Ферментативное определение содержания этанола в плодово-ягодных винах и соках

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

раженной гетероспермии P. major тем не менее не может быть отнесен к гетеродиа-споричным видам. Подобное проявление гетероспермии характеризует самый низкий уровень адаптивной специализации ге-терокарпного вида.
Библиографический список
1. Nicotra L. Eterocarpia ed eterosper-mia/ L. Nicotra // Bull. Soc. Bot. ital., 1898.- T. 12. -P. 213 — 216
2. Huth E. Ueber geocarpe, amphicarpe und heterocarpePflanzen/ E. Huth// Samml. Naturwis.- Vortr., 1890.- Bd.3.- № 10. S.1 — 32
3. Delpino F. Eterocarpia ed eteromeri-carpia nelle Angiospermae/ F. Delpino// Mem. R. Accad. Sci. Instituto Bologna., 1894.- T.4. -Ser.5.- P. 27 — 68
4. Войтенко В. Ф. Гетерокарпия (гете-родиаспория) у покрытосеменных растений: анализ понятия, классификация, терминология/ В.Ф. Войтенко// Ботанический журнал.- М., 1989.- Е. 74.- № 3.- С. 281 — 297
5. Левина Р. Е., Войтенко В. Ф. Гетерокарпия или разноплодие/ Р.Е. Левина// Природа.- М., 1975.- № 5.- С. 87 — 95
6. Muller-Schneider P., Lhotska M. Zur Terminologie der Verbeitungbiologie der Blutenpflanzen/ P. Muller-Schneider// Folia Geobot et Phytotaxon., 1971.- Vol.6.- № 4.- P. 407 — 417
7. Меликян А. П. Некоторые современные аспекты исследования семян цветковых растений/ А.П. Меликян// Теоретическая и прикладная карпология. Кишинев, 1989. С. 24 — 27
УДК 633. 256
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ OПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРжАНИя эТАНОЛА
в плодово-ягодных винах и соках
Владимир Андреевич Сибирный, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» e-mail: vladimir_sibirnyi@yahoo. com
Гончар Михаил Васильевич, доктор биологических наук, профессор, Институт биологии клетки НАН Украины,
79 005, Львов, ул. Драгоманова, 14/16 Телефон: (0322) 72−8508- e-mail: myg52@yahoo. com
Ключевые слова: алкоголь, ферментативное определение, алкогольоксидаза, плодово-ягодные вина, соки
Работа посвящена использованию ферментного набора «Алкотест» для определения содержания этанола в плодово-ягодных винах и соках. Такой метод значительно дешевле по сравнению с другими ферментативными методами благодаря низкой стоимости препарата алкогольоксидазы (АО), полученной из мутантного штамма метилотрофных дрожжей HansenulapolymorphaC-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной репрессией синтеза АО. Компоненты исследованных напитков не оказывают негативного влияния на результаты определения, что подтверждено методом газовой хроматографии.
Введение ние его содержания играют важную роль в
Тесты на наличие этанола и определе- контроле процессов брожения и сертифи-
кации различных алкогольных и безалкогольных напитков. Имеется ряд различных химических и физико-химических методов для определения спиртов [1]. Простейший тест заключается в перегонке спирта и ден-симетрическом или рефрактометрическим анализом дистиллята. Недостатки таких методов — их продолжительность, низкая точность и сложность выполнения серийных определений.
Особенно эффективна газо-жидкост-ная хроматография, которая обеспечивает возможность одновременной идентификации и количественного определения различных веществ[2], однако из-за высокой стоимости оборудования и необходимости квалифицированного персонала этот метод не получил широкого распространения. Аналогичные ограничения имеют экспресс-методы определения этанола с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).
Для определения этанола давно предложен ферментативный метод, с использованием фермента алкогольдегидрогеназы (АдГ) в присутствии кофермента (НАД). Этот метод достаточно чувствителен и селективен, но из-за высокой стоимости фермента и кофактора слишком дорог. Альтернативой может быть фермент алкогольоксидаза (АО) метилотрофных дрожжей. В отличие от АдГ АО содержит крепко связанный коэнзим ФАД (флавинадениндинуклеотид) и не требует добавления экзогенного кофактора и, кроме того, оксидазная реакция необратима [3]. Фермент А О катализирует окисление этанола кислородом воздуха с образованием уксусного альдегида и перекиси водорода:
АО
сн3сн2он + о2 ^ сн3а-ю + н2о2
Перекись водорода окисляет в перок-сидазной реакции специфичное химическое соединение (хромоген) до окрашенного продукта, количество которого можно определять фотометрически:
Пероксидаза
Н202 + SH2----------& gt- S + 2Н20
Хромоген Краситель
На этой реакции основано использование АО в аналитическом наборе «Алкотест»,
разработанный в Институте биологии клетки НАН Украины [4]. Этот вариант анализа имеет ряд преимуществ: 7-кратное увеличение чувствительности, точность определения [5] и снижение его стоимости в связи с дешевизной полученного препарата АО из мутанта H. polymorphaа-105г1 catX), способного к синтезу фермента на минеральной среде с глюкозой.
Целью работы было использование ферментного набора «Алкотест» для определения содержания этанола в плодовоягодных винах и соках.
Материалы и методы. В исследованиях использовали фруктовые напитки и соки различных фирм, плодово-ягодные вина «Особое», «Цезарь», «Канелли», «Валь-двейн», «Бабушкина наливка», а также виноподобные напитки «Клубничная бочка», «Медовая липа», «Медовуха» и безалкогольное пиво TESCО.
Определение этанола в пробах проводили с использованием аналитического набора «Алкотест» по методике[3]. В набор входят: Хромоген (сухая смесь 3,3'-, 5,5'--те-траметилбензидина (ТМБ)) — Ферменты (суспензия АО и пероксидазы хрена (ПО) в сульфате аммония) — Стандарт (образцовый раствор этанола концентрацией 10 г/л)-0,8 МНС1 — реактив для остановки реакции.
Для получения АО — компонента набора «Алкотест» использовали безкаталазный мутантный штамм метилотрофных дрожжей с нарушенной глюкозной катаболитной репрессией H. polymorphaа-105г1 catX).
Разведения анализированных проб вин (250х, 500х, 750х, 1000х, 1250х или 1500х) выполняли в зависимости от содержания этанола. Реакцию проводили во временном режиме. К 100 мкл каждого разведения пробы добавляли 3,5 мл смеси хромогена с ферментами с интервалом 15 сек. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 0,8 МНС1 в той же последовательности и временном интервале. В каждой серии выполняли также «слепые» пробы (добавление воды вместо пробы исследуемого материала) и образцовые пробы (добавление стандартного раствора этанола вместо исследуемого материала). Оптическую плот-
ность определяли при длине волны 450 нм против «слепой» пробы.
Кроме обычного определения содержания этанола в пробах методом АОП с использованием набора «Алкотест» применяли также ее модификацию «Метод стандартных добавок» (МСД). Методика эта заключалась в добавлении к определенной аликвоте (100 мкл) исследуемого вина в разведении 500х различных количеств стандарта этанола (для внутренней калибровки на фоне исследуемой пробы) и последующим определении этанола.
Для сравнения результатов, полученных по методу АОП в модификации МСД, использовали методику газовой хроматографии (ГХ): хроматограф LCM-80, колонка 200×0,3 см, детектор — катарометр. К пенициллиновому флакону с 0,5 мл 50% трих-лоруксусной кислоты (ТХУ) добавляли 0,5 мл исследуемой пробы, флакон закрывали и встряхивали. Затем шприцом добавляли 0,3 мл 30% нитрита натрия и после перемешивания 2 мл газовой фазы вводили в хроматограф. В качестве внутреннего стандарта использовали пропанол. 2 мл 4%% (г/л) пропанола смешивали с 2 мл исследуемои пробы и 1 мл смеси добавляли во флакон с
0,5 мл 50% ТХУ, закрывали и шприцом добавляли 0,3 мл 30% №N0^ После 1 мин перемешивания 2 мл газовой фазы вводили в хроматограф. Для калибровочной кривой использовали 1, 2, 3, 4 i 6% водный раствор этанола, концентрацию которого определяли по высоте пиков азотистого этила.
Результаты и обсуждение. Использование метода АОП для анализа содержания этанола не требует дистилляции алкоголя, которая могла бы элиминировать компоненты вина или сока, отрицательно влияющие на ход энзиматической реакции. К таким компонентам вин принадлежат, например, фенолы, нарушающие действие ферментов, восстанавливающие вещества, а также пигменты, наличие которых может приводить к неправильным результатам.
Красные виноградные вина содержат высокие концентрации фенолов, которые могут окисляться перекисью водорода, возникающей в реакции АО с этанолом в присут-
ствии пероксидазы. В этом случае реакция окисления хромогена ТМБ пероксидазой может конкурировать с реакцией окисления фенолов вина и приводить к ошибочным выводам. Для подтверждения возможного отрицательного влияния специфического химического состава различных напитков на результаты определения этанола, были проведены специальные исследования.
Проведено определение содержания алкоголя в изучаемых винах со стандартным использованием аналитического ферментативного набора «Алкотест». Как видно из данных, представленных на рис. 1 и 2, не выявлено существенного отрицательного влияния химического состава вина на рассчитанное содержание алкоголя, так как в случае меньшего разведения, когда можно было ожидать наибольшего отрицательного влияния компонентов напитков на ход ферментативного определения, эти концентрации почти не уменьшаются. Наоборот, наблюдается уменьшение рассчитанного количества этанола по мере разведения.
-Вино земляничное «Особое»
# Вино вишневое «Особое»
А Вино вишневое «Цезарь»
И Вино земляничное «Вальдвейн»
Разведение
Рис. 1. Определяемая концентрация этанола в красных плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб.
В дальнейшем проведено сравнение результатов определения содержания алкоголя в красных и белых плодово-ягодных ви-
-Вино «Бабушкинаналивка»
— Вино персиковое «Канелли»
— Калибровочная кривая
— Кривая: стандартная конц. этанола + 100 мкл еевляничного вина «Особое»
РаЗЕ5(СДенИС!
Рис. 2. Определяемая концентрация этанола в белых плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб.
Калибровочная кривая
Кривая: стандартная конц. этанола + 100 мкл персикового вина «Канелли»
ЕсдиаЫоп у= а +1й& lt-
Аф. Ри^иаге 0,99 871
Уаіие 51аггіаг& lt-1Еггог
А ІгНегсері 0,288 —
В 5Ьре 1,67 911 0,3 246
0,2 0,4 0,6 0,8
Содержание этанола, г/л
Рис. 3. Определение этанола в белом персиковом вине «Канелли& quot- методом МСД
Определение этанола в плодово — ягодных АОП, МСД, ГХ
Содержание этанола, г/л
Рис. 4. Определение этанола в красном земляничном вине «Особое& quot- методом МСД
нах, полученные при помощи классической методики АОП и ее модификации МСД (рис. 3, 4)
Линейность для двух использованных методик была весьма высока (коэффициенты линейной регрессии составляли, соответственно, 0,9976 при р& lt-0,0001 для красных и 0,9974 при р& lt-0,0001 для белых плодовоягодных вин).
Калибровочные кривые для классической методики и ее модификации МСД имели подобные значения наклона: 1,679 и 1,845 — для плодово-ягодных красных вин и 1,678 и 1,845 — для белых вин.
Различия в калибровочных коэффициентах для классической методики и методики МСД не превышали 9,0%. Концентрации этанола, полученные в случае применения обеих методик подобны (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что наличие ингибирующих веществ в плодово-ягодных красных и белых винах оказывают незначительное действие на ход реакции окисления ТМБ пероксидазой.
Таблица 1
винах различными методами: стандартным
Метод Вино Содержание этанола, % Разница, %
АОП мсд ГХ АОП- ГХ МСД-ГХ
Вино персиковое «Канелли& quot- 9,80 8,63 9,02 +8,0 -4,5
Вино земляничное «Особое& quot- 9,22 9,94 8,52 +7,6 +14,0
В дальнейшем был проведен анализ содержания алкоголя в изучаемых пробах при помощи ГХ, которая показала незначительные различия данных о концентрации этанола. Содержание этанола, определенное техникой ГХ, в пробах красного и белого вина составляло, соответственно, 8,52% и9,02%, тогда как в модификации МСД для красного вина составляло 9,94%, а для белого 8,63%. В табл. 1 сопоставлены все методы, которые применялись для определения концентрации алкоголя в красных и белых плодово-ягодных винах. Сравнение различий результатов, полученных классической методикой АОП и ее модификацией МСД по отношению к ГХ показало, что МСД не характеризуется лучшей корреляцией результатов по сравнению с классической АОП. В связи с изложенным, можно утверждать, что для серийных определений алкоголя в плодово-ягодных винах (белых и красных) оправданно использование менее трудоемкого классического варианта анализа, который не требует внутренней калибровки.
Для определения содержания алкоголя в соках и безалкогольных напитках с целью увеличения чувствительности метода проводили анализ с 5-кратно увеличенным содержанием ферментов. При использовании классического варианта метода АОП, линейность калибровочной кривой сохранялась до концентрации аналита 0,9 г/л (рис. 5). При 5-кратном увеличении содержания ферментов (АО и ПО) в реакционной смеси отмечалось также 5-кратное увеличение наклона калибровочной кривой (8,02 по
А
Содержание этанола, г/л
В
Содержакие этанола, г/л
Рис. 5. Калибровочная кривая для определения этанола методом АОП. А -стандартные условия- В — вариант с использованием 5-кратной концентрации ферментов.
Таблица 2
Содержание этанола в соках и безалкогольных напитках, определенное стандартным методом АОП и с использованием 5-кратной концентрации энзимов
Содержание этанола (%) Соки и безалкогольные напитки
Клубничный напиток «Каппи& quot- Яблочный сок «Фортуна& quot- Малиновый сок «Карми& quot- Пиво безалкогольное ,^СО& quot-
Стандартный метод АОП 0,035 0,024 0,009 0,005
5-кратная концентрация энзимов 0,068 0,043 0,022 0,049
сравнению с 1,61). При использовании такого варианта метода в исследуемых соках и безалкогольных напитках обнаруживались следовые количества алкоголя, что невозможно при использовании стандартной методики. Таким образом, этот вариант метода несмотря на использование большего количества ферментов является в 5 раз более чувствительным (табл. 2).
Преимуществами ферментативного метода АОП с использованием набора «Алкотест» являются хорошие аналитические свойства, высокая стабильность и воспроизведение результатов, что позволяет использовать этот набор для контроля содержания алкоголя в плодово-ягодных красных и белых винах, а также, в соках и безалкогольных напитках.
Заключение
Проведенные исследования показали, что ферментативный метод АОП с использованием набора «Алкотест» позволяет с высокой точностью определять содержание этанола в красных и белых плодово-ягодных винах, соках и безалкогольных напитках. Методу свойственна высокая чувствительность и хорошая линейность в широком диапазоне концентраций аналита. Применение метода значительно облегчает определение содержания этанола, а анализ требует меньших затрат времени и труда. Использованный метод значительно дешевле по сравнению с другими ферментативными методами благодаря низкой стоимости препарата АО, полученной из мутантного штамма метило-трофных дрожжей H. polymorpha С-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной репрессией синтеза АО и блоком каталазы.
Сравнение классической методики АОП и ее модификации МСД показало отсутствие существенного влияния ингибирующих компонентов, наличие которых могло
отрицательно сказываться на результатах определения этанола. Сравнение методики МСД с методом ГХ показало незначительные отличия в содержании этанола в исследуемых продуктах. 5-кратное увеличение содержания ферментов по сравнению с классической АОП-методикой позволяет обнаруживать следовые количества этанола в фруктово-ягодных соках, напитках и безалкогольном пиве.
Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования метода АОП для анализа этанола в алкогольных и безалкогольных напитках, соках и вине. Использование этого метода облегчает анализ этанола по сравнению с традиционными методами -рефрактометрическим и ареометрическим.
Библиографический список
1. Методы технохимического и микробиологического контроля в виноделии // Под ред. Г. Г. Валуйко. М: Пищевая промышленность, 1980. — 145 с.
2. JainN.C., Cravey R.H. Analysis of alcohol. II. A review of gas chromatographic methods // J. Chromatogr. Sci. — 1972. — V. 10. — P. 263−267.
3. Gonchar M., Maidan M., Pavlishko H., Sibirny A. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages // Food Technol. Biotechnol. — 2001. — V. 39. — P. 37−42.
4. Гончар М. В., Майдан М. М., Сибірний А. А. Способ кількісного визначення перекису водню та субстратів оксидаз у біологічних об& quot-єктах // Патент України 10 752.
— 1996. — Бюлл. № 4.
5. Гончар М. В., Сибирный А. А. Способ определения пероксидазной активности биологических объектов// Авторское свидетельство СССР 1 636 773. Бюлл. Изобретений
— 1991. — Т. 11.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой