Оптимальные питательные среды для выращивания штамма хk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis антагониста возбудителя белой гнили

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ISSN 0202−5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148−149), 2011
Л. В. Маслиенко,
доктор биологических наук Д. А. Курилова, младший научный сотрудник Е. Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия, 350 038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17 Тел: (861) 275−85−19, факс (861) 254−27−80 e-mail: biometod@yandex. ru
ОПТИМАЛЬНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ШТАММА XK-1−4 CHAETOMIUM OLIVACEUM COOKE ET ELLIS
АНТАГОНИСТА ВОЗБУДИТЕЛЯ БЕЛОЙ ГНИЛИ
Ключевые слова: белая гниль, штамм, антагонист, питательные среды, стационарное культивирование, глубинное культивирование
УДК 576. 8:632
Введение. Вредоносной болезнью многих сельскохозяйственных культур, в т. ч. и масличных (подсолнечника, сои и озимого рапса), является белая гниль (Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary). Основной запас инфекционного начала возбудителя белой гнили сохраняется на растительных остатках и в почве в виде склероциев.
Использование организмов-интродуцентов -один из наиболее известных и широко распространенных путей применения биологического метода защиты растений от болезней, вызываемых грибами. Микроорганизм, пригодный для получения эффективного биопрепарата, должен проявлять антагонистическую активность против патогенов в широко варьируемых условиях. Во многих странах ведутся поиски таких микроорганизмов, проводятся испытания их в полевых условиях, результаты которых показывают перспективность подобных исследований [1- 2- 3- 4- 5- 6- 7- 8- 9].
Микробиологических препаратов для снижения запаса инфекционного начала возбудителей болезней в почве и на растительных остатках чрезвычайно мало. Поэтому создание новых высокоэффективных эколо-
гически безопасных микробиопрепаратов на основе штаммов, снижающих жизнеспособность склероциев белой гнили, является актуальной задачей.
В результате ступенчатого скрининга грибов и бактерий из коллекции антагонистов возбудителей болезней масличных культур лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю белой гнили озимого рапса отобран от-селектированный штамм Xk-1−4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis, наиболее активно разлагающий склероции возбудителя болезни.
В целях разработки элементов технологического регламента производства биопрепарата на основе перспективного штамма гриба-антагониста Xk-1−4 Chaetomium oliva-ceum определяли оптимальные питательные среды для штамма продуцента в условиях стационарного и глубинного культивирования.
Материалы и методы. Для определения оптимальных питательных сред из естественных субстратов для выращивания штамма Xk-1−4 Chaetomium olivaceum субстрат промывали, размельчали, помещали в колбы Эрленмейера объёмом 750 мл, заполняя 70% объёма, стерилизовали в автоклаве в течение часа при давлении 1,5 атм., засевали спорами и мицелием гриба и помещали в термостат с температурой 25 оС. Учёт проводили через 10 суток культивирования. Учитывали рост мицелия, интенсивность спорообразования, образование плодовых тел. Субстрат с выращенным грибом вытряхивали из колб, просушивали при температуре 30−35 оС в течение 4 суток, размалывали на шаровой мельнице до величины частиц 60 мкм и определяли титр лабораторного образца микробиопрепарата. Для этого готовили ряд последовательных разведений. 1,0 г препарата помещали в колбу со стерильной дистиллированной водой (90 мл), тщательно перемешивали, доводили объем до 100 мл и ставили на качалку на 10 минут. Разведение препарата, или его концентрация в приготовленной суспензии, составляло 10−2. Предварительно стерильную дистиллированную воду разливали по 9,0 мл в стерильные сухие пробирки. Затем отбирали 1,0 мл суспензии и переносили в пробирку с 9,0 мл стерильной воды. Полученное разведение 10−3 тщательно перемешивали. Таким же образом готовили все последующие разведения до 10−8. При приготовлении использовали каждый раз отдельные стерильные мерные колбы, пипетки и пробирки.
Для определения титра использовали разведения 10−7 и 10−8. Для этого суспензию по
1,0 мл из соответствующего разведения переносили в три стерильные чашки Петри. Затем в эти чашки заливали по 15−20 мл агаризиро-ванной среды, остуженной до 45−50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки Петри ставили в термостат с оптимальной температурой и через 3−5 суток инкубации подсчитывали среднее число колоний в трёх повторностях.
Титр (количество колониеобразующих единиц в 1,0 г препарата) вычисляли по формуле:
Т = a х 10п, V
где Т — количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 г-
а — среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения-
V — объем суспензии, взятый для посева-
10п — коэффициент разведения.
Подбор оптимальных искусственных сред и условий культивирования на них перспективного штамма антагониста проводили на жидких питательных средах Чапека, Тайло-на-3 и Рудакова при стационарном и глубинном культивировании. Предварительно посевной материал выращивали на агаризо-ванной питательной среде — картофельно-сахарозном агаре (КСА). Учитывали накопление биомассы, образование спор, плодовых тел. Выращивание проводили при оптимальной температуре 25 °C. Учёты роста мицелия и образования плодовых тел проводили через 3, 5 и 10 суток культивирования.
Глубинное культивирование штамма ХЫ-4 СИавОтшт оНуасвыт осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об. /мин в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл при объёмах среды 150 мл при температуре 25 оС в течение 4 суток.
Результаты и обсуждение. Грибы рода СкаеШттт обычно встречаются в почве и в органическом компосте, способны разлагать целлюлозу и другие органические вещества, проявляют антагонистические свойства к различным микроорганизмам почвы [10- 6].
Гриб относится к классу Ascomycetes, порядку Sphaeriales, семейству Скае^т1асеае.
Гриб — аэроб. Ранее установлено, что наиболее благоприятным для роста мицелия и образования плодовых тел является выращивание гриба на картофельно-сахарозном агаре при температуре 25 °C. При выращивании на искусственных питательных средах (среда
Чапека) штамм Xk-1−4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis ассимилирует сахарозу, крахмал, в средней степени — глюкозу и в слабой степени — маннит. Из источников азота использует нитратный, аммонийный азот, мочевину, в слабой степени — тиомочевину. Оптимальный уровень рН среды — 6 [6].
Определение оптимальной питательной среды для штамма Xk-1−4 Chaetomium olivaceum из естественных субстратов
Всего для выращивания штамма Xk-1−4 Chaetomium olivaceum было использовано тринадцать естественных субстратов (табл. 1).
Таблица 1
Рост штамма Хк-1−4 Chaetomium olivaceum на естественных субстратах при температуре 25 °C через 10 суток
Среда Рост мицелия, балл* Образование плодовых тел, балл** Титр порошка, КОЕ/г
Силос 3 1 1,8×109
Солома 5 2 2,0×109
Сено 5 2 3,8×109
Опилки 2 1 6,0×106
Жом 2 1 9,0×103
Комбикорм 4 2 3,6×109
Сенаж 0 0 0
Семянки подсолнечника 5 2 6,5×109
Лузга подсолнечника 5 2 3,0×109
Лузга + семянки (1: 3) 5 2 6,4×109
Лузга + семянки (1: 1) 5 2 4,6×109
Лузга + гумат натрия 0,1% 5 2 4,2×109
Лузга + гумат натрия 0,2% 5 2 5,0×109
Лузга + гумат натрия 0,3% 5 2 6,6×109
Порошок лузги + кукурузный экстракт 5 2 8,0×109
Отходы от очистки семян подсолнечника 5 2 3,9×109
Отходы + гумат натрия 0,2% 5 2 7,3×109
Кукурузная мезга 5 2 6,0×109
Отходы от очистки семян рапса 4 2 2,6×106
Отходы от очистки семян горчицы 0 0 0
*рост мицелия в баллах (зарастание поверхности среды): 1 — до 10%- 2 — до 30%-
3 — до 50%- 4 — до 75%- 5 — до 100%. ** образование плодовых тел в баллах:
0 — отсутствие плодовых тел- 1 — единичные- 2 — массовое количество.
Установлено, что наиболее благоприятными из испытанных естественных субстратов являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата 3,0−8,0×109 КОЕ/г.
Также высокие показатели роста отмечены при выращивании гриба на средах из соломы, сена и комбикорма 2,0−3,6×109 КОЕ/г. Слабый рост гриба или полное отсутствие роста отмечено на средах из сенажа, жома, опилок, отходов от очистки семян горчицы 0−6,0×106 КОЕ/г.
Стационарное выращивание штамма
Хк-1 -4 Chaetomium olivaceum на искусственных питательных средах
Стационарное выращивание штамма Хк-1−4 Chaetomium olivaceum проводили на жидких питательных средах сложного состава -Тайлона-3, Рудакова и Чапека, содержащих углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы. Среды Тайлона-3 и Рудакова в отличие от Чапека содержат кукурузный экстракт (табл. 2).
Таблица 2
Влияние питательньх сред и срока стационарного культивирования на рост штамма Xk-1−4 Chaetomium olivaceum
Краснодар, ВНИИМК
Питательная среда Рост мицелия, балл * через, суток Масса сухого мицелия, г ** через 10 суток
3 5 10
Чапека 0 1 1 0,27 ± 0,01
Тайлона-3 1 1 3 0,64 ± 0,08
Рудакова 1 2 3 1,26 ± 0,12
* рост мицелия в баллах:
0 — нет роста-
1 — рост мицелия отдельными колониями-
2 — мицелиальная плёнка сплошная тонкая-
3 — мицелиальная плёнка сплошная толстая. ** масса мицелия в расчете на 100 мл
питательной среды
Установлено, что максимальный рост ми-целиальной плёнки гриба обеспечивает среда Рудакова. Уже через 5 суток культивирования
на этой среде отмечена сплошная тонкая ми-целиальная плёнка, тогда как на среде Тайло-на-3 гриб рос отдельными поверхностными колониями, а на среде Чапека отдельными колониями в глубине питательной среды. Через 10 суток культивирования на среде Рудакова и на среде Тайлона-3 образовались сплошные толстые мицелиальные плёнки, а на среде Чапека отдельные колонии так и не срослись в одну мицелиальную плёнку. Масса сухого мицелия через 10 суток культивирования была максимальной на среде Рудакова. Следует отметить, что штамм Хк-1−4 Chaeto-mium olivaceum на жидких питательных средах растёт гораздо хуже, чем на естественных субстратах и за 10 суток стационарного культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.
Глубинное культивирование штамма Хк-1−4 Chaetomium olivaceum
Изучение кинетики рост гриба при глубинном культивировании показало, что через 24 часа на всех средах отмечен бесцветный, средний по толщине, с выростами, несепти-рованный мицелий с негранулированной цитоплазмой (табл. 3).
При этом мицелий группировался в комочки с диаметром 1,0−4,0 мм на среде Рудакова и 1,0−2,0 мм на среде Тайлона-3. На среде Чапека было много непроросших посевных сумкоспор, а на средах Тайлона-3 и Рудакова их было значительно меньше. рН среды на Чапека 6,5, на Тайлона-3 — 5,0, на Рудакова — 5,5. Утилизация среды составляла: Чапека — 0%, Тайлона-3 — 10%, а Рудакова -20%.
Через 48 часов культивирования на всех средах отмечено увеличение количества молодого, бесцветного, утолщённого, несеп-тированного, с негранулированной цитоплазмой, но с ещё большим количеством отростков или выростов мицелия. Во всех средах присутствовали свободные сумкоспо-ры. Уровень рН среды снизился и составлял на среде Чапека 5,0, на среде Тайлона-3 — 4,5 и на среде Рудакова — 5,0. Утилизация среды составляла: Чапека — 10%, Тайлона-3 — 40% и Рудакова — 50%.
Через 72 часа культивирования на всех средах отмечено наличие толстого сероватого, изросшегося в виде бусинок, наростов, септированного, с гранулированной цитоплазмой и молодого слабосептированного
Таблица 3
Кинетика развития культуры штамма Хк-1−4 СНа& amp-отшш оНуасвит при глубинном культивировании
Краснодар, ВНИИМК
Срок культи-виро-вания, час Питательная среда Морфологические изменения культуры и спорообразование Утилизация среды, % рН среды Титр, КОЕ/мл
Чапека Мицелий бесцветный, несептированный, средний по толщине, с выростами, с негра-нулированной цитоплазмой- много не-проросших сумкоспор 0 6,5 4,9×102
24 Тай-лона-3 -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,02,0 мм- присутствуют сумкоспоры 10 5,0 1,9×102
Рудакова -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0−4,0 мм- присутствуют сумкоспоры 20 5,5 2,5×102
48 Чапека Мицелий бесцветный, несептированный, утолщённый, с большим количеством выростов, с негранули-рованной цитоплазмой- присутствуют свободные сумкоспоры 10 5,0 2,5×104
Тай-лона-3 -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0−2,0 мм 40 4,5 2,0×104
Рудакова -//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0−4,0 мм 50 5,0 2,9×104
72 Чапека Мицелий сероватый, толстый, изросшийся с бусинками, септиро-ванный, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, бесцветный, слабосеп-тированный- присутствуют свободные сумкоспоры 10 5,0 5,6×106
Тай-лона-3 -//-* комочки 1,0−2,0 мм 50 4,5 7,3×106
Рудакова комочки 1,0−4,0 мм 50 5,0 1,9×107
96 Чапека Мицелий сероватый, толстый, с выростами и бусинками, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, средний, септиро-ванный, с гранулированной цитоплазмой. Начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор мало 10 5,0 6,9×106
Тай-лона-3 -//-* комочки 1,0−2,0 мм 50 4,5 8,5×106
Рудакова комочки 2,0−3,0−4,0 мм 60 4,5 2,3×10'-
* описание мицелия соответствует таковому на среде Чапека
мицелия. Во всех средах присутствовали в незначительном количестве свободные сум-коспоры. рН среды оставался на том же уровне. Утилизация среды составляла: Чапека
— 10%, Тайлона-3 и Рудакова — 50%. Титр составлял: на среде Чапека — 5,6×106 КОЕ/мл, на Тайлона-3 — 7,3×106 КОЕ /мл и на Рудакова — 1,9×107 КОЕ/мл.
Через 96 часов культивирования на всех средах отмечено наличие толстого, сероватого, с многочисленными выростами и бусинками мицелия и молодого, среднего, септированного мицелия с гранулированной цитоплазмой. Отмечено начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор во всех средах было мало. Отмечено начало образования плодовых тел. рН снизился на среде Рудакова до 4,5. Утилизация среды составляла: Чапека — 10%, Тайлона-3 — 50%, Рудакова -60%. Титр на среде Чапека 6,9×10 КОЕ/мл, на Тайлона-3 — 8,5×106 КОЕ/мл, на Рудакова
— 2,3×107 КОЕ/мл.
Визуально:
— среда Чапека — прозрачная, ярко-жёлтая, мицелия в среде 10%- комочков (глобул) не было-
— среда Тайлона-3 — прозрачная, светло-коричневая, мицелия в среде 50%, имелись комочки (глобулы) диаметром 1,0−2,0 мм-
— среда Рудакова — мутная, коричневая, мицелия в среде 60%, имелись комочки (глобулы) диаметром 2,0−4,0 мм.
Таким образом, выращивание штамма антагониста в глубинной культуре сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и спороношения, титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.
Заключение. Наиболее благоприятными естественными субстратами для штамма продуцента микробиопрепарата Хк-1−4 Chaetomium olivaceum являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата — 3,0−8,0×109 КОЕ/г.
При стационарном культивировании штамма Хк-1−4 Chaetomium olivaceum на жидких питательных средах сложного состава максимальный рост мицелиальной плёнки гриба обеспечивала среда Рудакова. На жидких питательных средах штамм-продуцент
ISSN 0202−5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148−149), 2011
рос гораздо хуже, чем на естественных субстратах, и за десять суток культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.
Выращивание штамма при глубинном культивировании сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и споро-ношения. Титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 11−08−96 512-р юг ц.
Список литературы
1. Tiedemann, A.V. Versuche zur Eindammung von Sclerotinia sclerotiorum durch Einsatz von Sclerotienparasitischen Antagonisten im Gewachshaus und Feld / A.V. Tiedemann, K. Hedke // Vort. 49 Dtsch Pflanzenschutzlag., Heidelberg (26−29 Sept. 1994) Mitt. Biol. Bun-desanst. Land-und Forstwirt Berlin-Dahlem. -
1994. — № 301. — P. 361.
2. Mc Laren, D.L. Biological ranto! of Sclerotinia wilt of sunflower with Talaromyces fla-vus and Coniothyrium minitans / D.L. Mc Laren, H.C. Huang, G.C. Kozub [et al.] // Plant Disease. — 1994. — 78, № 3. — P. 231−235.
3. Huang, H.C. Effect of allyl alcohol and fermented agricultural wastes on carpogenic germination of sclerotia of Sclerotinia scleroti-orum and colonization by Trichoderma sp. / H.C. Huang, I.W. Huang, G. Saindon [et al.] // Can. J. Plant Pathol. — 1997. — 19, № 1. — P. 43−46.
4. Маслиенко, Л.В. Бактерии-антагонисты возбудителей болезней подсолнечника / Л. В. Маслиенко, О. А. Лавриченко // Науч. -техн. бюл. ВНИИ маслич. культур. — Краснодар,
1995. — Вып. 116. — С. 27−35.
5. Калько, Г. В. Биологические обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур: автореф. дис. … канд. биол. наук / Калько, Галина Валентиновна. — СПб, 1996. — 22 с.
6. Маслиенко, Л. В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. …
док. биол. наук / Маслиенко, Любовь Васильевна. — Краснодар, 2005. — 49 с.
7. Новикова, И. И. Биологическое обоснование создания и применения полифункциональных биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для фитосанитарной оптимизации агроэкосистем: автореф. дис. … док. биол. наук / Новикова, Ирина Игоревна. -СПб., 2005. — 46 с.
8. Коломбет, Л. В. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней: автореф. дис. … док. биол. наук / Коломбет, Любовь Васильевна. — М., 2006. — 48 с.
9. Маслиенко, Л. В. Выделение высокоэффективных биоагентов грибов-антагонистов возбудителя фомопсиса для создания на их основе полифункциональных микробиопрепаратов / Л. В. Маслиенко, Е. Ю. Шипиевская, А. М. Асатурова, Д. А. Курилова // Разработать и усовершенствовать новые биохимические методы создания и идентификации генотипов масличных культур с комплексом хозяйственно ценных признаков: завершённая зарегистрированная НИОКР ФГНУ «ЦИТиС», часть 5. — М., 2011.
10. Soitonq, K. Application of Chaetomium sp. (Ketomium) as a new broad spectrum biological fungicide for plant disease control / K. Soitonq, S. Kanokmedhakul, V. Kukonqviriyapa [et al.] // A review article Fungal Diversity. — 2001. — 7. — P. 1−15.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой