonadectomy in the control of thymic involution. Cell. Immunol. 2008- 252 (1−2): 122−38.
8. Roden A.C., Moser M.T., Tri S.D. et al. Augmentation of T cell levels and responses induced by androgen deprivation. J. Immunol. 2004- 173(10): 6098−108.
9. Zhao S., Zhu W., Xue S. et al. Testicular defense systems: immune privilege and innate immunity. Cell. Mol. Immunol. 2014- 11(5): 428−37.
10. Heinlein C.A., Chang C. The roles of androgen receptors and androgen-binding proteins in nongenomic androgen actions. Mol. Endocrinol. 2002- 16(10): 2181−7.
11. Foradori C.D., Weiser M.J., Handa R.J. Non-genomic actions of androgens. Front. Neuroendocrinol. 2008- 29(2): 169−81.
12. Chang С., Yeh S., Lee S.O. et al. Androgen receptor (AR) pathophysiological roles in androgen-related diseases in skin, bone/ muscle, metabolic syndrome and neuron/immune systems: lessons learned from mice lacking AR in specific cells. Nuclear receptor signaling 2013- 11: е001.
13. Литвинова Л. С., Селедцов В. И., Шуплецова В. В. и соавт. Стероидная регуляция иммунной памяти. Вестник РГУ им. И. Канта 2011- 1: 77−87.
14. Литвинова Л. С., Мазунин И. О., Гуцол А. А. и соавт. Дозоза-висимые эффекты стероидных гормонов на экспрессию генов Gfi1 и U2af1l4 в Т-лимфоцитах разной степени дифференцировки. Молекулярная биология 2013- 47(4): 656−67.
15. Cunningham M., Gilkeson G. Estrogen receptors in immunity and autoimmunity. Clin. Rev. Allergy Immunol. 2011- 40(1): 66−73.
16. Olsen N.J., Kovacs W.J. Effects of androgens on T and B lymphocyte development. Immunol. Res. 2001- 23(2−3): 281−8.
17. Grossman C.J., Nathan P., Taylor B.B. et al. Rat thymic dihydrotestosterone receptor: preparation, location and physiochemical properties. Steroids 1979- 34(5): 539−53.
18. McCruden A.B., Stimson W.H. Androgen receptor in the human thymus. Immunol. Lett. 1984- 8(1): 49−53.
19. Bebo B.F. Jr, Schuster J.C., Vandenbark A.A. et al. Androgens alter the cytokine profile and reduce encephalitogenicity of myelin-reactive T cells. J. Immunol. 1999- 162: 35−40.
20. Lin J., Weiss A. T cell receptor signaling. J. Cell Sci. 2001- 114(2): 243−4.
21. Литвинова Л. С., Гуцол А. А., Сохоневич Н. А. и соавт. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов. Медицинская иммунология 2014- 16(1): 7−26.
22. Graca L., Cobbold S.P., Waldmann H. Identification of regulatory T cells in tolerated allografts. J. Exp. Med. 2002- 195(12): 1641−6.
23. Lindenmann M.J., Benczik M., Gaffen S.L. Anti-apoptotic signaling by the interleukin-2 receptor reveals a function for cytoplasmic tyrosine residues within the common gamma (gamma c) receptor subunit. J. Biol. Chem. 2003- 278(12): 10 239−49.
24. Ellery J.M., Nicholls P.J. Possible mechanism for the alpha subunit of the interleukin-2 receptor (CD25) to influence interleukin-2 receptor signal transduction. Immunol. Cell Biol. 2002- 80(4): 351−9.
25. Benczik M., Gaffen S.L. The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol. Invest. 2004- 33(2): 109−42.
26. Дейл М. М., Формен Д. Руководство по иммунофармаколо-гии Москва: Медицина- 1998.
27. Saparov A., Wagner F.H., Zheng R. et al. Interleukin-2 expression by a subpopulation of primary T cells is linked to enhanced memory/effector function. Immunity 1999- 11(3): 271−80.
28. Yamamoto М., Seki Y., Iwai K. et al. Ontogeny and localization of the cells produce IL-2 in healthy animals. Cytokine 2013- 61(3): 831−41.
29. Хаитов Р. М. Иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Москва: ГЭОТАР Медиа- 2009.
30. Li S., Guo Y., Zhu P. et al. Role of Ox-LDL/LOX-1/NF-kB signaling pathway in regulation of atherosclerotic plaque growth by testosterone in male rabbits. Vascul. Pharmacol. 2013- 59(5−6): 131−7.
31. Angele M.K., Schwacha M.G., Ayala A. et al. Effect of gender and sex hormones on immune responses following shock. Shock 2000- 14(2): 81−90.
32. Messingham K.A., Shirazi M., Duffner L.A. et al. Testosterone receptor blockade restores cellular immunity in male mice after burn injury. J. Endocrinol. 2001- 169(2): 299−308.
33. Poole J.C., Andrews L.G., Tollefsbol T.O. Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene 2001- 269(1−2): 1−12.
34. Matsumura-Arioka Y., Ohtani K., Hara T. et al. Identification of two distinct elements mediating activation of telomerase (hTERT) gene expression in association with cell growth in human T cells. Int. Immunol. 2005- 17(2): 207−15.
35. Королькова О. Ю. Экспрессия теломеразы в иммуноком-петентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях. [автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук]. Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России: Новосибирск- 2011. 18 с.
36. Benko A.L., Olsen N.J., Kovacs W.J. Estrogen and telomerase in human peripheral blood mononuclear cells. Mol. Cell. Endocrinol. 2012- 364(1−2) 83−8.
37. Calado R.T., Yewdell W.T., Wilkerson K.L. et al. Sex hormones, acting on the Tert gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood 2009- 114(11): 2236−43.
38. Xu D., Lin T.H., Yeh C.R. et al. The wedelolactone derivative inhibits estrogen receptor-mediated breast, endometrial, and ovarian cancer cells growth. BioMed research international 2014- http: // www. hindawi. com/journals/bmri/2014/713 263/.
39. Misiti S., Nanni G., Fontemaggi Y.S. et al. Induction of Htert expression and telomerase activity by estrogens in human ovary epithelium cells. Mol. Cell. Biol. 2000- 20(11): 3764−71.
Поступила 03. 12. 2014

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой