Определение гентамицина и неомицина в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 543. 63- 545. 9- 681. 518. 22
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНТАМИЦИНА И НЕОМИЦИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА
1Фарафонова О.В., 1Ермолаева Т.Н., 2Еремин С.А.
ФГБОУ ВПО Липецкий государственный технический университет, Липецк, e-mail: farafonova. ov@mail. ru- 2ФГБОУ В О Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва
Предложены методики определения гентамицина и неомицина в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Синтезированы трейсеры, рассчитаны константы трейсеров (KT) и аффинности поликлональных антител (Кдф), выбраны оптимальные пары иммунореагентов для определения антибиотиков. Рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (ПР %), значения которых указывают на возможность селективного определения гентамицина и неомицина в присутствии соединений родственной структуры. Градуировочный график линеен в диапазоне 40−5100 нг/мл для гентамицина и 702 800 нг/мл для неомицина, предел обнаружения гентамицина и неомицина — 9 и 61 нг/мл соответственно. Исследованы экстракционные системы на основе ацетонитрила, гексана, дихлорэтана, ацетона, метанола и фосфатного буферного раствора для выделения неомицина и гентамицина из мяса и яиц. Разработанные методики апробированы для анализа куриного мяса, яиц, молока.
Ключевые слова: пищевой анализ, гентамицин, неомицин, антибиотики
GENTAMICIN AND NEOMYCIN DETERMINATION IN FOOD BY POLARIZED FLUORESCENCE IMMUNOASSAY
Farafonova O.V., 1Ermolaeva T.N., 2Eremin C.A.
'-FGBOU VPO Lipetsk State Technical University, Lipetsk, e-mail: farafonova. ov@mail. ru- 2FGBOU VOMoscow State UniversityM.V. Lomonosov, Moscow
Developed the determination techniques of gentamicin and neomycin in food by fluorescence polarization immunoassay. Synthesized tracers, calculated tracers constants (KT) and polyclonal antibodies affinity constants (KAf), selected the best immunoreagents pair for antibiotics determination. Calculated cross-response coefficients (PR %& gt-), which values indicate the possibility of selective determination of gentamicin and neomycin with the presence of related structure compounds. The calibration curve was linear in the 40−5100 ng/ml range for gentamicin and 702 800 ng/mL range for neomycin, detection limits for gentamicin and neomycin are 9 and 61 ng/ml, respectively. Studied extraction systems based on acetonitrile, hexane, dichloroethane, acetone, methanol and a phosphate buffer solution for separation of neomycin and gentamycin from the meat and eggs. The developed method was tested for the analysis of chicken meat, eggs, milk.
Keywords: food analysis, gentamicin, neomycin, antibiotics
Неконтролируемое использование гентамицина и неомицина для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, птицы и пчёл приводит к их накоплению в мышечных тканях животных, молоке, мёде, яйцах. У людей, потребляющих в пищу такие продукты, возможно возникновение аллергических реакций, появление устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, что затрудняет проведение лечения. Регламентированная ВОЗ предельно допустимая концентрация гентамицина в мясе крупного рогатого скота и свиней составляет 100 мкг/кг, в молоке 200 мкг/л, неомицина во всех пищевых продуктах 500 мкг/кг [1 — 3]. В продуктах для детского питания неомицин и гентамицин должны отсутствовать.
Наиболее часто для определения ами-ногликозидных антибиотиков применяют микробиологические и физико-химические методы, имеющие ряд недостатков и ограни-
чений по продолжительности и чувствительности. Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) позволяет выявлять токсиканты непосредственно в пробе без предварительного выделения и характеризуется относительно высокой чувствительностью, поэтому может быть рекомендован для анализа пищевых продуктов. ПФИА уже положительно зарекомендовал себя для определения антибиотиков в медицинской практике [4 — 6], в тоже время методики определения гентамицина и неомицина в пищевых продуктах до настоящего времени не опубликованы.
Цель настоящего исследования — разработка методик определения гентамицина и неомицина в курином мясе, яйцах и молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.
Материалы и методы исследования
Реактивы: азид, хлорид натрия, сульфат аммония, ацетонитрил, метанол, этанол, хлороформ, аце-
тон, N-гидроксисукцинимид (о.с.ч., «Sigma-Aldrich», США), триэтиламин, диметилформамид (х.ч. «Merck», Германия) — гентамицин (GENT), неомицин (NEO).
Использовали следующие антитела к гентами-цину: поликлональные -ПАГ-1 («Abcam», Англия) — ПАГ-2 (Китай), ПАГ-3, ПАГ-4, ПАГ-KLH-5 -сконъю-гированные с гемоцианином (Королевский колледж, Лондон, Великобритания) — моноклональные МАГ (Голландия). Поликлональные антитела к неомицину: ПАН-1 (Китай), ПАН-2 (Королевский колледж, Лондон, Великобритания).
Синтез трейсеров. Для синтеза трейсеров гента-мицина в качестве метки использовали — флуоресце-инизотиоционат (ФИТЦ) и 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин (ДТАФ) («Sigma», США). Трейсер неомицина синтезировали с помощью ФИТц. В водно-метанольную смесь для связывания только через одну NH2- группу препарата вводили избыток антибиотика (130 мкмоль). Выделение антибиотиков, меченных флуоресцентной меткой, осуществляли методом тонкослойной хроматографии.
Пробоподготовка мяса и молока. Для извлечения неомицина и гентамицина из куриного мяса и яиц 10 г пробы гомогенизировали, добавляли 100 мл экс-трагента и перемешивали в течение 1 ч, (через 20 мин вводили 30 мл 18%-ого сульфата аммония). Экстракт отделяли фильтрацией и дополнительно очищали от денатурированных белков центрифугированием на настольной центрифуге ЦЛН-2 (КиргизИНТИ, Кир-гизстан) в течение 8 мин (7000 об/мин). Супернатант использовали для анализа.
Молоко, содержащее менее 2,5% жира, анализировали после 3-х кратного разбавления боратным буферным раствором. При содержании жира более 2,5% к 10 мл пробы (молоко, разбавленное в 3 раза) добавляли 5 мл метанола для гидролиза жиров и вводили 2 мл сульфата аммония. Осадок отделяли центрифугированием (3 мин, 7000 об/мин).
Проведение анализа методом ПФИА. К 50 мкл супернатанта добавляли 400 мкл трейсера фиксированной концентрации и 50 мкл антител с концентрацией соответствующей 50% связыванию. Смесь перемешивали и измеряли поляризацию флуоресценции (двухстадийный формат анализа).
При проведении анализа в одностадийном формате к супернатанту добавляли 450 мкл предварительно синтезированного комплекса антител с трей-сером. Для получения комплекса к 500 мл раствора антител с известной концентрацией добавляли 500 мл раствора трейсера. Инкубировали при 25 °C в течение 2 ч и хранили в темном месте при 4 °C.
Результаты исследования и их обсуждение
Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ основан на конкуренции определяемого антигена с антигеном, меченным флуоресцентной меткой (трейсер), за ограниченное число центров связывания специфических антител. Аналитическим сигналом в ПФИА служит поляризация флуоресценции, величина которой зависит от концентрации трейсера и антител, строения флуоресцентной метки, присоединяемой к молекуле определяемого соединения, степени очистки трейсера, а также значения
констант трейсера (КТ) и аффинности (Кф), указывающих на сродство антител к трей-серу и определяемому соединению [7 — 8].
Выбор концентрации трейсеров осуществляли с учетом величины интенсивности флуоресценции [9]. По максимуму на спектре поглощения при длине волны 492 нм установлены концентрации трейсеров GENT-ФИЩ- GENT-ДТАФ (250 нг/мл и 40 нг/мл) и NEO-ФИТЦ (180 нг/мл) соответственно. Интенсивность флуоресценции при этом превышает сигнала фона (борат-ного буферного раствора) в 15 раз.
С помощью графической зависимости mP = f (lg V) с учетом значений mPmax (максимальное значение поляризации флуоресценции для линейного участка графика) и диапазона линейности, определена рабочая концентрация антител (С), соответству-
Д 4 антител7'- J
ющая 50%-ному связыванию в иммуноком-плекс. Использование концентраций антител за пределами линейных зависимостей приводит к искажению сигнала из-за неспецифического связывания трейсера с посторонними компонентами сыворотки. Отмечено, что при применении трейсера с флуоресцентной меткой ДТАФ наблюдается более низкое значение mP по сравнению с трей-сером на основе
вышение предельного значения mP (100 ед) для всех реагентов, кроме и GENT-ДТАФ (mPmax=89), более низкий предел обнаружения и широкий диапазон определяемых содержаний гентамицина достигаются только при применении антител ПАГ-1, ПАГ-3, ПАГ-4 или антител ПАН-1 при детектировании неомицина (табл. 1).
Для оценки сродства и специфичности определяемых соединений и антител по методике Скэтчарда установлены константы аффинности моноклональных антител. Поскольку поликлональные антитела представляют собой смесь высоко и низко аффинных фракций для них рассчитаны сред-невесовые значения КАф [6].
Возможность использования иммуно-реагентов для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа оценивали путем сопоставления констант трейсера и констант аффинности (табл. 2).
Установлено, что во всех случаях константа аффинности превышает константу трейсера на 2 порядка (кроме пары ПАГ-1 и GENT-ДТАФ, для которой это отличие незначительно), что указывает на большее сродство антител к определяемым соединениям, чем к соединениям, связанным флуоресцентной меткой и возможность вытеснения трейсера аналитом из комплекса с антителами. Максимальные значения К ^
АФ
и различие между КТ и КАф наблюдаются
международный журнал прикладных и фундаментальных исследований № 11, 2015
при применении трейсеров GENT-ФИТЦ, ШОМ-ФИТЦ и антисывороток ПАГ-3, ПАН-1. Эти пары иммунореагентов были использованы для разработки методик определения гентамицина и неомицина.
Оценку специфичности поликлональных антител осуществляли по значениям коэффициентов перекрестного реагирования (ПР %). Как видно из табл. 3 антитела ПАГ-1 и ПАН-1 показывают 100% связывание с гентами-цином и неомицином и небольшие значения ПР % с другими соединениями родственного строения, которые могут присутствовать в пищевых продуктах. Это в первую очередь стрептомицин, входящий в состав комбинированных ветеринарных препаратов наряду с гентамицином (ПР % менее 0,1) и бацитра-цин, применяемый как кормовой антибиотик, следовательно, при применении этих антител возможно селективное определение гентамицина и неомицина методом ПФИА.
Изучены условия определения антибиотиков с использованием антител предварительно связанных с трейсером в иммуно-комплекс. Сопоставлены метрологические характеристики определения неомицина и гентамицина методом ПФИА с применением комплексов антител с трейсером (односта-
дийный формат анализа) и свободных (двух-стадийный формат анализа) антител (табл. 4). Отмечено, что применение комплексов антител с трейсером не приводит к изменению диапазона определяемых содержаний и снижению предела обнаружения. В тоже время повышается стабильность раствора антител, так при повторном анализе не наблюдается отклонения от градуировочного графика (срок хранения возрастает с 7 до 50 дней), однако продолжительность получения аналитического сигнала увеличивается с 7 до 20 мин).
Для выделения неомицина и гентами-цина из куриного мяса и яиц применяли экстракционные системы на основе аце-тонитрила, гексана, дихлорэтана, ацетона, метанола и фосфатного буферного раствора (рН 7,2). Сопоставление значений R % антибиотиков показало, что только фосфатный буферный раствор, содержащий сульфат аммония, и ацетонитрил обеспечивают практически полное извлечения лекарственных препаратов из мяса и яиц ^ 96%). Применение в качестве экстрагентов гексана, ацетона, дихлорэтана менее эффективно.
Разработанные методики апробированы при анализе куриного мяса, яиц и молока (табл. 5).
Таблица 1
Выбор рабочей концентрации антител для определения гентамицина и неомицина
Антитела Трейсер mP Диапазон линейности (lg V) С, мг/мл
ПАГ-1 ДТАФ 215 2−4 0,20
ФИТЦ 245 2−5 0,17
ПАГ-3 ДТАФ 189 3−5 0, 18
ФИТЦ 202 3−5 0, 15
ПАГ-4 ДТАФ 148 2−4 0,35
ФИТЦ 165 2−5 0,27
ПАГ-КЬН-5 ДТАФ 89 2−3 0,09
ФИТЦ 112 2−3 0,08
ПАГ-2 ФИТЦ 152 2−4 0,41
МАГ ФИТЦ 178 2−3 0,26
ПАН-1 ФИТЦ 164 2−4 0,15
ПАН-2 ФИТЦ 153 2−3 0,28
Таблица 2
Константы аффинности и константы трейсера
Пара иммунореагентов К4Ф-10 -8 К/10 -6
GENT-ФИЩ + ПАГ-1 3,6 4,1
СЕОТ-ДТАФ+ ПАГ-1 0,2 9,8
GENT-ФИТЦ + ПАГ-3 18,2 6,4
GENT-ДТАФ+ПАГ-З 5,6 0,2
GENT-ФИТЦ + ПАГ-4 4,5 4,7
GENT-ФИТЦ + ПАГ-2 5,6 1,2
GENT-ФИТЦ + МАГ 2,3 0,7
NEOM-ФИТЦ +ПАН-1 32,5 1,9
Таблица 3
Коэффициенты перекрестного реагирования (ПР %) поликлональных антител
Структурные аналоги ПР % для гентамицина ПР % для неомицина
Гентамицин 100,0 1,0
Канамицин & lt- 0,1 3,2
Стрептомицин & lt- 0,1 1,2
Дигидро стрептомицин & lt- 0,1 1,0
Амикацин 5,0 0, S
Неомицин & lt- 0,1 100,0
Тобрамицин 3,0 4,3
Бацитрацин 2,5 5,7
Таблица 4
Метрологические характеристики определения гентамицина и неомицина методом ПФИА
Иммунореагенты Двухстадийный Одно стадийный
С нг/мл min, Диапазон определяемых содержаний, нг/мл С нг/мл min, Диапазон определяемых содержаний, нг/мл
GENT-ФИЩ + ПАГ-1 11 50−4500 9 40−5100
NEOM-ФИЩ +ПАН-1 50 70−2500 б1 70−2S00
Таблица 5
Результаты определения гентамицина и неомицина в экстракте из пищевых продуктов (P = 0,95, n = 3)
Объекты исследования Найдено гентамицина, нг/мл Найдено неомицина, нг/мл
Грудки куриные Канада 78 ± 1 55 ± 4
Москва, Россия 105 ± 1 0,15 ± 0,1
Липецк, Россия 57 ± 2 60 ± 6
Яйца «Золотой петушок» Липецк, Россия 62 ± 3 не обнаружено
Методики характеризуются высокой воспроизводимостью и селективностью. Не выявлено превышения регламентируемого содержания неомицина в курином мясе, яйцах и молоке, концентрация гентамицина в мясе превышает нормативы, установленные для стран ЕС (100 мкг/кг).
Заключение
Предложены методики определения гентамицина и неомицина на уровне ПДК и ниже в пищевых продуктах методом ПФИА. Градуировочный график линеен в диапазоне 40−5100 нг/мл для гентамици-на и 70−2800 нг/мл для неомицина, предел обнаружения гентамицина и неомицина 9 и 61 нг/мл соответственно. Методики апробированы при определении антибиотиков в курином мясе, яйцах и молоке.
Список литературы
1. Kaufmamn A. Determination of 11 Aminoglycosides in Meat and liver by liquid chromatography with tandem mass spectrometry / A. Kaufmamn, K. Maden // Journal of AOAC International. — 2005. — V. 88. — P. 1118−1125.
2. Кальницкая О. И. Уровень обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, полученных из отечественного и им-
портного сырья / О. И. Кальницкая, А. Н. Туник, Б. В. Уша // Ветеринария. — 2007. — № 4. — С. 48−53.
3. Jin Y. Development of ELISA and immunochromato-graphic assay fort he detection on gentamicin / Jin Y., Jang J.K., Han C.H., Lee M. H. J. //Vet Sci. — 2006. — No 7. — P. 111−117.
4. Zhang S. Fluorescence Polarization Immunoassay based on a Monoclonal Antibody for the Detection of Sulfamethazine in chicken muscle / Zhang S., Wang Z., Nesterenko I.S., Er-emin S.A., Shen J. //Int. J. Food Sci. Tech. — 2007. — V. 42. -P. 36−44.
5. Tsuruoka M. Rapid Hybridization at High Salt Concentration and Detection of Bacterial DNA Using Fluorescence Polarization / Tsuruoka M., Karube I. //Comb. Chem. High T. SCR. — 2003. — V. 3. -P. 225−234.
6. Goryacheva I. Yu. Rapid all-in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of ochratoxin A in high-coloured herbs and spices/ Goryacheva I. Yu., Saeger S. De, Nesterenko I.S., Eremin S.A., Peteghem C. Van. //Talanta. -2007. — V. 72. — P. 1230−1234.
7. Воронежцева О. В. Определение аминогликозидных антибиотиков в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа / Воронежцева О. В., Еремин С. А., Ермолаева Т. Н. // Вестник ВГУ: серия химия, биология, фармация, Воронеж. — 2009. — № 2 (июль-декабрь). — С. 11−18.
8. Воронежцева О. В. Иммунохимические методы определения аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов.: Автореф. дис. канд. хим. наук. — Воронеж, 2011. — 18 с.
9. Farafonova O.V. Determination of aminoglycosides in food by fluorescence polarization immunoassay / Farafonova O.V., Vasiliev S.V., Eremin S.A., Ermolaeva T.N. // Международный научно-исследовательский журнал. -2015. — № 7−2 (38). — Р. 65−69.
международный журнал прикладных и фундаментальных исследований № 11, 2015

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой