Профилирование рибосом Mycoplasma gallisepticum

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 577. 2
Профилирование рибосом Mycoplasma gallisepticum
Г. Ю. Фисунов*, Д. В. Евсютина, А. А. Арзамасов, И. О. Бутенко, В. М. Говорун Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России, 119 435, Москва, ул. Малая Пироговская, 1а *E-mail: herr. romanoff@gmail. com Поступила в редакцию 16. 06. 2015
РЕФЕРАТ Успешное применение высокопроизводительных технологий все чаще приводит к обнаружению случаев низкой корреляции между уровнем мРНК и белков в клетках. Это явление, противоречащее классическим представлениям, обнаружено у ряда бактерий, таких, как Escherichia coli, Desulfovibrio vulgaris и Lactococcus lactis. Поэтому важной представляется разработка технологий исследования механизмов регуляции экспрессии генов на уровне трансляции, в том числе высокопроизводительными методами. Проведено протеомное профилирование рибосом Mycoplasma gallisepticum, обнаружен ряд неканонических белков, связанных с рибосомами в большом количестве. Показано, что количество мРНК, связанной с рибосомами, определяется, в основном, двумя параметрами: уровнем транскрипции гена этой мРНК и эффективностью комплементарных взаимодействий между 3'--концом 16S рРНК и сайтом связывания рибосомы в 5'--нетранслируемой области мРНК.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА микоплазма, рибосома, профилирование рибосом.
ВВЕДЕНИЕ
Проведение системных исследований с использованием «омиксных технологий» все чаще выявляет неожиданные явления и новые регулируемые события, которые просто невозможно определить, используя одну омиксную технологию или традиционные методы анализа. Вместе с тем, совместный анализ данных, полученных при количественных определениях содержания РНК или белков и пептидов, неизбежно генерирует значительное количество артефактов вследствие погрешностей каждого из используемых технологических приемов. Это требует тщательного перекрестного анализа, а также дополнительного подтверждения получаемых данных с использованием альтернативных или ортогональных технологических приемов. Поэтому простейшие микроорганизмы неслучайно служат объектами для отработки общей методологии анализа совместного поведения макромолекул в живых системах и их взаимного влияния друг на друга.
Европейское молекулярно-биологическое сообщество сформулировало проект, посвященный изучению возбудителя респираторных заболеваний человека, представителя класса Mollicutes — Mycoplasma pneumoniae [1, 2]. Затем наша группа выбрала другого представителя этого класса — M. gallisepti-cum — для проведения аналогичных работ. Вскоре после этого американские исследователи смогли по-
строить компьютерную модель метаболизма и адаптивных реакций у наименьшей самореплицирующейся бактерии — M. genitalium [3]. Несмотря на эти успехи, неизученными остаются большое количество вопросов, которые требуют привлечения дополнительных методов, необходимых для измерения динамических процессов при реализации минимального набора генетической информации, закодированной в геноме микоплазм.
Молликуты, к которым относится M. gaШsepti-cum, характеризуются существенной редукцией генома. Средний размер генома микоплазм составляет 0. 8−1 млн п.н. (1 млн у M. gaШsepticum) [4]. В связи с редукцией генома у микоплазм утрачены известные системы регуляции экспрессии генов [5].
Как показано нами ранее, M. gallisepticum отвечают на стрессовые воздействия на уровне транскрипции [6]. В то же время эти изменения в целом слабо отражаются на уровне трансляции [6]. У этого явления могут быть две причины: скорость трансляции у M. gallisepticum слишком мала для того, чтобы изменения на уровне белка стали видимыми за время эксперимента (30 мин) — мРНК селективно связывается с рибосомами во время стрессового ответа. Механизм селективного связывания мРНК с рибосомами может быть реализован через взаимодействие с антисмысловыми РНК, блокирующими сайт связывания рибосомы [7]. Кроме того, даже в пределах од-
ной клетки рибосомы могут отличаться друг от друга как по нуклеотидной последовательности рРНК [8], так и своему белковому составу. Например, рибосомы Escherichia coli, не имеющие в своем составе белка S1, транслируют преимущественно безлидерные транскрипты [9]. С рибосомами могут быть ассоциированы регуляторные белки, модулирующие процесс трансляции отдельных транскриптов [10]. В комплексе с рибосомой могут находиться «неканонические» белки, основная функция которых не имеет ничего общего с процессом трансляции. Например, глико-генсинтаза Saccharomyces cerevisiae может влиять на трансляцию ряда РНК [11].
Развитие высокопроизводительных технологий привело к накоплению большого объема данных, характеризующих процессы транскрипции и трансляции в масштабе целой клетки. Согласно классическим представлениям, уровень белка в целом определяется уровнем соответствующей мРНК, однако, в ряде случаев это не так. Высокопроизводительные технологии значительно увеличили количество случаев, когда уровень белка не коррелирует с уровнем мРНК. Такие данные получены для различных бактерий, включая E. coli [12], Desulfovibrio vulgaris [13] и Lactococcus lactis [14]. Коэффициент корреляции Пирсона между уровнем мРНК и уровнем белка, согласно опубликованным данным, может варьировать от 0. 53 до 0. 19 в зависимости от вида и состояния бактерии. Значительный прогресс в изучении регуляции экспрессии генов на уровне трансляции достигнут при использовании технологии профилирования рибосом [15], позволяющей наблюдать процесс трансляции почти в реальном времени. Таким образом, этап связывания мРНК с рибосомой и ее трансляции является чрезвычайно важным звеном регуляции экспрессии генов у бактерий. Поскольку для мол-ликут в целом и M. gallisepticum в частности характерна сильная редукция регуляторных механизмов, работающих на уровне транскрипции, регуляция экспрессии генов на уровне трансляции может быть едва ли не самым важным звеном, определяющим представленность белков в клетке.
В настоящей работе проведены высокопроизводительное протеомное профилирование рибосом M. gallisepticum для определения их состава и транскрипционное профилирование мРНК, связанной с рибосомами, методом ПЦР в реальном времени.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культивирование клеток M. gallisepticum S6 Культуру клеток M. gallisepticum S6 культивировали в жидкой среде (Триптоза 20 г/л, NaCl 5 г/л, KCl
1.3 г/л, Трис 3 г/л, дрожжевой диализат 5%, сыворотка крови лошади 10% («Биолот»), глюкоза 1%, pH 7. 4) до середины логарифмической фазы как описано в [16].
Выделение рибосом
К 12 мл культуры клеток M. gallisepticum добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 100 мкг/мл, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин на льду. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4500 g (20 мин при 4°C). Супернатант отбирали и суммарный осадок клеток, полученный с 50 мл культуры, ресу-спендировали в 500 мкл буфера для лизиса (20 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2, 2 мМ спермиди-на, 100 мкг/мл хлорамфеникола, 5 мкл ингибитора протеаз (GE Healthcare), 200 ед. ингибитора РНКаз (Thermo Scientific), pH 7. 5). После ресуспендирова-ния к буферу добавляли 15 мкл NP-40 и тщательно перемешивали. Клеточный лизат замораживали при -75°C не менее 1 ч. Затем клеточный лизат осветляли центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин при 4 °C. Супернатант отбирали и фракционировали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы.
Ступенчатый градиент сахарозы создавали в 5-мл поликарбонатной пробирке путем послойного нанесения раствора сахарозы разной плотности с помощью пипетки. Объем каждого слоя — 750 мкл, шаг ступени — 10%. В настоящей работе использовали градиент 10−50% сахарозы (всего пять ступеней). Раствор сахарозы готовили на таком же буфере, как для лизиса клеток (без добавления NP-40, хлорамфеникола, ингибиторов протеаз и РНКаз) при 50 000 об/мин (среднее ускорение 200 620 g) в течение 1 ч при 4 °C, центрифуга Optima (Beckman Coulter), бакет-ротор MLS 50 (Beckman Coulter). Фракции объемом 200 мкл отбирали с помощью пипетки.
Выделение РНК из фракций
К каждой фракции добавляли 400 мкл реагента Trizol LS (Life Technologies). Смесь тщательно перемешивали и добавляли 200 мкл хлороформа, еще раз перемешивали и центрифугировали в течение 10 мин при 16 000 g и 4 °C. Супернатант отбирали, добавляли равный объем изопропанола. Препарат инкубировали при -20°C не менее 1 ч. РНК осаждали центрифугированием при 16 000 g (20 мин, 4°C). Осадок промывали 80% (об. /об.) этанолом. Препарат РНК растворяли в 10 мкл воды (Panreac). Представленность РНК во фракциях измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Эксперимент проводили в трех биологических по-вторностях.
Выделение белка из фракций и трипсинолиз
Для осаждения белков фракцию разводили в 10 раз в деионизованной воде и добавляли трихлоруксус-ную кислоту (Sigma-Aldrich) до конечной концентрации 10% (об. /об.), выдерживали при 4 °C в течение ночи с последующим центрифугированием (15 мин при 16 000 g). Полученные осадки промывали 2 раза 1 мл холодного ацетона (Pancreac) для удаления остатков трихлоруксусной кислоты.
Белковые осадки перерастворяли в 2535 мкл 50 мМ раствора гидрокарбоната аммония (Pancreac), содержащего 0. 5% RapiGest SF (Waters) и 1 мкл смеси нуклеаз (GE Healthcare), после чего выдерживали в течение 30 мин при 4 °C, инкубировали в течение 5 мин при 100 °C и центрифугировали (10 мин при 16 000 g). Супернатант отбирали и определяли концентрацию белка в каждом образце с использованием бицинхони-новой кислоты (Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit, Sigma-Aldrich). Для восстановления дисуль-фидных мостиков к растворам белков добавляли дитиотреитол (Bio-Rad) до конечной концентрации 10 мМ, реакцию проводили в течение 30 мин при 60 °C на шейкере (600 об/мин). Последующее алкилирование остатков цистеина йодацетамидом (конечная концентрация 30 мМ) (Bio-Rad) проводили в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Затем к образцам белков добавляли трипсин (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega) в соотношении масса трипсина/масса белка 1: 50. Трипсинолиз проводили в течение 16 ч при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 10% трифторуксусной ксилоты (Sigma-Aldrich) до pH 2. 0, после чего продукты инкубировали в течение 45 мин при 37 °C и центрифугировали (15 мин при 16 000 g) для удаления RapiGest SF. Смеси триптических пептидов дополнительно очищали путем твердофазной экстракции с использованием мини-колонок Discovery DSC-18 (Supelco) согласно рекомендациям производителя. Для дальнейшего масс-спектрометрического анализа элюаты высушивали на вакуумном концентраторе CentriVap (Labconco) и растворяли в 10 мкл 3% раствора аце-тонитрила, содержащего 0. 1% муравьиную кислоту.
Выделение РНК из культуры клеток
РНК из культуры клеток выделяли согласно [16]. К аликвоте клеточной культуры добавляли тройной объем реагента Trizol LS (Thermo Scientific). Разделение фаз проводили, добавляя хлороформ из расчета 80 мкл на 100 мкл культуры. Образцы центрифугировали при 16 000 g в течение 15 мин при 4 °C. Далее РНК переосаждали изопропанолом в объемном соотношении 1: 1.
Синтез кДНК и кПЦР
Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени проводили как описано в [16]. РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific). Затем кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы H-minus Reverse Transcriptase (Thermo Scientific) и случайных гекса-меров. Для увеличения стабильности РНК использовали ингибитор РНКаз RiboLock (Thermo Scientific).
Количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР) проводили на амплификаторе C1000 Touch (Bio-Rad) с оптическим модулем CFX96 (Bio-Rad). Для проведения ПЦР использовали Х10 ПЦР-буфер («Литех») (конечное разведение Х1. 5) и Х10 раствор dNTP («Литех»), Taq-полимеразу («Литех»), краситель SYBR Green I (Life Technologies), по 5 пмоль прай-меров, 2% формамида. Данные нормировали по средней представленности мРНК 21 гена домашнего хозяйства (eno, gaphd, tpiA, tuf, tsf, acoA, acoB, aceF, ldh, ackA, pgk, fba, pgi, pfkA, gpmI, pykF, tktA1, rpiB, eutD, prsA, lpd). Использовали те же праймеры для кПЦР, что и ранее [6].
Идентификация белков
Хроматомасс-спектрометрический анализ пептидных экстрактов проводили с помощью масс-спектрометра Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific), сопряженного с хроматографической системой Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex) через источник ионов Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific).
Пептиды разделяли с помощью обращенно-фазо-вой хроматографии с использованием предколонки Acclaim PepMap (сорбент — C18, длина — 2 см, внутренний диаметр — 75 мкм, размер частиц — 3 мкм, диаметр пор — 100 А, Dionex) и колонки Zorbax (сорбент — Zorbax 300SB-C18, длина — 15 см, внутренний диаметр — 75 мкм, размер частиц — 3.5 мкм, диаметр пор — 100 А, Agilent Technologies). Каждую пробу наносили на предколонку в воде для ВЭЖХ с 0. 1% муравьиной кислоты (об. /об.) со скоростью потока 2 мкл/мин в течение 5 мин, после чего предколонку включали в линию перед колонкой. Пептиды элю-ировали смесью растворителей, А (вода для ВЭЖХ с 0. 1% муравьиной кислоты (об. /об.)) и Б (79. 9% аце-тонитрила для ВЭЖХ (об. /об.), 20% воды для ВЭЖХ и 0. 1% муравьиной кислоты (об. /об.)), линейно повышая содержание растворителя Б от 5 до 40% (об. /об.) в течение 120 мин при скорости потока 300 нл/мин, после чего систему промывали в течение 10 мин смесью с 99% (об. /об.) растворителя Б, а затем в течение 10 мин смесью с 5% растворителя Б.
Напряжение источника 2000 В, а температура капилляра 200 °C. Масс-спектрометр работал в режиме данные-зависимого анализа: в каждом цикле снима-
ли обзорный масс-спектр, 20 наиболее интенсивных в обзорном масс-спектре ионов поочередно отбирали для фрагментации и записи масс-спектра дочерних ионов, после чего исключали из рассмотрения на 10 с. Обзорный масс-спектр снимали при разрешении 70 000 в диапазоне отношений массы к заряду от 400 до 1200 m/z c параметром автоматической регулировки усиления (AGC) 106 и ограничением по времени заполнения в 50 мс. Спектры дочерних ионов снимали при разрешении 17 500 и AGC -105 c ограничением по времени заполнения в 100 мс. Параметр энергии столкновений был равен 30, ширина полосы пропускания — 2.
На основе полученных масс-хроматограмм (фор-мата. raw) с помощью утилиты MSConvert пакета ProteoWizard (версия 3.0.7. 414, 64 бита) составляли список спектров фрагментации в центроидном виде в формате Mascot Generic Format, которые затем интерпретировали с помощью поисковой машины Mascot (Matrix Science Inc.). Идентификацию проводили по базе белковых последовательностей M. gallisepticum S6 CP006916.2 с добавленными к ней последовательностями часто встречающихся белковых контаминантов. Использовали следующие параметры идентификации — триптические пептиды с не более чем одним пропущенным сайтом расщепления трипсином, заряд прекурсоров -1−2 или +3, допустимая ошибка масс родительских ионов — 10 ppm, допустимая ошибка масс фрагментов — 0.5 Да, инструмент — ESI-TRAP, постоянные модификации — нет, вариабельные модификации — кар-бамидометилирование цистеина и окисление мети-онина.
Список статистически значимых идентификаций определяли как список белков, для которых идентифицировано два или более пептида со значимостью выше 0. 05 согласно рангу.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Распределение РНК в выделенных фракциях
После фракционирования цитоплазмы M. gallisepticum распределение РНК во фракциях измеряли с помощью ОТ-кПЦР (см. «Экспериментальную часть»). Результаты представлены на рис. 1, на котором видно, что малые субъединицы и полноразмерные рибосомы образуют пики в соответствующих фракциях (7 и 11). Для M. gallisepticum характерен примерно четырехкратный избыток 16S рРНК по сравнению с 23S рРНК [16], что согласуется с наблюдаемой картиной. Во фракциях после 12−22 наблюдается эквимолярное соотношение 16S и 23S рРНК. Относительно высокое содержание мРНК выявлено только в полисомах (фракции 15 и больше).
А
10% г
20%
40%
50%
о
m н
и ф
X X
с
о
и ф
X X
с
о
35 000. 00 30 000. 00 25 000. 00 20 000,00 15 000. 00 10 000. 00 5000. 00 0. 00
0. Э5 0. 30 0. 25 0 2D 0. 15 0. 10 0. 05
Б






1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 f0 11 12 13 14 IS 16 17 10 19 20 21 2 Номер фракции
-16S
23S
1 г 3 i 3 3 7 3 9 10 11 li 13 14 15 16 17 13 Ii 20 21 $ Номер фракции
-gaphd-w-tuf
Рис. 1. Фракционирование цитоплазматической фракции M. gallisepticum в градиенте сахарозы. Измеряли распределение во фракциях — 16S рРНК, 23S рРНК, мРНК глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (gaphd) и фактора трансляции EF-Tu (tuf). Все результаты (для рРНК и мРНК) нормированы на количество 16S рРНК во фракции номер 1. A — профиль ступенчатого градиента в масштабе относительно полученных фракций- Б — распределение рРНК по фракциям- В -распределение мРНК по фракциям
Наибольшим было количество мРНК во фракциях 17 и 18, где оно составляло примерно 1 мкг. Это делает соответствующие фракции наиболее удобными для последующего анализа, особенно методами высокопроизводительного секвенирования.
Пригодность методики для количественного анализа представленности транскриптов, связанных с рибосомами, проверяли на фракции номер 18. Было проведено транскрипционное профилирование методом кПЦР 67 генов в трех биологических повторах. Воспроизводимость полученных данных оценили ме-
В
Корреляция по Спирману между биологическими повторами выделения мРНК, связанной с рибосомами, фракция номер 18. Представленность РНК измеряли методом ПЦР в реальном времени
тодом корреляции по Спирману (таблица). Во всех парах образцов корреляция составила 0. 87−0. 92, что говорит о хорошей воспроизводимости методики. Корреляция между представленностью транс-криптов во фракции, связанной с рибосомами мРНК, и в суммарной цитоплазматической фракции мРНК составила 0. 78.
Протеомное профилирование рибосом
M. gallisepticum
С целью валидации методики выделения рибосом из клеток M. gallisepticum проведено протеомное профилирование фракций 7 (30S субъединицы), 17 и 18 (70S рибосомы, связанные с мРНК), и получена полуколичественная оценка представленности белков с помощью индекса emPAI.
Во фракции 7 обнаружено 18 из 20 белков малой субъединицы рибосомы и только 8 из 33 белков большой субъединицы, что согласуется с данными о распределении рРНК во фракциях. Таким образом, во фракции 7 преимущественно содержатся малые субъединицы рибосомы. Необходимо отметить, что фракция 7 содержит значительное количество примеси других клеточных белков.
Во фракциях 17 и 18, как и ожидалось, наиболее представлены рибосомные белки. Всего обнаружено 47 рибосомных белков из 53 (19 из 20 белков 30S субъединицы и 28 из 33 50S субъединицы). Все не найденные белки имеют небольшой размер (менее 100 аминокислотных остатков), что, вероятно, и стало причиной отсутствия их идентификации. Представленность рибосомных белков в данной фракции можно оценить как эквимолярную. Белки малой и большой субъединиц набирают одинаковые индексы emPAI. Кроме того, во фракции 18 обнаружено высокое содержание белков, ассоциированных с рибосомами (факторы трансляции EF-Tu и EF-Ts, шапероны Tig и DnaK), а также белка HU. Известно, что этот белок, бактериальный аналог гистонов,
способен связывать как ДНК, так и РНК [17]. Не исключено, что он также способен связывать мРНК или рРНК в составе рибосом.
Во фракции 18 нами выявлен белок GCW_3 230 с высоким индексом emPAI. Это консервативный белок с неизвестной функцией, встречающийся у многих микоплазм. Его особенностью является экстремальное значение pI 11.0 при небольшой длине (74 аминокислотных остатка), что делает его похожим на рибосомные белки. Возможно, GCW_3 230 — новый рибосомный белок. Во фракции 18 также обнаружено некоторое количество белков с достаточно высоким индексом представленности emPAI, не имеющих прямого отношения к процессу трансляции. Например, это триозофосфатизомераза, тиоредок-син, ряд белков с неизвестной функцией. Их присутствие, с одной стороны, можно объяснить неспецифическим взаимодействием с рибосомами после лизиса клетки. С другой стороны, за последнее время показано, что такие белки могут модулировать активность рибосомы in vivo [11].
Влияние вторичных структур и сайта связывания рибосомы на представленность мРНК в пуле, связанном с рибосомами
Наши результаты показывают, что представленность мРНК во фракции, связанной с рибосомами, в целом, соответствует представленности мРНК во фракции суммарной РНК. Однако ряд мРНК содержится в этой фракции в значимо большем или меньшем количестве. Эффективность связывания мРНК с рибосомой определяется в том числе комплементарными взаимодействиями между З'--концом 16S рРНК и сайтом связывания рибосомы в 5'--нетранслируемой области мРНК, а также наличием вторичных структур в этой области, способствующих или препятствующих связыванию рибосомы.
С помощью программы RNAduplex мы провели in silico моделирование взаимодействия между З'--концевой последовательностью 16S рРНК (UUACCUCCUUUCU, подчеркнут канонический сайт связывания рибосомы в E. coli) и 25-нуклеотид-ной последовательностью перед старт-кодоном каждого гена. В результате получены оценки силы связывания 16S рРНК с 5'--нетранслируемой областью соответствующих мРНК. Корреляция (по Спирману) между нашей оценкой силы сайта связывания рибосомы и представленностью соответствующей мРНК во фракции РНК, связанной с рибосомами, составила 0. 39 (p & lt- 0. 01). Мы выбрали мРНК более чем в 2 раза перепредставленные (19) и недопредставленные (25) во фракции, связанной с рибосомами, по сравнению с суммарной мРНК. Энергия образования дуплекса с З'--концевой областью 16S рРНК у 5'--нетранс-
Повтор 1 Повтор 2 Повтор 3
Повтор 1 1 0. 87 0. 92
Повтор 2 0. 87 1 0. 90
Повтор 3 0. 92 0. 90 1
лируемой области перепредставленных мРНК была в среднем в 2 раза меньше, чем у недопредставленных (dG = -4. 96 и -2. 52 ккал/моль соответственно).
Некоторые мРНК, такие, как GCW_2 495 и putA, несмотря на низкую расчетную эффективность связывания с рибосомой (dG & gt- 0), лучше представлены во фракции, связанной с рибосомами, чем в суммарной РНК. В случае GCW_2 495 этот парадокс можно объяснить тем, что ген GCW_2 495 экспрессируется в составе полицистронной мРНК вместе с соседним геном GCW_2 490, который имеет очень эффективный сайт связывания рибосомы (dG = -11.8 ккал/моль). Таким образом, соответствующая мРНК, в целом, хорошо связывается с рибосомой.
Ряд мРНК менее представлен в связанной с рибосомами фракции, чем в суммарной РНК, несмотря на предсказанную эффективность связывания с рибосомой. К таким мРНК относятся GCW_85, glpF, gyrA, gyrB, ruvA, potD и hrcA. Подобное поведение можно объяснить присутствием неких вторичных структур в 5'--нетранслируемой области мРНК, препятствующих связыванию рибосомы. С помощью программы quickfold мы рассчитали величины dG образования шпилечных структур в районе сайта связывания рибосом и старт-кодона с помощью скользящего окна длиной 30 нуклеотидов. В результате обнаружили, что величина dG структуры в районе старт-кодона коррелирует с представленностью мРНК в связанной с рибосомами фракции (рис. 2). Наилучшая корреляция наблюдается в диапазоне −21… +9 нуклеотидов от старт-кодона как для представленности мРНК в связанной с рибосомами фракции, так и для относительного обогащения связанной с рибосомами мРНК относительно суммарной РНК. Таким образом, представленность мРНК в связанной с рибосомами фракции M. gallisepticum может модулироваться с помощью вторичных структур в районе старт-кодона.
ВЫВОДЫ
Результаты нашей работы позволяют заключить, что количество мРНК, связанной с рибосомами, у M. gallisepticum в основном определяется двумя параметрами: уровнем транскрипции соответствующего гена и эффективностью комплементарных взаимодействий между З'--концом 16S рРНК и сайтом
-35 -30 -25 -20 -18
Координата левой границы
Фракция мРНК
г-Спирман критическое (р& lt-0. 05) — Разность (РС-СЦ)
Рибосомально-связанная Суммарная цитоплазматическая
Рис. 2. Корреляция между представленностью мРНК в соответствующей фракции и величиной dG структуры в районе старт-кодона в скользящем окне длиной 30 нуклеотидов. Уровень значимости р & lt- 0. 05 для значения корреляции & gt- 0. 25
связывания рибосомы в 5'--нетранслируемой области мРНК. Нами разработана количественная и воспроизводимая методика получения фракции связанной с рибосомами мРНК M. gallisepticum, которая может использоваться для изучения процесса трансляции у этой бактерии. •
Работа финансировалась грантом РНФ (№ 14−24−159).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Guell M., van Noort V., Yus E., Chen W. -H., Leigh-Bell J., Michalodimitrakis K., Yamada T., Arumugam M., Doerks T., Kuhner S., et al. // Science. 2009. V. 326. № 5957. P. 1268−1271.
2. Kuhner S., van Noort V., Betts M.J., Leo-Macias A., Batisse C. ,
Rode M., Yamada T., Maier T., Bader S., Beltran-Alvarez P., et al. // Science. 2009. V. 326. № 5957. P. 1235−1240. 3. Karr J.R., Sanghvi J.C., MacKlin D.N., Gutschow M.V., Jacobs J.M., Bolival B., Assad-Garcia N., Glass J.I., Covert M.W. // Cell. 2012. V. 150. № 2. P. 389−401.
4. Fisunov G., Alexeev D., Bazaleev N., Ladygina V., Galyamina M., Kondratov I., Zhukova N., Serebryakova M., Demina I., Govorun V. // PLoS One. 2011. V. 6. № 7. P. e21964.
5. Moreno-Campuzano S., Janga S.C., Perez-Rueda E. // BMC Genomics. 2006. V. 7. P. 147.
6. Mazin P.V., Fisunov G.Y., Gorbachev A.Y., Kapitskaya K.Y., Altukhov I.A., Semashko T.A., Alexeev D.G., Govorun V.M. // Nucl. Acids Res. 2014. V. 42. № 21. P. 13 254−13 268.
7. Faner M.A., Feigh A.L. // Methods. 2013. V. 63. № 2. P. 144−159.
8. Hillebrand A., Wurm R., Menzel A., Wagner R. // Biol. Chem. 2005. V. 386. № 6. P. 523−534.
9. Moll I., Resch A., Blasi U. // FEBS Lett. 1998. V. 436. № 2. P. 213−217.
10. Shi J., Jin Y., Bian T., Li K., Sun Z., Cheng Z., Jin S., Wu W. // Mol. Microbiol. 2015. doi: 10. 1111/mmi. 13 126.
11. Fuchs G., Diges C., Kohlstaedt L.A., Wehner K.A., Sarnow P. // J. Mol. Biol. 2011. V. 410. № 1. P. 118−130.
12. Lu P., Vogel C., Wang R., Yao X., Marcotte E.M. // Nat. Bio-technol. 2007. V. 25. № 1. P. 117−124.
13. Nie L., Wu G., Zhang W. // Genetics. 2006. V. 174. № 4. P. 2229−2243.
14. Picard F., Milhem H., Loubiere P., Laurent B., Cocaign-Bous-quet M., Girbal L. // BMC Genomics. 2012. V. 13. P. 528.
15. Ingolia N.T. // Nat. Rev. Genet. 2014. V. 15. № 3. P. 205−213.
16. Gorbachev A.Y., Fisunov G.Y., Izraelson M., Evsyutina D.V., Mazin P. V, Alexeev D.G., Pobeguts O.V., Gorshkova T.N., Kov-alchuk S.I., Kamashev D.E., et al. // BMC Genomics. 2013. V. 14. P. 726.
17. Balandina A., Kamashev D., Rouviere-Yaniv J. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 31. P. 27 622−27 628.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой