Фаги бактерий Bordetella bronchiseptica: свойства и возможности применения

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Сельскохозяйственные науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 619: 578. 832. 1
ФАГИ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA: СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432 017, г. Ульяновск, Б. Новый Венец -1, e-mail: vet_yulia@mail. ru
Ключевые слова: Bordetella bronchiseptica, бактериофаги, индикация, идентификация, биологические свойства.
В статье представлен материал по истории изучения фагов бактерий рода Bordetella, а также результаты собственных исследований по выделению бактериофагов Bordetella bronchiseptica, изучению их биологических свойств и возможностям применения.
Введение
С 80-х годов XX века отечественными и зарубежными исследователями предпринимаются попытки выделения фагов бактерий рода Bordetella [1−9].
Исследовательской группой НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи описаны бактериофаги бактерий B. pertussis — фТ, фК, 134, 41 405, B. parapertussis 6622, B. bronchiseptica — 214, американскими разработчиками — два бактериофага В. avium В1 и В2 и три фага B. bronchiseptica BPP-1, BMP-1 и BIP-1. Авторами изучено строение бордетеллёзных фагов, проведен сравнительный анализ структуры их геномов, выявлены особенности лизогении и конверсии бактерий рода Bordetella, а также спроектирована трёхмерная модель фагов и изучен уникальный механизм доставки ДНК материала в бактериальную клетку [2−6].
На основе структурных характеристик авторы отнесли фаги B. bronchiseptica к семейству Podoviridae — короткохвостовых фагов с изометрической головкой [6, 7, 8, 9].
Все бордетеллезные фаги морфологически идентичны друг другу. Диаметр ико-саэдрической головки составляет 49,5 нм [2, 6, 7, 8, 9].
Бактериофаги нередко участвуют в формировании вирулентных бактерий. Изменение патогенности может достигаться в результате прямого переноса генов, кодирующих факторы вирулентности, или являться следствием более сложных событий, напри-
и
Sa es «1

Si
р U ш SS Hi ¦ i
00 s!
мер, изменяющих поверхность бордетелл. Приобретение бактерией резистентности к бактериофагу часто приводит не только к изменению во взаимодействии бактерии с фагом, но и бактерии с макроорганизмом [3].
Вследствие этого интерес к бордетел-лёзным бактериофагам, особенно в связи со сложностью регуляции вирулентности бактерий рода Bordetella, постоянно поддерживается.
Результаты исследований показывают, что бактерии B. bronchiseptica и B. pertussis полилизогенны и содержат два профага. Геномы одного из профагов обнаружены в хромосомах клеток-хозяев. Геномы второго профага присутствуют только в части популяции лизогенных бактерий в автономном состоянии и утрачиваются в процессе культивирования in vitro большей частью бактериальной популяции [3]. Ко второй группе относятся и бактериофаги ВРР-1, ВМР-1 и BIP-1 B. bronchiseptica, имеющие различный тропизм к бактериям, находящимся в разных фазовых состояниях [2, 3, 9].
Развитие компьютерных технологий позволило американским исследователям в 2013 году разработать 3D-модель фага BPP-1 B. bronchiseptica, изучить механизм взаимодействия фагов с клеткой-хозяином, сформулировать общие принципы организации фагового генома и провести поиск геномов профагов в секвенированных хромосомах бактерий. Полная трехмерная структура фага ВРР-1 была сконструирована автора-
ми на основании анализа многочисленных электронных 2D-снимков отдельных частиц, находящихся в угловом диапазоне от -70° до 70°, механизм фаговой структурной адаптации к динамически изменяющимся клеткам-хозяевам состоит в строгом сохранении ДНК материала капсида и относительной мобильности и изменчивости хвостового аппарата, что обеспечивает выживание потомства фага [5].
В литературных источниках мы не нашли подробного описания методики выделения фагов бактерий рода Bordetella. Имеются упоминания, что в 2004 году исследователем Minghsun Liu были выделены бактериофаги B. bronchiseptica путем многократного облучения бактерий ультрафиолетовыми лучами [4].
В 2013 году группа американских исследователей разработала методику выделения фагов для разных фаз B. bronchiseptica (вирулентной BVG + и авирулентной BVG -). Для получения жизнеспособного профага из бактерий B. bronchiseptica в вирулентной фазе 3 мл культуры выращивали 16ч при температуре 37 °C и центрифугировали при 225 оборотах в минуту. Собранный супер-натант фильтровали через поры 0,2 мкм. Процедуру проводили с использованием отфильтрованных фагов от предыдущего цикла. Пассаж способствовал увеличению титра фага. Для третьего пассажа отфильтрованные фаги были разделены на две порции для заражения вирулентных (BVG+ фаза) и авирулентных (фаза BVG-) бордетелл. Дальнейшее культивирование приводило к повышению титра фага и получению фагов с отличающимся набором белков. Авторы установили, что многообразие белков фага позволяет ему приспосабливаться к различным фазам существования динамически изменяющихся B. bronchiseptica [6].
По нашему мнению, необходимо разработать методику выделения фагов с испытанием их диагностической и лечебно-профилактической эффективности. По результатам этих испытаний традиционные методы диагностики бордетеллёза животных можно дополнить проведением СПОТ-теста или «метода стекающей капли» с использовани-
ем специфических бордетеллёзных бактериофагов. В этом случае после выделения чистой культуры отпадает необходимость в проведении биохимической идентификации «полевых» штаммов B. bronchiseptica, что значительно сокращает время постановки окончательного диагноза (минимум в 2 раза), снижает трудоёмкость и стоимость анализов. Другой возможностью использования бордетеллезных фагов в диагностических целях является разработка реакции нарастания титра фага (РНФ). С помощью РНФ возможна ускоренная индикация штаммов B. bronchiseptica от животных без этапа выделения чистой культуры при наличии сопутствующей носо-глоточной микрофлоры.
Мы считаем, что комплексное лечение бордетеллёза животных, включающее применение этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии, возможно дополнить использованием специфических бордетеллёзных бактериофагов. Препараты в виде капель, крема, геля или мази для носа и глаз необходимо апробировать в лабораторных и клинических условиях на разных стадиях проявления заболевания у животных. Перспективно также исследование возможности применения специфических фагов с профилактической целью для предотвращения переноса возбудителя от больных и заражения восприимчивых животных и людей, а также для санации организма бордетеллоносителей. Интересен вопрос изучения возможности применения бордетеллезных фагов в качестве дезинфицирующих препаратов для санации помещений и предметов окружающей среды.
Для изготовления фаговых биопрепаратов необходимо разработать схему выделения фагов, провести отбор фагов-синерги-стов, обладающих высокой литической активностью, спектром литического действия и высокой устойчивостью к действию физико-химических факторов. Отобранные фаги не должны подавлять активность друг друга при хранении и применении.
Исходя из анализа литературных источников, исследования в данных направлениях не ведутся, но, по нашему мнению, весьма актуальны и требуют дальнейшего
Таблица l
Морфология негативных колоний бактериофагов B. bronchiseptica
№ п/п Морфология негативных колоний
Бактериофаг размер, 0 мм форма зона неполного лизиса
1 B. br. -100 УГСХА 1,5±0,2 округлые прозрачные нет
2 B. br. — 107 УГСХА 3,0±0,4 округлые прозрачные полупрозрачная, шириной 0,7±0,2 мм
3 B. br. — 110 УГСХА 1,6±0,2 округлые прозрачные в центре нет
4 B. br. -111 УГСХА 2,0±0,4 округлые прозрачные в центре нет
5 B. br. — 113 УГСХА 1,5±0,2 округлые прозрачные нет
6 B. br. — 122 УГСХА 3,2±0,3 округлые прозрачные полупрозрачная, шириной 3,5±0,5 мм
7 B. br. — 124 УГСХА 3,6±0,1 округлые, мутные полупрозрачная, шириной 1,5±0,5 мм
8 B. br. — 183 УГСХА 1,9±0,1 округлые прозрачные нет
Литическая активность фагов B. bronchiseptica Таблица 2
№ п/п Фаг Индикаторная культура Активность по Ап-пельману, степень разведения Активность по Гра-циа, количество корпускул в 1 мл
1 B. br. -100 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−7 3,1×108±1,2×108
2 B. br. — 107 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−8 g 4,3×10 ±0,1×109
3 B. br. — 110 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−7 1,8×108±1,3×108
4 B. br. -111 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−6 5,3×107±2,2×107
5 B. br. — 113 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−7 3,1×108±0,3×108
6 B. br. — 122 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−7 2,5×108±0,2×108
7 B. br. — 124 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−8 1,4×10 ±0,1×109
8 B. br. — 183 УГСХА B. bronchiseptica № 120 10−6 5,9×107±1,7×107
изучения.
Целью нашего исследования явилась разработка методов выделения фагов B. bronchiseptica, изучение их основных биологических свойств и возможностей практического применения в ветеринарии.
Объекты и методы исследований
Объектами исследований явились ре-ференс-штаммы B. bronchiseptica № 1, № 7, № 214, № 22−067, № 8344, близкородственные штаммы B. parapertussis № 119 и B. pertussis № 12, 14а, 38- референс-штаммы бактерий других родов: Yersinia pseudotuberculosis № 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus №АТСС 25 923, Escherichia coli № 4, №АТСС 25 922, Proteus mirabilis № 1, № 523, № 491, Salmonella typhimurium № 82,
Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis № 189, Providencia rett-geri № 104а, № 102д, № 175, Aeromonas hy-drophila № 01, № 02, Pseudomonas putida № 12 633, № 901, Enterobacter cloacae № 1487, № 10 005, Bacillus cereus № 2527, Bacillus sub-tillis № 6633, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами- 52 штамма B. bronchiseptica, выделенных из клинических образцов биоматериала от собак и кошек (с клинически-
1!
SEIS ES SS «1

Si
Р О Ш Sa i H ¦ i
са s!
ми проявлениями респираторных заболеваний) — 8 штаммов индуцированных фагов B. bronchiseptica.
Для выделения фагов использовали разработанную нами схему, включающую трёхдневное воздействие ультрафиолетовым излучением (УФЛ) на суточную культуру B. bronchiseptica [10]. Методы работы с фагами включали изучение их основных биологических свойств: морфологию колоний, литическую активность, спектр литического действия, специфичность, устойчивость к физическим и химическим факторам [1015].
Результаты исследований
В процессе работы из 52-х «полевых» штаммов B. bronchiseptica нами было выделено 8 фагов.
По морфологии негативные колонии выделенных фагов разделили на два типа. К первому типу отнесли колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии 0,5 — 4 мм или без неё. Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными краями, диаметром до 2 мм (табл. 1).
Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 10−6 до 10−9 по методу Аппельмана и от 5,3×107 до 4,3×109 по методу Грациа (табл. 2).
Спектр литического действия выделенных фагов, использованный на 52 штам-
мах бактерий B. bronchiseptica, составил диапазон от 21,1% до 82,7%.
Исследования показали, что изучаемые фаги характеризуются различным спектром литического действия. Бактериофаг B. br. -107 УГСХА проявил самый большой спектр литического действия, который составил 82,7%. В результате подсчетов наибольшим совместным спектром литическо-го действия обладали бактериофаги B. br. -107 УГСХА и B. br. -110 УГСХА — 92,5%.
Далее определили специфичность бактериофагов по отношению к референс-штаммам B. bronchiseptica, а также к близкородственным бордетеллам и возможным носоглоточным ассоциантам.
Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к штаммам бактерий B. bronchiseptica, не лизировали бактерии других видов и родов.
n ww
В результате исследований устойчивости выделенных фагов к физико-химическим факторам было установлено, что прогревание фагов при температуре 60 °C в течение 30 минут не оказало влияния на активность фагов, все штаммы бордетелл погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65 °C приводило к потере их активности.
Бактериофаги проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут, тогда как все штаммы B. bronchiseptica инактивировались при
Таблица 3
Спектр литического действия выделенных бактериофагов B. bronchiseptica
Бактериофаги
§ § § § § § § §
Штаммы бактерий ё? ё? ?? ? ?
B. bronchiseptica (n=52) о о ч 1 гч о ч 1 о ч ч 1 ч ч ч 1 по ч ч 1 & lt-м & lt-ч ч 1 & lt-ч ч 1 по 00 ч 1
.r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r. b
CQ CQ со CQ CQ CQ CQ CQ
Количество положительных результатов 25 43 23 29 11 14 14 20
Процент лизируемых культур (%) 48,0 82,7 44,2 55,8 21,1 26,9 26,9 38,5
Таблица 4
Специфичность бордетеллезных фагов
Бактериофаги
fi fi fi Si Si fi fi g
B. bronchiseptica Количество штаммов g о g 14 g о g «4 g rn g & lt-N «N 1 g «N 1? 00 4 1
i i i ч 1 1
vi -О vi -О vi -О vi -О vi -О с -O с -O с -о
B. B. B. B. B. B. B. B.
Bordetella bronchiseptica 5 ± ± ± ± ±
Bordetella parapertus- 1
sis
Bordetella pertussis 3 — - - - - - - -
Yersinia pseudotuber- 1
culosis
Morganella morganii 1 — - - - - - - -
Staphylococcus aureus 1 — - - - - - - -
Escherichia coli 2 — - - - - - - -
Proteus mirabilis 3 — - - - - - - -
Salmonella typhimuri- 1
um
Citrobacter freundii 1 — - - - - - - -
Klebsiella pneumonia 1 — - - - - - - -
Enterococcus faecalis 1 — - - - - - - -
Providencia rettgeri 3 — - - - - - - -
Aeromonas hydrophila 2 — - - - - - - -
Pseudomonas putida 2
12 633, 901
Enterobacter cloacae 2 — - - - - - - -
Bacillus cereus 1 — - - - - - - -
Bacillus subtillis 1 — - - - - - - -
Примечание: «-» — отсутствие лизиса- «+» — лизис более 75% исследованных штаммов- «+» — лизис 50%-75% исследуемых штаммов
10-минутной обработке.
Выводы
В результате проведенных исследований нами изучены основные биологические свойства выделенных 8-ми фагов B. bronchiseptica. Литическая активность их варьировала от 10−6 до 10−9 по методу Ап-пельмана и от 5,3×107 до 4,3×109 по ме-
тоду Грациа, а спектр литического действия составил от 21,1% до 82,7%. Выделенные бактериофаги обладали специфичностью, проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1: 10) в течение 30 минут и выдерживали 30-минутное нагревание при 60 °C.
Мы считаем перспективной дальней-
SI
SEIS es «1

Si
p U Ш IS i H ¦ i
ca s!
шую селекцию выделенных фагов с последующей разработкой диагностических и лечебно-профилактических биопрепаратов.
Библиографический список
1. Результаты научных исследований сотрудников кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П. А. Столыпина / Под ред. Васильева Д. А., Золотухина С. Н. — Ульяновск: ГСХА, 2013. — 316 с.
2. Каратаев, Г. И. Мигрирующие генетические элемены Bordetella pertussis, как генетические и эпидемиологические маркеры / Г. И. Каратаев, Л. Н. Синяшина, И. Г. Сивов // Вестник РАМН. — 2000. — № 1. — С. 34−38.
3. Каратаев, Г. И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша: дис… докт. биол. наук, — М. -2008. — 254 с.
4. Синяшина, Л. Н. Характеристика основных биологических свойств бактериофагов Bordetella / Л. Н. Синяшина, И. А. Лапаева, С. М. Мебель // Микробиология. -1982. — Т.8. — С. 66−69.
5. Shelton, C.B. Purification and Characterization of a Temperate Transducing Bacteriophage lor Bordetella avium /C.B. Shelton [et al.] //Journal of Bacteriol. — 2000. — V. 82. — P. 6130−6136.
6. Liu, M. Reverse Transcriptase-Mediat-ed Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage / M. Liu // Science. — 2002. — V. 295. — P. 2091−2094.
7. Wei, D. Three-dimensional structure of tropism-switching Bordetella bacteriophage / D. Wei // PNAS. — 2010. — V. 107. — №. 9. — P. 4347−4352.
8. Overstreet, C.M. Self-made phage libraries with heterologous inserts in the Mtd of Bordetella bronchiseptica Protein Engineer-
ing / C.M. Overstreet // Design & amp- Selection. -2012. — V. 25. — №. 4. — P. 145−151.
9. Yuan, T.Z. Protein Engineering with Biosynthesized Libraries from Bordetella bronchiseptica Bacteriophage / T.Z. Yuan // PLoS ONE. — 2013. — 8(2): e55617. doi: 10. 1371/jour-nal. pone. 55 617.
10. Васильев, Д. А. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д. А. Васильев, Е.Н. Семани-на, С. Н. Золотухин, Ю. Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2011. — № 1 (13).
— С. 59−62.
11. Золотухин, С. Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С. Н. Золотухин, Л. П. Пульчеровская, Д. А. Васильев // Вестник УГСХА. — 2004. — № 12. — С. 50−53.
12. Васильева, Ю. Б. Разработка методов детекции бактерий Bordetella bronchiseptica / Ю. Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. — 2013. — № 3 (23). — С. 46−52.
13. Васильева, Ю. Б. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики бордетеллёза / Ю. Б. Васильева // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 4- URL: http: //www. science-education. ru/110−9751.
14. Васильева, Ю. Б. Конструирование биопрепаратов для лабораторной диагностики бордетеллёзной инфекции / Ю. Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
— 2013. — № 2 (22). — С. 25−29.
15. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. — М.: Научный мир, 2012. — С. 588−593.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой