Кислотно-основные свойства нового производного мезопорфирина в водных растворах поверхностно-активных соединений

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ХИМИЯ 2007. № 8
УДК 541. 49
Т. Н. Кропачева, П. А. Юминов, В.И. Корнев
КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО МЕЗОПОРФИРИНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ПОВЕРХНОСТНОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Представлены результаты исследования солюбилизации и кислотно-основных свойств хиномезопорфирина в водных мицеллярных растворах различных ПАВ. Установлено, что солюбилизация порфирина в нейтральных растворах сопровождается разрушением агрегатов пигмента, существующих в водном растворе. Определены константы связывания порфирина с мицеллами ПАВ. Показано, что процесы протонирования основных групп солюбилизированного порфирина (пиррольные атомы азота, хинолиновый атом азота) зависят от заряда поверхности мицеллы. Константы протонирования уменьшаются в ряду: анионное ПАВ (литий додецилсульфат) & gt->- неионогенное ПАВ (Тритон Х-100) & gt- катионное ПАВ (ЦТАБ). В растворах анионного ПАВ наблюдается также значительное уменьшение диссоциации карбоксильных групп хиномезопорфирина. Полученные результаты являются важными для оптимизации состава растворов при практическом применении данного порфирина в медицинских целях.
Ключевые слова: мезопорфирин, ПАВ, солюбилизация, константы диссоциации.
Порфирины являются важнейшими фотосенсибилизаторами, нашедшими применение в фотодинамической терапии (ФДТ) раковых заболеваний. Так, Фотофрин® (производное гематопорфирина) был одобрен к использованию в антираковой терапии в большинстве стран [1−3]. Однако ни этот, ни другие используемые фотосенсибилизаторы (Визудин®, Фоскан®, Метвикс®) не являютя оптимальными для таких требований ФДТ, как интенсивное поглощение в области 600−800 нм, фотостабильность, высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода, высокое сродство к раковым клеткам и пр. В связи с этим не прекращаются попытки синтеза новых порфиринов, обладающих лучшими характеристиками. Так, недавно было синтезировано новое производное мезопорфирина — диметиловый эфир хино [4,4a, 5,6-efg] конъюгированного 7-деметил-8-деэтилмезопорфирина [4]. Предварительные исследования показали, что данное соединение является перспективным фотосенсибилизатором для использования в ФДТ: облучение видимым светом раковых клеток in vitro в присутствии низких концентраций этого порфирина (0,1−1 мкг/ мл) приводило к их гибели. В настоящей работе нами было исследовано производное данного порфирина, полученное в результате замещения СОСН3-групп на карбоксильные группы (в целях повышения растворимости соединения). Структурная формула изучаемого хиномезопорфирина представлена на рис. 1.
Рис. 1. Структурная формула хино[4,4а, 5,6-е/§] конъюгированного-7-деметил-8-деэтилмезопорфирина (хиномезопорфирина)
Нами был исследован процесс солюбилизации данного порфирина в водных мицеллярных растворах различных ПАВ. Интерес к данной системе связан с тем, что мицеллярные и липосомные растворы широко используются в клинической практике ФДТ для растворения малополярных порфиринов [5- 6]. Нами были также изучены кислотно-основные свойства солюбилизированного хиномезопорфирина, поскольку они влияют на процессы связывания порфири-на с различными носителями, включая клеточные мембраны [7−12]. Проведенное исследование показало значительное влияние природы ПАВ (анионное, катионное, неионогенное) на процесс солюбилизации хиномезопорфирина и на кислотно-основные свойства его функциональных групп.
Материалы и методика исследований
В работе использовался препарат хиномезопорфирина, синтезированный как описано в [4], а также препараты ПАВ — Тритон Х-100 (Fluka), литий доде-цилсульфат — ЛДС (Sigma), цетилтриметиламмоний бромид — ЦТАБ (Sigma).
Для изучения процесса солюбилизации аликвота исходного раствора хиномезопорфирина в воде вносилась в водный раствор с постоянным значением ионной силы 1=0,1 (0,1 М NaCl) и рН=6,5 (10мМ буферный раствор KH2PO4/ K2HPO4). Далее полученные растворы насыщались ПАВ до концентрации, превышающей ККМ примерно в 10 раз.
Изучение кислотно-основных свойств хиномезопорфирина проводилось путем добавления небольших количеств кислоты (HCl) или щелочи (NaOH) к нейтральному раствору солюбилизированного пигмента при постоянной ионной силе 1=0,1 (0,1 М NaCl).
Оптические спектры поглощения были измерены при комнатной температуре на спектрофотометре Perkin-Elmer Lambda 900 UV/VIS/NIR. Кислотность растворов измерялась с помощью иономера Metrohm 691.
Результаты и их обсуждение
Солюбилизация хиномезопорфирина. Спектр поглощения хиномезо-порфирина в нейтральном водном растворе характеризуется малоинтенсивной полосой Соре при 445 нм и длинноволновым красным максимумом при 750нм (рис. 2). Подобная форма спектра указывает на агрегацию порфирина с образованием димеров и более крупных ассоциатов. При добавлении в раствор неионогенного ПАВ Тритона Х-100 происходит постепенное изменение спектра с образованием новых интенсивных максимумов при 457 нм и 683 нм. Полученный спектр поглощения напоминает спектр мономерного хиномезопорфирина в органическом растворителе [4], что свидетельствует о мо-номеризации пигмента при его связывании с мицеллами ПАВ.
Для определения констант солюбилизации была исследована зависимость оптической плотности от концентрации Тритона Х-100, представленная на рис.З. Резкое увеличение светопоглощения наблюдается при концентрации ПАВ, превышающей ККМ (0,25 мМ). При концентрации Тритона Х-100 больше 20 мМ наблюдается практически полная солюбилизация порфирина.
1, нм
Рис. 2. Спектры поглощения хиномезопорфирина (3 мкМ) в водных растворах в присутствии различных концентраций Тритона Х-100 (указаны на графике). СРН2= 3 мкМ- рН=6,5- 1=0,1
А
0. 08−1
0. 06-
0. 04-
0. 02-
0. 00-
ККМ
10 15
CTX-100 (мМ)
20
0
5
Рис. 3. Зависимость оптической плотности растворов хиномезопорфирина от концентрации Тритона Х-100. СРН2= 3 мкМ- рН=6,5- 1= 0,1- 683 нм
Константа связывания хиномезопорфирина с мицеллами ПАВ определяется как
K [PH 2 миц ]
Kb =----------------,
b [ PH 2 ][S]
z водн
где PH2 миц — порфирин, связанный с мицеллой, PH2 водн — порфирин, находящийся в водном растворе, S- ПАВ. Кривая зависимости, А =f ([S]) описывается выражением
A = V Kb + Amax[ S ]
1/Kb + [S ] '
где A0 -исходная оптическая плотность, Amax- оптическая плотность при полной солюбилизации. Значение Кь было определенно путем математической обработки полученной кривой с использованием программы Origin 6.0. Полученная константа связывания составляет Kb = 2,0−103 M-1 или 3,2 (мг/мл)-1 (табл. 1). Аналогичные исследования солюбилизации были проведены и для других ПАВ- рассчитанные константы связывания представлены в табл. 1. Следует отметить, что солюбилизация хиномезопорфирина зависит от кислотности среды. При значениях рН& lt-4 перехода порфирина из водного раствора в мицеллярную фазу не наблюдается.
Мономерное состояние хиномезопорфирина в мицеллярных растворах является важным для его практического использования в ФДТ, так как предыдущие исследования показали, что агрегированные формы пигментов характеризуются более низкой фотосенсибилизирующей активностью. Сравне-
ние констант солюбилизации хиномезопорфирина в мицеллах ПАВ (табл. 1) с литературными данными по взаимодействию родственных по структуре пор-фиринов с липидными везикулами (Кь=133 (мг/мл)-1 для мезопорфирина, Кь =122 (мг/мл)-1 для протопорфирина [13]) указывает на меньшую степень связывания пигмента с носителем в случае мицеллярных систем.
Таблица 1
Константы солюбилизации хиномезопорфирина
в растворах ПАВ (рН=6,5- =0,1)
ПАВ Kb, M -1 Kb, (мг/мл)-1
Тритон X-100 2,0−103 (±0,2−103) 3,2 (±0,3)
ЦТАБ 9,5−103 (±0,6−103) 26,1 (±1,5)
ЛДС 0,2−103 (±0,02−103) 0,7 (±0,1)
Кислотно-основные свойства солюбилизированного хиномезопорфирина. Изучение кислотно-основных равновесий солюбилизированного хиномезопорфирина не осложнено процессом самоассоциации пигмента, как это наблюдалось для водных растворов других малополярных порфиринов [7- 8]. На рис. 4 представлены спектры поглощения хиномезопорфирина при различных значениях рН раствора. При подкислении нейтрального раствора в области 2& lt-рН<-5 наблюдается значительное изменение спектра- уменьшение максимума при 683 нм и одновременный рост максимума при 728 нм.
1, нм
Рис. 4. Спектры поглощения хиномезопорфирина при различных значениях рН (указаны на графике) в мицеллярных растворах Тритона Х-100. СРН2= 4,5
мкМ- Стх-100 =15 мМ
А
0. 12-
0. 10-
0. 08-
0. 06- V
0. 04- 0. 02- Q & amp- irr
0. 00-
П. -0 — - е- - о- - ?& gt-
_-б
01 _.
• 728 нм ° 683 нм
-I-----1−1-1−1-1−1-1-
23 456 789
pH
10
Рис. 5. Зависимость оптической плотности хиномезопорфирина в мицелляр-ных растворах Тритона Х-100 от рН раствора. СРН2 = 4,5 мкМ- СТХ-100 =15 мМ
Полоса Соре при 457 нм уменьшается и смещается до 475 нм. Эти изменения характеризуются наличием нескольких изобестических точек. При подщелачивании нейтрального раствора в области 6& lt-рН<-8 наблюдается ги-перхромный эффект (рис. 4).
На рис. 5 представлены кривые зависимости оптической плотности раствора от рН для нескольких длин волн. В области низких рН возможно протонирование атома азота хинолинового цикла или иминных атомов азота тетрапиррольного макроцикла (рис. 1):
«+ [PH 2][я+г
2+п ' [рн 2±+ ]
Математическая обработка кривой Л={(рН) позволяет определить константу протонирования (К) и количество ионов водорода, участвующих в процессе (п). Общая концентрация порфирина:
С = [ PH 2] + [ PH 2+п + ].
Оптическая плотность раствора (для /=1см):
Л = еPH 2[PH2] + еPH2+» [PH2+пП+ ],
Л = е С- Л = е С
рн2 ьрн2^' рн2+" ьрн2+•
Отсюда несложно получить:
Л — Лрн 1§ Л------Л = Рк + «pH.
Лрн Л
рн 2+п
Из этого уравнения выражаем, А:
APH + APH • 10(npH-pK)
A __ 2+n PH 2
1 +10
(npH — pK)
Значения n и pK, входящие в данное уравнение, были определены с помощью программы Origin 6.0. Полученные значения для растворов Тритона Х-100 составляют n = 1 (± 0,05) и pK = 3,28. Участие в реакции одного иона водорода, а также близость определенной константы протонирования к константе протонирования свободного хинолина (pK ~ 3,3) позволяют отнести
г4
данное равновесие к протонированию атома азота 5 конъюгированного хинолинового цикла хиномезопорфирина (рис. 1).
Изменение оптической плотности в области at 5& lt-pH<-8 связано с диссоциацией двух карбоксильных групп хиномезопорфирина. Ступенчатая диссоциация (PH2 = PH'- + H+ и PH'- = P2'- + Н+) характеризуется константами
K _ [PH~][H+] K _ [P2-][H+]
fl1 [ PH 2] ' fl 2 [ PH — ] '-
Вследствие близости констант диссоциации, при выводе уравнения, описывающего зависимость A=f (pH), необходимо учитывать одновременное присутствие в растворе трех частиц:
C= [PH2] + [PH'- ] + [P2-].
Тогда (для /=1см)
A _? PH 2[ PH 2] +? PH [ PH — ] +? P [ P 2- ].
Несложно показать, что
APH2 • 10(K+pKa2−2pH) + i (APH2 + AP2-) • 10(pK2-pH) + AP2-
A ______2____________________2_____2__________________________
1 + 10(pKa 2 — pH) + 10(pKal + pKa 2 — 2 pH)
Расчеты показали, что для растворов в Тритоне Х-100 значения констант диссоциации карбоксильных групп хиномезопорфирина составляют: рКа1 = 5,56, рКа2 = 6,39.
Аналогичные исследования кислотно-основных свойств хиномезопор-фирина были проведены в случае мицеллярных растворов катионного ПАВ (ЦТАБ) и анионного ПАВ (ЛДС). Наблюдаемые спектральные изменения при изменении рН в растворах ЦТАБ были похожи на описанные выше для растворов порфирина в Тритоне Х-100. Однако в случае ЛДС наблюдались значительные различия (рис. 6). Появление максимума при 732 нм происходит при значительно более высоких рН среды (4& lt-рН<-6) (рис. 6 А). При более низких рН наблюдается образование нового максимума при 690 нм (рис. 6Б) с одновременным смещением полосы Соре. Кривые зависимости Л=: РрН) для хиномезопорфирина, солюбилизированного в мицеллах ЛДС, представлены на рис. 7. Математическая обработка полученных кривых показывает, что
спектральные изменения, представленные на рис. 6А, связаны с участием одного протона (рК= 5,62), а на рис. 6Б — с участием двух протонов (рК=3,57). Таким образом, в мицеллярных растворах ЛДС наблюдается протонирование не только хинолинового атома азота, но и двух пиррольных атомов азота N22 и N24 порфиринового макроцикла (рис. 1). Данные по кислотно-основным свойствам солюбилизированного хиномезопорфирина для всех ПАВ приведены в табл. 2.
1, нм
1, нм
Рис. 6. Спектры поглощения хиномезопорфирина при различных значениях рН (указаны на графике) в мицеллярных растворах додецилсульфата лития. СрН2 = 5 мкМ- Слдс = 45 мМ
А
G. 2G-
G. 16-
G. 12-
G. G8-
G. G4-
G. GG-
Vi '-'-'- е-0'-63'-00
& gt- 0°
& lt- '- 0
• 732 нм
ш? 69G нм
• '-'- Р О 683 нм
4
1−1-1−1-1−1-1−1-1−1-
G123456789 1G
pH
Рис. 7. Зависимость оптической плотности хиномезопорфирина в мицелляр-ных растворах додецилсульфата лития от рН раствора. СРН2 = 5 мкМ- Слдс = 45 мМ
Таблица 2
Константы диссоциации хиномезопорфирина в водных растворах ПАВ (I= 0,1)
ПАВ pK: (n=2- пирроль-ные атомы азота) pK2 (n=1-хинолиновый атом азота) pKs (n=1- COOH группа) pK4 (n=1- COOH группа)
Тритон Х-iGG — 3,28 (±G, G4) 5,56 (±G, G7) 6,39 (±G, G8)
ЦТАБ — 2,94 (±G, G5) 5,5G (±G, 14) 6,3G (±G, 12)
ЛДС 3,57 (±G. G6) 5,62 (±G, 15) 7,92 (±G, 11) 8,85 (±G, 12)
Анализ полученных данных показывает, что константы протонирования атомов азота (N54, N22 и N24) зависят от природы ПАВ и увеличиваются в ряду ЦТАБ & lt- Тритон Х-100& lt-ЛДС. Наиболее сильное протонирование, наблюдаемое в растворах анионного ПАВ (ЛДС), указывает на то, что отрицательный заряд поверхности мицелл способствует стабилизации катионов порфирина (PH3+, PH/+, PH53+), образующихся при протонировании. Напротив, положительный поверхностный заряд мицеллы в случае ЦТАБ препятствует протонированию.
Константы диссоциации двух карбоксильных групп хиномезопорфири-на (табл. 2) близки (А рК& lt-1), что является типичным и для других порфири-нов [7- 9−12]. Значения констант диссоциации приблизительно одинаковы в растворах Тритона Х-100 и ЦТАБ и значительно выше в случае анионного ПАВ (ЛДС). Очевидно, что в последнем случае образование диссоциирован-
ной формы СОО менее благоприятно вследствие ее дестабилизации отрицательно заряженными сульфогруппами поверхности мицеллы. Значительное влияние природы полярных групп ПАВ на константы диссоциации хиноме-зопорфирина указывает на то, что солюбилизированный порфирин располагается на поверхности мицеллы, а не проникает в ее ядро. Особенно сильное воздействие на константы диссоциации оказывает анионное ПАВ -наблюдается смещение рК в область более положительных значений на две-три единицы (табл. 2). Влияние катионного ПАВ на диссоциацию исследуемого порфирина менее значительно.
Полученные результаты показывают, что в физиологических условиях (рН 7,4) хиномезопорфирин способен эффективно связываться с мицеллами различной природы. Таким образом, мицеллярные растворы хиномезопорфи-рина могут применяться для его инъекций при использовании в качестве фотосенсибилизатора в ФДТ. Протонирование атомов азота хиномезопорфири-на не происходит в физиологических условиях. Напротив, диссоциация карбоксильных групп хиномезопорфирина имеет важное значение. Более низкое значение кислотности среды (рН 5,5 — 6,5) в случае раковых клеток, по сравнению с нормальными, приводит к неинизированному состоянию COOH групп, что облегчает проникновение порфирина через клеточные мембраны. Таким образом, полученные результаты являются важным шагом для разработки системы транспортировки малорастворимых порфиринов для их использования в медицинской практике [14].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Regan D., Parris J.A. (Eds.). The Science of Photomedicine. New York, 1982.
2. Bonnett R. Clinical aspects of photodynamic therapy. Gordon and Breach Scientific Publishers. Amsterdam, 2000.
3. Kadish K.M., Smith K.M., Guilard R. (Eds.). Porphyrin Handbook. San Diego: Academic Press, 2000. Vol. 6. Р. 157−230.
4. The synthesis of the dimethyl ester of quino [4,4a, 5,6-e/g]-annulated- 7-demethyl-8-deethylmesoporphyrin and three of its isomers with unprecedented peri-condensed quinoline porphyrin structures. Molecules with outstanding properties as sensitizers for photodynamic therapy in the far-red region of the visible spectrum // Eur. J. Org. Chem. 2004. Vol. 19. Р. 4024−4038.
5. Hoebeke M. The importance of liposomes as models and tools in the understanding of photosensitization mechanisms // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1995. Vol. 28. Р. 189.
6. Reddi E. Role of delivery vehicles for photosensitizers in the photodynamic therapy of tumours // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1997. Vol. 37. Р. 189−196.
7. Brault D., Vever-Bizet C., Le Doan T. Spectrofluorimetric study of porphyrin incorporation into membrane models- evidence for pH effects // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 857. Р. 238−250.
8. Brault D., Vevet-Bizet C., Kuzelova K. Interactions of dicarboxylic porphyrins with membranes in relation to their ionization state // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1993. Vol. 20. Р. 191−195.
9. Kuzelova K., Brault D. Interactions of dicarboxylic porphyrins with unilamellar lipi-dic vesicles: drastic effect of pH and cholesterol on kinetics // Biochemistry. 1995. Vol. 34. Р. 11 245−11 255.
10. Kepczynski M., Ehrenberg B. Interaction of dicarboxylic metalloporphyrins with liposomes. The effect of pH on membrane binding revisited // Photochem. Photobiol.
2002. Vol. 76. Р. 486−492.
11. Bonneau S., Maman N., Brault D. Dynamic of pH-dependent self-association and membrane binding of a dicarboxylic porphyrin: a study with small unilamellar vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1661. Р. 87−96.
12. Bronshtein I., Smith K.M., Ehrenberg B. The effect of pH on the topography of porphyrins in lipid membranes // Photochem. Photobiol. 2005. Vol. 81. P. 446−451.
13. Kepczynski M., Pandian R.P., Smith K.M., Ehrenberg B. Do liposome binding constants of porphyrins correlate with their measured and predicted partitioning between octanol and water? // Photochem. Photobiol. 2002. № 76. Р. 127−134.
14. Lang K., Mosinger J., Wagnerova D.M. Photophysical properties of porphyrinoid sensitizers non-covalently bound to host molecules- models for photodynamic therapy // Coord. Chem. Rev. 2004. Vol. 248. Р. 321−350.
Поступила в редакцию 18. 05. 07
T.N. Kropacheva, Р.А. Juminov, V.I. Kornev
Acid-base properties of the new mesoporphyrin derivative in aqueous surfactant solutions
Solubilization and acid-base properties of quinomesoporphyrin are studied in aqueous solutions of different surfactants. It is found that solubilization process in neutral pH leads to dissociation of pigment aggregates existing in aqueous solutions. The binding constants of porphyrin to surfactant micelles are determined. It is shown that protonation of basic qui-nomesoporphyrin groups (pyrrole nitrogens, quinoline nitrogen) is dependent on the surface charge of a micelle. The protonation constants are decreased in the order: anionic surfactant (lithium dodecylsulphate) & gt->- non-ionic surfactant (Triton X-100)& gt- cationic surfactant (CTAB). The dissociation of COOH-groups of quinomesoporphyrin is essentially decreased in solutions of the anionic surfactant. The obtained results are important for the optimal choice of solution composition during practical application of the studied porphyrin in medical purposes.
Кропачева Татьяна Николаевна Юминов Павел Андреевич Корнев Виктор Иванович
ГОУВПО «Удмуртский государственный университет»
426 034, Россия, г. Ижевск,
ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: krop@uni. udm. ru

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой