Клонирование альтернативных изоформ каталитической субъединицы теломеразы человека (hTERT)

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 618. 146−006. 04:577. 152]-07
Хоменков В. Г1., Скоблов М. Ю2., Короленкова Л. И1., Киселев Ф. Л. 1
клонирование альтернативных изоформ каталитической субъединицы теломеразы человека (ьтект)
1ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАН, 2 ФГБУ «Медико-генетический научный центр»
РАН, г Москва
Большинство опухолей человека, в том числе и опухоли шейки матки, характеризуются активацией теломеразы, фермента, играющего ключевую роль в контроле пролиферации клеток за счет удлинения концевых участков хромосом — теломеров. Ген этого фермента кодирует РНК, которая в опухолевых клетках выявляется в нескольких изоформах. В качестве модельного объекта для изучения роли РНК hTERT в процессах активации и контроля пролиферации клеток нами был выбран рак шейки матки и его предо-пухолевые состояния (CIN). В данной работе проведено клонирование изоформ hTERT человека (нормальной, a-, ?- и a+?-сплайс-вариантов). Получены генетические конструкции, содержащие нормальную последовательность hTERT, a- и ?-делеционные варианты на базе целевого лентивирусного вектора pR780. В силу методических сложностей a+?- делеционный вариант в этом векторе получить на данный момент не удалось. В дальнейших работах мы планируем провести исследование сплайс-вариантов hTERT в эукариотической системе клеток человека. Ключевые слова: клонирование- теломераза- рак шейки матки.
Теломераза является одним из ключевых ферментов, контролирующих пролиферацию клеток. Теломераза — рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из молекулы РНК — (TR-РНК), белка теломеразной обратной транскриптазы — TERT [1] и ряда ассоциированных белков. Ген теломеразной обратной транскриптазы расположен на коротком плече хромосомы 5 и состоит из 16 экзонов. Известно 13 альтернативных вариантов сплайсинга мРНК hTERT [2−5].
Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Эта активность выявлена в некоторых клетках крови, в репродуктивных тканях и некоторых быстро обновляющихся тканях, например, в кишечном эпителии и ба-зальном слое клеток кожи [6]. Активность теломеразы выявлена практически во всех опухолях и опухолевых клетках, культивируемых in vitro [7].
В опухолевых клетках при активации теломеразы мРНК hTERT представлена несколькими сплайсирован-ными формами. Основными среди них являются нормально сплайсированная (полноразмерная), a-форма, ?-форма и a+?-форма.
Одной из удобных опухолей для изучения активности различных сплайсированных форм hTERT является рак шейки матки, который принадлежит к числу наиболее распространенных онкологических заболеваний у женщин. Отличительной особенностью опухолей шейки матки является присутствие генома вирусов папиллом (HPV) так называемого «высокого риска». Рак шейки матки является стадийным заболеванием, и ранняя диагностика является одним из важнейших элементов в профилактике и лечении этого заболевания. Поражения шейки матки, в той или иной степени связанные с развитием опухолевого процесса, можно условно разделить на 2 группы — предопухолевые (так называемые церви-кальные интраэпителиальные неоплазии — CIN разных
стадий) и непосредственно опухоли. Предопухолевые поражения характеризуются рядом характерных морфологических изменений, которые достаточно четко верифицируются при гистологическом и цитологическом исследовании.
Ранее нами в этих опухолях были получены доказательства активации теломеразы и поддержания ее на высоком уровне в опухолях с использованием так называемого TRAP-теста, связанного с детекцией ферментативной активности теломеразы, осуществляющей удлинение концевых фрагментов ДНК (теломеров). [8]
Была проанализирована также экспрессия трех из наиболее часто встречаемых изоформ мРНК гена hTERT на разных стадиях прогрессии рака шейки матки. К ним относятся нормально сплайсированная мРНК, кодирующая функционально активный фермент теломеразу и 2 варианта альтернативно сплайсированной мРНК с делецией в 6-м экзоне (a-сплайсинг) или в 7−8-м экзо-нах (Р-сплайсинг). a-Сплайсированная мРНК кодирует доминантно-негативную форму теломеразы, которая ин-гибирует теломеразную активность. В то же время для Р-сплайсированной мРНК ни предполагаемый продукт, ни его функции неизвестны [9]
Ранее [10] были представлены результаты по клонированию в лентивирусную систему и функциональному тестированию нескольких делеционных сплайс-вариантов каталитической субъединицы теломеразы (chTERT) домашней курицы и приведены данные по клонированию полноразмерной hTERT и a-делеционного варианта из линии клеток HeLa, но функции последних не изучены.
Чуть менее года назад авторами работы [11] на образцах на панели клеток рака молочной железы удалось успешно клонировать и подробно изучить Р-изоформу каталитической субъединицы hTERT. Было показано, что при эктопической сверхэкспрессии в раковых клетках данная изоформа взаимодействует непосредственно с полирибосомами и теломеразной РНК (hTR/TERC), тем самым ингибируя эндогенную активность теломе-раз. Оказалось, что сама доминантная Р-изоформа дает раковым клеткам преимущество по отношению к другим типам клеток, даже без восстановления и поддержания длины теломер.
В наших ранних работах [7, 8] также проводились сходные исследования, но в качестве объекта исследования нами были использованы панели опухолевых и предопухолевых состояний рака шейки матки. Была показана связь непосредственно активности теломе-разы (TRAP-тест) с присутствием различных изоформ hTERT. В отличие от работы [11] теломеразная активность измерялась нами энзимологически (TRAP-тест), а не только по длине теломер, как в работе [11].
Данная работа посвящена клонированию различных сплайс-вариантов hTERT для дальнейшего функцио-
нального изучения каждой из них в отдельности на изолированных линиях клеток человека.
Материалы и методы
Получение клинического материала. Все исследованные образцы были получены от пациентов из клинических отделений ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина. В качестве образцов опухолей использовали послеоперационный материал. Каждую пациентку с предопухолевыми поражениями обследовали коль-поскопически и под контролем микроскопа забирали материал с морфологически измененной тканью. Во время этого обследования ставили предварительный диагноз, который верифицировали затем цитологически и гистологически. После забора материал разделяли на несколько фрагментов и немедленно замораживали в жидком азоте. Забор материала собирали согласно правилам комитета по этике РОНЦ им. Н.Н. Блохина
Образцы РНК. РНК из опухолей выделяли согласно проце-
дуре, описанной нами ранее [12], а из образцов CIN c помощью набора для экстракции РНК RNAqueous (Ambion, США) [8]. Образцы РНК сохраняли стабильность при хранении при -70°С.
Обратная транскрипция. Для получения кДНК использовали обратную транскриптазу RevertAid Reverse Transcriptase (200 U/^L)-(Кат. номер # EP0441, «ThermoFisher», Литва). К РНК добавляли 15-членный праймер со случайной последовательностью и инкубировали при 65оС 5 мин. Затем образцы охлаждали на ледяной бане и к ним добавляли буфер для обратной транскрипции с дитиотреитолом, предложенный производителем, смесь дезоксинуклеотидов и обратную транскриптазу RevertAid в концентрациях, указанных в протоколах производителя (RevertAidRTKit, # K1691, «ThermoFisher», Литва). Реакцию проводили при следующих условиях: 25оС 10 мин, 42оС 5 час и 70оС 15 мин. По окончании реакции кДНК разводили в 5 раз.
Амплификация изоформ мРНК гена hTERT. При проведении ПЦР были использованы условия & quot-hot-start"- и Taq-
Рис. 1. Схема получения первичной промежуточной конструкции pGem-T Easy-hTERT (переклонирование по симметричному сайту
ЕсоЫ полноразмерной последовательностиГЕЯТ из pGRN145).
Рис. 2. Схема клонирования полноразмерной МЫТ и ее делеционных вариантов из промежуточного вектора pGem-T Еа8у-МЫТ в
целевой лентивирусный вектор рЯ780.
полимеразу Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (5 U/цЬ) (Кат. Номер # EP0602, «ThermoFisher», Литва). К аликвоте кДНК добавляли буфер для ПЦР (Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X), Кат. номер # K1061, «ThermoFisher», Литва), соответствующую комбинацию праймеров и фермент Hot-start Taq-полимеразу. Реакцию проводили в следующих условиях: первоначальная денатурация при 95оС 5 мин, 35 циклов амплификации — 95оС -10 с, 60оС — 20 с, 72оС — 20 с, остановка реакции: 72оС — 5 мин, хранение при +4 оС.
Клонирование кДНК копий изоформ мРНК гена hTERT
Первоначально полученные амплификаты фрагментов hTERT были подвергнуты электрофорезу в 2,5% агарозном геле и очищены при помощи набора Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System («Promega», США). Промежуточное клонирование первичных амплификатов осуществляли по «липким концам» в АТ-достроечный вектор pGEM®-T Vector System I («Promega», США).
Селекцию клонов осуществляли по методу бело-голубого скрининга на LB-agar media, содержащей 50 мкг/мл ампициллина.
Клонирование финальных вариантов последовательностей МЫТ из промежуточных векторов (на базе pGem-T Еа8у-МЫТ) осуществляли по сайту рестрикции NotI. Как вставку, так и целевой вектор рЯ780 обрабатывали рестриктазой NotI (& quot-ThermoFisher"-, Литва).
Таблица 1
Последовательности праймеров для получения сплайс-вариантов ^ГЕКГ
Название праймеров
Последовательность праймеров
Tm
TerFl 5'-- GCC AGA ACG TTC CGC AGA GA -3'- 60
TerRl 5'-- CTC CAT GTC GCC GTA GCA CA -3'- 60
Ter-f 5'-- TGC GCA CGT GGG AAG CCC T — 3'- 64
Ter-r 5'-- ATC AGT CCA GGA TGG TCT TGA -3'- 62
1986^
Ter-kf.
2169
2^2549
JerR12612
63

I g-del. I I p-del. | 2193 2228 2349 2530
3455
Xho I, 2027 BamH I, 2551
Рис. 3. Схема расположения праймеров на последовательности hTERT.
Переклонирование фрагментов делеционных вариантов из промежуточных конструкций в вектор pGem-T Easy-hTERT осуществляли по сайтам BamH I/Xho I, фланкирующим участок делеции на последовательности гена hTERT. Вставку и вектор обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamH I/ Xho I в 2х Y-Tango Buffer (& quot-ThermoFisher"-, Литва) при 37 °C в течение 2 ч, инактивация -15 мин при 65 °C.
Все реакции лигирования осуществляли при температуре +4°С в течение 12−14 ч с использованием Т4-ДНК лигазы (Кат. номер# EL0011, & quot-TermoFisher"-, Литва) в соответствующем буфере по протоколу производителя.
Все полученные конструкции были проверены секвениро-ванием по Сенгеру как с универсальных праймеров М13, так и с праймеров, фланкирующих уникальные последовательности.
Результаты и обсуждение Экспрессия мРНК hTERT в опухолях и интраэпителиальных поражениях (CIN) шейки матки
Нами были подтверждены ранее полученные данные, что в исследуемых образцах выявляются полнораз-
— мерная РНК hTERT, a-, ?- и a+?-
изоформы. Для детекции различных сплайс-вариантов hTERT нами были использованы специфические прайме-ры, амплифицирующие соответствующие продукты: полноразмерная hTERT (303 п.н.), а- изоформа (293 п.н.), ?-изоформа (158 п.н.) и a+?-изоформа (147 п.н.). Эти изоформы в различных соотношениях выявляли на разных стадиях опухолевого процесса [8].
Клонирование мРНК hTERT
Для клонирования полноразмерной каталитической субъединицы hTERT был выбран экспрессионный лен-тивирусный вектор pRS780 (любезно предоставленный В. С. Прасоловым, ИМБ РАН). Данный вектор представляет собой челночную систему трансфекции эукариоти-ческих клеток, характеризующуюся высокой стабильностью получаемых трансформантов.
Длина выбранной нами кодирующей части гена те-ломеразы — 3455 п.н. — представляет трудности для ее прямой амплификации и последующего клонирования. Поэтому нами была выбрана стратегия создания промежуточного вектора, содержащего полноразмерную открытую рамку считывания гена теломеразы на базе
¦ х- I'--¦¦ ЗИЛ& quot- & quot- & quot-
L 1 ш 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
m

— 1 ч- Поли (6?6 bp)
ч- а (590 bp)
— - ч- -? (445 bp)
L 18 19 20 21 22 23 24 25
800 bp 700 bp 600 bp 500 bp
16 17
K+
K-
-Полн.
600 bp
500 bp
400 bp (626 bp)
300 bp
—? (445 bp) -a+? (410 bp)
& lt--a+?
Рис. 4. Электрофореграмма смеси амплификатов с кДНК копиями отдельных сплайс-вариантов hTERT в 2,5% агарозном геле. (1−17) — кДНК, полученные из образцов РНК опухолей рака шейки матки- (18- 25) — кДНК, полученные из образцов РНК предопухолевых состояний CIN I-III- K+ - положительный контроль (плазмида pGem-T Easy-hTERT) — K- - отрицательный контроль (ddH20).
Рис. 5. Рестрикционное картирование по BamHI/XhoI вставки
делеционного варианта a-hTERT в вектор pGem-T Easy. L1 — 100 bp ladder («СибЭнзим», Россия), L2 — 1 kB Ladder («СибЭнзим», Россия). 1, 2 — плазмиды со «вставкой», 3, 4 — плазмиды без «вставки».
вектора pGEM-T Easy. На основе этого вектора планировалось создать все сплайс-варианты hTERT, а затем переклонировать их в конечный экспрессионный вектор
pRS780.
Исходная последовательность кодирующей части hTERT находилась в прокариотическом векторе pGRN145 (ATCC® MBA-141™) и была любезно предоставлена проф. А. В. Барановой (МГНЦ РАМН).
Клонирование полноразмерной каталитической субъединицы hTERT осуществляли в 2 этапа. На первом этапе открытая рамка считывания hTERT была переклонирована из вектора pGRN145 в вектор pGEM T-Easy Vector (& quot-Promega"- США) по симметричным сайтам EcoRI (рис. 1). Правильность полученной плазмиды pGEM T-Easy — hTERT была подтверждена секвенированием. На втором этапе открытая рамка считывания hTERT была дополнительно переклонирована из плазмиды pGEM T-Easy — hTERT вpR780 по сайту рестрикции NotI (рис. 2).
Клонирование изоформ мРНК hTERT
При анализе нуклеотидной последовательности мРНК гена hTERT в районе участков делеций были выявлены 2 сайта эндонуклеаз рестрикции XhoI и BamHI, фланкирующие все 3 делеции в одном участке (см. рис. 2).
Нами были подобраны 2 пары праймеров: TerF1 и TerR1 (табл. 1), прилегающие к сайтам рестрикции, и Ter-kf и Ter-kr, «внутренние праймеры», прилегающие к делеционным участкам изоформ.
Данные пары праймеров должны реамплифицировать участки hTERT, пригодные для последующих процедур клонирования в промежуточный вектор pGem-T Easy-hTERT изолированных фрагментов, содержащих соответствующие делеции: a- 590 п.н., ?- 445 п.н. и a+? — 410 п.н. Длина же фрагмента hTERT не несущего делеций в данном случае соответствовала 626 п.н. (рис. 3, 4).
На следующем этапе, для поиска кДНК, содержащей изоформы гена hTERT, использованы праймеры Ter-kf и Ter-kr для проведения ПЦР-скрининга образцов кДНК, полученных из коллекции опухолей и предопухолевых
Рис. 6. Рестрикционное картирование по BamHI/XhoI вставки
делеционного варианта P-hTERT в вектор pR780. L1 — 1 kB Ladder («СибЭнзим», Россия) L2 — 100 bp ladder («СибЭн-зим», Россия), 1 — плазмида со «вставкой».
Рис. 7. Рестрикционное картирование по NotI вставки делеци-онного варианта a-hTERT в вектор pR780.
L1 — 1 kB DNA Ladder («СибЭнзим», Россия), L2 — 100 bp ladder («СибЭнзим», Россия), 1, 2 — плазмиды pR780 со «вставкой» a-hTERT.
поражений. В результате скрининга была отобрано 3 образца кДНК из CIN III и 10 образцов рака шейки матки, с которых синтезировались ПЦР-продукты, соответствующие целевым участкам, содержащих фрагменты a-, ?-и a+?-делеционных вариантов hTERT.
Наиболее полно искомые участки амплифицирова-лись в образцах рака шейки матки (1−6). (см. рис. 4). На некоторых дорожках на рис. 4 визуально наблюдается полное отсутствие искомых ПЦР-продуктов. Это можно объяснить отличием качества кДНК в различных образцах, а также чувствительностью использованного способа визуализации результатов, так как агарозный гель с окрашиванием бромистым этидием не всегда может быть достаточным при очень низкой экспрессии hTERT в различных опухолевых и предопухолевых образцах. На основании данных, представленных на рис. 4, можно заключить, что отобрано достаточное количество образцов кДНК, где представлены все интересующие нас изоформы hTERT.
На образцах, отобранных из общей выборки кДНК, при помощи праймеров TerF1 и TerR1 были амплифицированы фрагменты ДНК, содержащие a- и ?-делеции. Каждый отдельный фрагмент был вырезан из агарозного геля и очищен при помощи набора Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (кат. номер # A9282, & quot-Promega, США).
Из-за очень низких концентраций отдельных ампли-конов данные ПЦР-продукты были клонированы в А-Т достроечный вектор pGEM-T Easy по «липким концам», дабы надежно сохранить полученные амплификаты и иметь возможность «наработать» их в необходимом для последующих манипуляций количестве. Полученные фрагменты, содержащие искомые участки с a- и ?-делециями и фланкированные уникальными сайтами рестрикции, были переклонированы по сайтам XhoI и BamHI в промежуточный вектор pGEM T-Easy — hTERT. Успешность клонирования была подтверждена секвени-рованием и рестрикционным картированием соответствующих плазмид (рис. 5, 6).
Далее кодирующие части гена hTERT, соответствующие изоформам, были клонированы в экспрессионный вектор pR780 по симметричным сайтам рестрикции NotI (см. рис. 2, 6, рис. 7), что также было подтверждено рестрикционным картированием и секвенированием.
В дальнейшем планируется проведение трансфекции имеющихся клеточных линий, таких как SiHa, CasKi, С322А и HEK, и получение клеточных линий, экпресси-рующих различные сплайс-варианты hTERT.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 11−04−211 и 14−400 150).
Таким образом, предприняты попытки клонирования в лентивирусную систему экспрессии отдельно каждую из изоформ hTERT (нормальную, a-, ?- и a+?-сплайс-вариантов). Получены генетические конструкции, содержащие нормальную последовательность hTERT, a- и ?-делеционные варианты на базе целевого вектора pR780.
Сведения об авторах:
Хоменков Василий Григорьевич — ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной биологии вирусов, НИИ Канцерогенеза, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, e-mail: vasily. khomenkov@ronc. ru
Скоблов Михаил Юрьевич — вед. науч. сотр. лаб. генетической эпидемиологии ФГБУ «МГНЦ» РАМН, e-mail: mskoblov@gmail. com
Короленкова Л. И. — вед науч. сотр. поликлинического отделения ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, e-mail: L. Korolenkova@mail. ru
Киселев Федор Львович — чл. -корр. РАН, зав. лаб. молекулярной биологии вирусов, НИИ канцерогенеза, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, e-mail: flkhpv@ yandex. ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Harrington L., McPhail T., Mar V., Zhou W., Oulton R., Bass M.B., Arruda I., Robinson M.O. A mammalian telomerase-associated protein. Science. 1997- 275: 973−7.
2. M. Wick, D. Zubov, G. Hagen. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Gene. 1999- 232: 97−106.
3. Kilian А., Dowtell D.D., Abud H.E., Hime G.G., Venter D.J., Keese P.K. et al. Isolation of a candidate human telomerasecatalytic subunit gene, which reveals complex splicing patterns in different cell types. Hum. Mol. Genet. 1997- 6: 2011−9.
4. Saeboe-Larssen S., Fossberg E., Gaudernack G. Characterization of novel alternative splicing sites in human telomerase reverse tran-scriptase (hTERT): analysis of expression and mutual correlation in mRNA isoforms from normal and tumour tissues. BMC Mol. Biol. 2006- 7: 26−36.
5. Hisatomi H., Ohyashiki K., Ohyashiki J.H., Nagao K., Kanamaru T., Hirata H. et al. Expression profile of a gamma-deletion variant of the human telomerase reverse transcriptase gene. Neoplasia. 2003- 5: 193−7.
6. Harle-Bachor C., Boukamp P. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis inhuman skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996- 93: 6476−81.
7. Федорова М. Д., Петренко А. А., Скворцов Д. А., Павлова Л. С., Зверева М. Э., Рубова М. П. И др. Теломеразная активность и сплайсированные формы РНК hTERT в опухолях шейки матки. Вопросы онкологии. 2010- 56(1): 29−35.
8. Скворцов Д. А., Гаспарян Н. М., Рубцова М. П., Зверева М. Э., Федорова М. Д., Павлова Л. С. и др. Теломераза как потенциальный маркер ранней диагностики рака шейки матки. Доклады РАН. 2006- 408(4): 1−4.
9. Petrenko A.A., Korolenkova L.I., Skvortsov D.A., Fedorova M.D., Skoblov M.U., Baranova A.V. et al. Cervical intraepithelial neoplasia: Telomerase activity and splice pattern of hTERT mRNA. Biochimie. 2010 92(12): 1827−31.
10. Hrdlickova R., Nehyba J., Bose H. R. Jr. alternatively spliced te-lomerase reverse transcriptase variants lacking telomerase activity stimulate cell proliferation. Mol. Cell. Biol. 2012, 32(21): 4283.
11. Listerman I., Sun J., Gazzaniga F.S., Lukas J.L., Blackburn E.H. The major reverse transcriptase-incompetent splice variant of the human telomerase protein inhibits telomerase activity but protects from apoptosis. Cancer Res. 2013- 73(9): 2817−28.
12. Спитковский Д. Д., Зборовская И. Б, Киселев Ф. Л. Транскрипция клеточных онкогенов в опухолях человека. Молекулярная биология. 1986- 20(6): 1409−22.
Поступила 20. 05. 14
CLONING OF ALTERNATIVE ISOFORMS OF THE CATALYTIC SUBUNIT OF THE HUMAN THELOMERASE (HTERT)
V. G. Khomenkov1, M. Yu. Skoblov2, L. I. Korolenkova1, F. L. Kiselev1
1 Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia- 2 Medico-Genetic Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Most human tumors, including cervical cancer, are characterized by telomerase activation (cell proliferation activation enzyme). Such activation is implemented in the elongation of the terminal segments (telomeres) of the telomerase chromosome. The gene of the enzyme is RNA-encoded, the RNA in tumors being observed in a few isoforms. The hTERT RNA role in cell activation and control was simulated using cervical cancer, as well as its pretumoral states (CIN), as a model object. The goal of this work was to clone of the human hTERT isoforms (normal, a-, P-, and a+P-splice-variants). The genetic constructions containing normal hTERT sequence, a-and P-deletion variants based on the lentivirus vector pR780 were obtained. The a- and P-deletion variants were not obtained in this variant because of methodological problems. In further research, we plan to implement splice-variants of hTERT in eukaryotic human cells.
Key words: cloning, telomerase, cervical cancer

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой