Опыт использования тканеинженерной конструкции для увеличения объема костной ткани на верхней челюсти (срок наблюдения до 21 месяца)

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы


ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ… 75
УДК 616. 716. 1−089. 23:611. 018. 4
1 1 2'-3 12 1
Алексеева И. С., Кулаков А. А., — Гольдштейн Д. В., — Волков А. В, Шураев А. И.
ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ
ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ОБЪЕМА КОСТНОЙ ТКАНИ
НА ВЕРХНЕЙ ЧЕЛЮСТИ (СРОК НАБЛЮДЕНИЯ ДО 21 МЕСЯЦА)
1ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХМинздравсоцразвития России», Москва
2ЗАО «РеМеТэкс», Москва
3 УРАМН «Медико-генетический научный центр РАМН», Москва Контактная информация
Алексеева Ирина Сергеевна, канд. мед. наук, врач клиники «Дента Эль»
Адрес: Москва, Хорошевское ш., 68, тел. +7(916)653−11−26 E-mail: shuraev. alex777@gmail. com
Статья поступила: 11. 02. 2012, принята к печати 29. 02. 2012.
Изучение механизмов регенерации различных органов и тканей с использованием клеточных технологий получило значительное развитие за последнее десятилетие. Возросло количество исследований по использованию стволовых клеток для устранения дефектов костной ткани в хирургической стоматологии. Проведено клиническое исследование по восстановлению костной ткани у пациентов с выраженной атрофией альвеолярного отростка верхней и нижней челюстей с помощью тканеинженерных конструкций. Источником мультипотент-ных стромальных клеток для изготовления тканеинженерной конструкции была жировая ткань. Для изучения характеристик полученного костного регенерата через 4 мес. после проведения трансплантации мы проводили гистологическое исследование.
Ключевые слова: жировая ткань, липоаспират, стромальные клетки, тканевая инженерия, костная ткань.
1Alekseeva I. S, }Kulakov A. A2,3,, D. Goldstein1,2, AV Volkov12, 1Shuraev A. EXPERIENCE OF CONSTRUCTION TKANEINZHENERNOY TO INCREASE THE VOLUME OF BONE On the upper jaw (TERM MONITORING TO 21 MONTHS)
1FGU & quot-TsNIIS and Maxillofacial Surgery Health Ministry of Russia& quot-, Moscow
2ZAO & quot-ReMeTeks"-, Moscow
3 URAMN & quot-Medical Genetics Research Center& quot-, Moscow
Investigation of the mechanisms of regeneration of various organs and tissues using cellular technology has developed considerably over the last decade. Increased number of studies on the use of stem cells to correct defects in bone tissue dental surgery. Adipose tissue was used as a source of multipatent stem cells to produce tissue engineering. It was a clinical study on the restoration of bone tissue in patients with severe atrophy of the alveolar process of the maxilla with tissue engineering. To study the characteristics of the obtained bone regenerate within 4 months after transplantation examined histologically.
Key words: adipose tissue, lipoaspirat, multipatent stem cells, tissue engineering, bone tissue.
Введение
Восстановление костной ткани с помощью ТИК вызывает большой интерес исследователей и клиницистов [2- 4- 7- 8]. Первый этап создания ТИК включает в себя эксфузию аутогенного клеточного материала, выделение тканеспецифических клеток и получение их культуры. Далее производится диффе-ренцировка культуры малодифференцированных клеток в необходимом направлении. Эквиваленты костной ткани получают путем направленной диф-ференцировки стволовых клеток костного мозга, надкостницы, жировой ткани [5- 6- 9−12]. Затем культура клеток помещается на носитель (матрицу).
Далее конструкция вводится в зону дефекта [1- 3]. При культивировании клеток для получения объёма, необходимого для успешной стимуляции остеогенеза, как правило, используется не более 4−6 пассажей, что позволяет получить достаточное количество клеточного материала для трансплантации.
В зависимости от индивидуальных способностей организма на это требуется от 3 до 5 недель. Клетки, культивированные до 10 пассажей, считаются безопасными для клинического применения
[11- 13].
С 2006 по 2011 год на базе ФГУ «ЦНИИС» Росмедтехнологий совместно с ЗАО «РеМеТэкс» в соответствии с решением Ученого совета и этического комитета ФГУ «ЦНИИС» Росмедтехнологий проводилось клиническое исследование по восстановлению костной ткани у пациентов с выраженной атрофией альвеолярного отростка в области верхней и нижней челюсти с помощью тканеинженерных конструкций на основе мультипатентных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ). В рамках клинического исследования было проведено лечение 20 пациентов.
Материалы и методы
Для создания ТИК использовали культуру мультипотентных стромальных клеток СВФ ЖТ. СВФ ЖТ выделяли из аутолипоаспирата пациентов. Липоаспирацию проводили по стандартной методике под местной инфильтрационной анестезией в области передней брюшной стенки.
Объем липоаспирата рассчитывали, исходя из предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергался криоконсервированию.
В зависимости от этих факторов объем липо-аспирата составлял 20−60 мл. Липоаспират промывали раствором Версена и дезагрегировали путем инкубации в нем с добавлением 0,25%-ного трипсина при 37 °C в течение 1,5 часов. Клеточную суспензию центрифугировали 10 минут при 1100 об/мин, осадок разводили ростовой средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением аутологичной сыворотки до 10%, амикацина до 500 мг/л), переносили в чашки Петри и инкубировали при стандартных культуральных условиях (37 °С, 5% СО2).
Плотность посева составляла 1,5−2 тыс. клеток на см2. Спустя двое суток не прикрепившиеся клетки удаляли, заменяя ростовую среду на свежую. По достижении 80%-ного конфлюентного монослоя клетки рассевали в новую культур3 альную посуду в плотности 1,5−2 тыс. клеток на см3. Ростовую среду меняли каждые 3 суток.
Для направленной остеогенной дифференци-ровки клетки рассаживали на 90 мм чашки Петри и по достижении 80%-ного конфлюентного монослоя заменяли ростовую среду на дифференцировочную (DMEM с 10% аутологичной сыворотки крови, 100 мкг/мл амикацина, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты, 10 мМ/л Р-глицерофосфата натрия и 10 нМ 1,25-дигидроксивитамина D3). Замену среды на свежую производили каждые 3 суток.
Приготовление PRP
(плазмы, обогащенной тромбоцитами)
Забор крови проводили в вакуумную систему типа Vacuette® с цитратом натрия. Кровь центрифугировали при скорости 1000 об/мин в течение 10 мин, отбирали верхний слой (без эритроцитов) и центрифугировали его при скорости 3600 об/мин в течение 10 мин. Большую часть супернатанта удаляли, осевшие тромбоциты ресуспендировали в оставшейся плазме.
Подготовка
такнеинженерной конструкции
к трансплантации
В качестве носителя использовали «Остеоматрикс» в виде блоков и костной крошки (ООО «Конектбиофарм»). После отмывания блоков раствором Хэнкса («ПанЭко») с цефазолином (ОАО «Синтез») (1г/Л) на них аккуратно наслаивали PRP, содержащую 7*106 клеток в см3, и по каплям добавляли раствор тромбина (& quot-P.Z. Cormay& quot-) 50 Ед/мл на 10%-ном р-ре хлорида кальция (ОАО «Даль-химфарм») до полимеризации.
Гистологические методы
Для изучения характеристик костного регенерата через 4 месяца после проведения трансплантации проводили гистологическое исследование. Образцы тканей забирались 2 мм трепаном в виде столбиков. Забор образцов тканей проводился перед формированием ложа для установки дентального имплантата.
Биопсийный материал, полученный от пациентов во время дентальной имплантации, помещали в забуференный нейтральный 10%-ный формалин (Biooptica, Italy) и фиксировали 24 часа.
Образцы для гистологического исследования представляли собой столбики костной ткани 3 мм в диаметре и длинной от 8 до 10 мм.
Фиксированный материал промывали проточной водой в течение 24 часов. Затем проводили кислотную декальцинацию с использованием смеси соляной и муравьиной кислот (Biooptica, Italy) в
течение 6 часов, после чего проводилась промывка образцов в фосфатном буфере (pH=7,4). Для получения серийных срезов материал обезвоживали и заливали в парафин.
Для проведения гистоморфометрического исследования из серии срезов случайным образом с помощью программного обеспечения Random выбирали 6 стекол, содержащих 4 среза. 5 стекол окрашивали по Массону-Голднеру, 1 — гематоксилином по Мейеру с докраской эозином.
Для морфометрического анализа выбирали третий слева срез. Если его качество было недостаточно высоким, выбирали следующий.
С помощью этого метода рандомизации достигалась максимально случайная выборка объекта исследования.
Клинический пример 1 (рис. 1- см. вкл.)
Пациентка Р., 51 года.
Диагноз: «вторичная частичная адентия на верхней и нижней челюсти, хронический генерализованный пародонтит тяжелой степени тяжести».
Осмотр: подвижность 16- 17- 27- 13- 12- 11 — 3 степени. КТ: атрофия альвеолярного отростка, измененная периодонтальная щель в области 27- 11- 12- 13- 16- 17. Утолщение слизистой верхнечелюстных пазух. Высота альвеолярного отростка до трансплантации области отсутствующих зубов: 14 — 2 мм- 15 — 2,6 мм- 25 — 0,9 мм- 26 — 0,9 мм. Лечение. А: Экстракция 16- 17- 27- 13- 12- 11.
Б: Операция. Двухсторонний синус-лифтинг ТИК ЖТ (лунки удаленных зубов заполнены тканеинженерной конструкцией). V трансплантата 9 см³. Был перемещен полнослойный слизисто-надкостничный лоскут в области удаленных зубов, рана ушита наглухо. На период подготовки к имплантации изготовлен временный съемный протез на верхнюю челюсть.
В: Имплантация. Через 4 месяца после трансплантации ТИК ЖТ по данным КТ высота альвеолярного гребня составила: 14 — 6,5 мм- 15 — 11,1 мм- 16 — 9 мм- 17 — в мм- 25 — 11,5 мм- 26 — 10,7 мм. В альвеолярных бухтах с 2 сторон участки сформированной костной ткани, сливающейся с костной тканью альвеолярного отростка, по плотности соответствующей неизменной костной ткани. Через 4 мес. после трансплантации проведена имплантация с установкой в имплантатов Bicon 0: 17- 15- 25- 25 — 4,5 на в мм, 13 и 23 — 4,0 на в мм и 11- 21 — 3,5 на в мм. Все имплантаты были заглублены на 2 мм.
Осложнение. В области имплантата, установленного в проекции 17- 2 нед. сохранялся болевой симптом и выраженный отек слизистой. Расхождения швов не было. Швы сняты через 7 дней. Через 4 мес. после раскрытия имплантатов для установки формирователя десны была выявлена подвижность имплантата в области 17 — имплантат удален.
Гистология. В материале из регенерата, обнаружена формирующаяся костная ткань (рис. 3). Обследование. Через 12 мес. после внутрикостной имплантации и 16 мес. после трансплантации ТИК ЖТ КТ: в области проведенной трансплантации видна неизменная костная ткань.
Клинический пример 2 (рис. 4- см. вкл.) Пациент Б., 1953 лет
Жалобы: обратился на затрудненное пережевывание пищи из-за адентии 16- 14.
КТ: Дефект костной ткани в области вестибулярной кортикальной пластинки в проекции отсутствующего 16 зуба, медиальной стенки корня 17 зуба,

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ… 77
далее дефект распространялся в область дна верхнечелюстной пазухи, снижение высоты альвеолярного отростка в области дна верхнечелюстной пазухи: 16 зуба — 1 мм, толщина костной ткани от верхушки 15 до нижней стенки пазухи около 2 мм. Лечение: А: Удаление 17.
Б: Операция. открытый синус-лифтинг. В область дна верхнечелюстной пазухи введена ТИК ЖТ, костный дефект и лунка 17 зуба также заполнены тканеинженерной конструкцией. V трансплантата — 4 см³. В: Имплантация. Через 4 месяца на КТ высота костной ткани в области отсутствующих зубов: 16 -16 мм, 17 — 14 мм, от верхушки корня 15 — 6 мм. В альвеолярной бухте и зоне удаленных зубов, сформированная костная ткань, сливающаяся с костной тканью альвеолярного отростка, по плотности соответствующая неизмененной костной ткани. Пациенту были установлены 3 имплантата Вісоп 0 4,5 на 11 мм в области отсутствующих зубов -14- 16- 17.
Гистология. В материале из регенерата, обнаружена формирующаяся костная ткань (рис. 5). Обследование. Через 21 мес. после трансплантации ТИК ЖТ и 17 мес. после имплантации.
КТ: параметры костной ткани не изменены. Морфологически через 120 дней после трансплантации ТИК ЖТ: образцы состояли из трех зон, материнской кости, промежуточной и зоны регенерата (рис. 5). Зона материнской кости состоит из
2 параллельных пластинок компактной кости с прослойкой губчатой кости между ними, содержащей желтый костный мозг и незначительное количество красного костного мозга.
Зона, содержащая тканеинженерную конструкцию, состоит преимущественно из новообразованной трабекулярной костной ткани, ее относительная объемная доля составила 39,3%. Рыхлая волокнистая соединительная ткань с красным и желтым костным мозгом занимает основной объем меж-трабекулярного пространства и составляет 37%. Относительная доля ткани (8%) и депозитов фибрина (2,5%) занимает незначительную часть костного регенерата.
Заключение
Результаты многих исследований по применению ТИК на основе МСК являются предварительными, и, тем не менее, методы тканевой инженерии, направленные на восстановление костной ткани, являются малоинвазивными и позволяют получить предсказуемый результат, расширяя, тем самым, возможности проведения костнопластических вмешательств.
Ни в одном из опубликованных клинических исследований по устранению дефектов костной ткани с использованием МСК не отмечалось побочных эффектов, таких как воспаление или чрезмерный рост ткани.
Таким образом, разработка методов восстановления костных дефектов с использованием МСК ЖТ может стать эффективным и наиболее перспективным решением сложной клинической задачи по восстановлению костной ткани и стимуляции репаративного остеогенеза.
Литература
1. Волков А. В. Тканевая инженерия: новые перспективы развития медицины. — клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — № 1, 2005. — с. 57−64.
2. Athanasiou K. A., C. Zhu, D. R. Lanctot, C. M. Agrawal, andx. Wang. Fundamentals of biomechanics in tis-
sue engineering of bone. — tissue eng. 2000. 6: 361−81.
3. C. D. Helgason and c. L. Miller (edited by). Methods in molecular biology, vol. 290: basic cell culture pro-
tocols, p. 173−85. Third edition.: © humana press inc., totowa, nj.
4. Jiang H., Xiaohua L., Peter X. Biomineralization and bone regeneration. Principles of regenerative medicine (second edition), 2011. P. 733−45.
5. Kassem M., Abdullah B.M., Saeed H. Osteoblastic cells: differentiation and trans-differentiation. — arch. Biochem. Biophys. — 2008, may 15−473(2): 183−7.
6. Kern S., Eichler H., Stoeve J., Kluter Z., Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. — stem cells. — 2006- 24: 1294−301.
7. Kuhbier J.W., Weyand B., Sorg H., Radtke C., Yogt P.M., Reimers K. Stem cells from fatty tissue: a new resource for regenerative medicine? — chirurg. — 2010 sep-81(9): 826−32.
8. KwanM.D., Slater B.J., Wan D.C., Longaker M.T. Cell-based therapies for skeletal regenerative medicine. -hum. Mol. Genet. — 2008−17: p. 93−8.
9. Muscler G. F, Nacamoto C., Griffith L.G. Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering. -j. Bone joint surg. Am. — 2004- 86-a (7): 1541−58.
10. Lee J.A., Parrett B.M., Conejero J.A. Et al. Biological alchemy: engineering bone and fat from fat-derined stem cells. — ann. Plast. Surg. 2003- 50(6): 610−7.
11. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D. Et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999- 284(5411): 143−7.
12. Rose F.R., OreffoR.O. Bone tissue engineering: hope vs hype. Biochem biophys res commun. 2002- 292: 1−7.
13. Rubio D., Garcia-castro J., Martin M.C., De La Fuente R., Cigudosa J.C., LloydA.C., BernadA. Spontaneous human adult stem cell transformation. — cancer research. — 2005- 65(8): 3035−9.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой