Производные 5-ариламиноурацила как потенциальные фармакологические агенты двойного действия

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 577.1 13. 3
Производные 5-ариламиноурацила как потенциальные фармакологические агенты двойного действия
Е. С. Матюгина1, М. С. Новиков2, Д. А. Бабков2, В. Т. Валуев-Элистон1, К. Ванпуль3, С. Зикари3, А. Корона4, Е. Трамонтано4, Л. Марголис3*, А. Л. Хандажинская1**, С. Н. Кочетков1 1Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, 119 991, Москва, ул. Вавилова, 32
2Волгоградский государственный медицинский университет, 400 131, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1
3Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20 892, USA
4Department of Life and Environmental Sciences, University of Cagliari, Monserrato, 9 042, Italy *E-mail: margolil@helix. nih. gov & quot-E-mail: khandazhinskaya@bk. ru Поступила в редакцию 27. 01. 2015
РЕФЕРАТ Показано, что производные 5-ариламиноурацила, ранее продемонстрировавшие способность в концентрации 5−40 мкг/мл ингибировать рост Mycobacterium tuberculosis, являются также неконкурентными ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ-1, не проявляющими токсичности in vitro (на клетках МТ-4) и ex vivo (ткань миндалин человека).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА производные 5-(фениламино)урацила, 5'--норкарбоциклические аналоги нуклеозидов, сочетанные инфекции ВИЧ и Mycobacterium tuberculosis, двойное действие.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ — вирус иммунодефицита человека- ТБ — туберкулез- ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения- СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита- ННИОТ ВИЧ — ненуклео-зидный ингибитор обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека.
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день ВИЧ-инфекция и туберкулез (ТБ) считаются основными причинами смертности от инфекционных заболеваний в мире. Согласно последним оценкам ВОЗ, в 2013 году туберкулезом заболели 9 млн человек, умерли — 1.5 млн (из них у 360 000 ТБ был ассоциирован с ВИЧ) [1]. В 2013 году в мире насчитывалось 35 млн больных СПИДом. В 2013 году ВИЧ-инфекция была выявлена у 2.1 млн человек, от СПИДа умерли 1.5 млн, причем ТБ остается основной причиной смерти больных с двойным инфицированием (66. 5%) [2]. У ВИЧ-инфицированных повышен риск реактивации латентной формы туберкулеза (50% по сравнению с 10%), у больных ТБ ВИЧ-инфицированных отмечается высокий риск летального исхода. ВИЧ-инфицированные лица, принимающие противотуберкулезные препараты в стандартном 6-месячном режиме, имеют больший риск развития рецидива, чем
больные туберкулезом, получающие более длительный курс терапии [3]. Таким образом, одновременное заражение ТБ и ВИЧ представляет собой очень серьезную проблему и делает актуальным поиск препаратов двойного действия.
Недавно нами было показано, что определенные производные 5-ариламиноурацила обладают способностью влиять на активное деление клеток Mycobacterium tuberculosis. Полное ингибирование роста микобактерий соединениями (2), (3), (6), (7), (10), (15)-(17) и (19) (рис. 1) наблюдалось в концентрациях 5−40 мкг/мл, причем одно из них (19) проявило более высокую активность против штамма MS-115 с множественной лекарственной устойчивостью, включая пять основных противотуберкулезных препаратов первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол и пиразинамид), чем в отношении чувствительного лабораторного штамма H37Rv [4].
HN
сА-х
н
R
(1)-(8): Х = СН- (9)-(10): Х = N
(1): R = Н- (2): R = 3-Me- (3): R = 4-Me-
(4): R = 2,3-Me2- (5): R = 2,5-Me2-
(6): R = 4-nBu- (7): R = 4-nBuO-
(8): R = 4-PhO- (9): R = H- (10): R = 4-nBu
Рисунок 1.
(11): R = H- (12): R = Me- (13): R: (14): R = nBuO- (15): R = PhO
: nBu- (16): R = H- (17): R = Me- (18): R = nBu- (19): R = nBuO- (20): R = PhO
Данная работа посвящена оценке производных 5-ариламиноурацила в качестве ННИОТ ВИЧ и более детальному изучению токсичности представителей соединений данной группы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Соединения (1)-(20) были синтезированы как описано ранее [4].
1-(4'--Гидрокси-2'--циклопентен-1'--ил)-3-бензил-5-(фениламино)урацил (21)
К раствору соединения (11) (50 мг, 0. 18 ммоль) в 5 мл диметилформамида (ДМФА) добавляли К2С03 (36 мг, 0. 26 ммоль) и ВпВг (42 мкл, 0. 35 ммоль). Реакционную массу перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали при помощи ТСХ. Растворитель удаляли в вакууме масляного насоса. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюировали системой СНС13-СН3ОН (98: 2). Получили 43 мг продукта (21) (66%) в виде желтоватого порошка. R/ = 0. 32 (СНС13-СН3ОН, 98: 2). *Н-ЯМР (СНС13): 7. 50−7. 49 (2Н, м, Н3, Н5-Вп), 7. 32−7. 23 (6Н, м, Н2″, Н3″ Н5″, Н6″, Н2, Н6-Вп3, 6. 95−6. 93 (2Н, м, Н5, Н4-Вп), 6. 90−6. 88 (1Н, т, НД 6. 206. 18 (1Н, м, Н2,), 6. 01 (1Н, с, NH), 5. 84−5. 82 (1Н, м, Н3,), 5. 61−5. 58 (1Н, м, Нг), 5. 23−5. 16 (2Н, д, J = 13. 70, СН2), 4. 84−4. 83 (1Н, м, Н4,), 2. 86−2. 85 (1Н, м, На5,), 1. 70−1. 66 (1Н, м, НЬ5,). 13С-ЯМР (СНС13): 160. 80, 149. 7:3 (С-4, С-2), 142. 34 (С-4& quot-), 139. 24 (С-2'-), 138. 19 (С-4 Вп), 132. 40 (С-3'-), 129. 63 (С-3& quot-, С-5& quot-), 129. 34 (С-3, С-5 Вп), 128. 63 (С-2& quot-, С-6& quot-), 127. 91 (С-1& quot-), 121. 18 (С-1 Вп), 119. 50 (С-5), 117. 19 (С-6), 113. 11 (С-2, С-6, Вп), 74. 99 (С-1'-), 61. 05 (С-4'-), 45. 49 (С-5'-), 39. 94 (СН2).
1-(4'--Гидрокси-2'--циклопентен-1'--ил)-3-бензил-5-(п-метилфениламино)урацил (22)
Синтез проводили аналогично (21) исходя из соединения (12). Получили 35 мг продукта (22) (68%) в виде бело-желтого порошка. R/ = 0. 43 (СНС13-СН3ОН, 98: 2). *Н-ЯМР (СНС13): 7. 50 -7. 48 (2Н, м, Н3, Н5-Вп), 7. 31−7. 23 (4Н, м, Н2, Н4, Н6-Вп, Н5), 7. 06−7. 04 (2Н, м, Н_", Н5″), 6. 87−6. 85 (2Н, м, Н2″, Н6″), 6. 18−6. 16 (1Н, м,
H2,), 5. 94 (1Н, с, NH), 5. 83−5. 81 (1H, м, H3,), 5. 58−5. 56 (1H, м, Hr), 5. 23−5. 16 (2H, д, J = 13. 76, СН2), 4. 84−4. 82 (1H, м, H4,), 2. 87−2. 83 (1H, м, HJ, 2. 26 (3Н, с, СН3),
1. 69−1. 65 (1H,
H
3С-ЯМР (CHCl3): 160. 75, 149. 66
(C-4, C-2), 139. 57 (C-4& quot-), 139. 14 (C-2'-), 138. 19 (C-4 Bn), 132. 40 (C-3'-), 130. 14 (C-3& quot-, C-5& quot-), 129. 33 (C-3, C-5, Bn), 128. 67 (C-2& quot-, C-6& quot-), 127. 88 (C-1& quot-), 120. 23 (C-1, Bn), 117. 86 (C-2, C-6, Bn), 117. 66 (C-5), 114. 39 (C-6), 75. 02 (C-1'-), 61. 12 (C-4'-), 45. 45 (C-5'-), 39. 94 (CH2), 20. 76 (СН3).
Анти-ВИЧ-активность
Выделение рекомбинантной обратной транскрипта-зы ВИЧ-1 (гетеродимер р66/р51) и определение ее активности проводили как описано ранее [5, 6]. В качестве количественной характеристики ингибитор-ной активности соединений использовали константу ингибирования (К), рассчитанную по методу Диксона [7], для неконкурентных ингибиторов. В качестве контроля использовали ННИОТ первого поколения -невирапин.
Цитотоксичность in vitro
Препараты испытывали на цитотоксичность на культурах клеток МТ-4 с использованием автоматической системы подсчета клеток (ChemoMetec). Число жизнеспособных и мертвых клеток подсчитывали в контрольных и обработанных препаратами (6), (7) или (19) культурах. Препараты (6) и (7) тестировали в концентрациях 0. 136−33 мкМ (0. 035−9 мкг/мл), а препарат (19) — в концентрациях 0. 272−66 мкМ (0. 119−28 мкг/мл).
Жизнеспособные и мертвые клетки различали по накоплению йодата пропидия согласно инструкции производителя. Данные накапливали и анализировали с помощью программы Nucleoview (версия 1.0 ChemoMetec).
Токсичность ex vivo
Цитотоксичность препаратов (6), (7) и (19) определяли в тканях миндалин человека. Для каждой экспериментальной точки 27 тканевых фрагментов инкубировали с препаратом (19) (20 мкг/мл)
или с препаратами (6) или (7) (5 мкг/мл). Фрагменты ткани культивировали в течение 12 дней. Затем из контрольных и опытных образцов выделяли клетки, которые окрашивали комбинациями флуоресцентно меченных антител против CD3-QD605, CD4-QD655, CD8-QD705, CD25-APC, CD38-PE, HLA-DR-APC-Cy7, CXCR4-Brilliant violet 421, CCR5-PR-Cy5 CD45RA-FITC и CCR7-PE-Cy7 (Caltag Laboratories- Biolegend). Количество клеток различных фенотипов в выделенных суспензиях определяли с помощью проточной цитофлуороме-трии как описано ранее [8]. Объем анализированной суспензии контролировали с помощью бусинок Trucount (Becton Dickinson), подсчитанное число клеток нормировали по весу тканевых фрагментов, из которых они были выделены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структурное подобие соединений (1)-(20) синтезированным нами ранее производным урацила, которые являются ННИОТ ВИЧ [9, 10], дало нам основание предположить, что и эти вещества могут обладать сходными свойствами. Соединения (1)-(20) принадлежат к двум группам: (1)-(10) представляют собой 5-ариламинопроизводные урацила, а (11)-(20) содержат один или два дополнительных 4'--гидроксици-клопентеновых фрагмента и могут, таким образом, рассматриваться как 5'--норкарбоциклические аналоги 2'-, 3'--дидезокси-2'-, 3'--уридина. Несмотря на известную структурную близость с нуклеозидами, 5'--норкарбоциклические аналоги способны ингиби-ровать обратную транскриптазу ВИЧ по неконкурентному механизму, связываясь в так называемом гидрофобном «центре связывания ненуклеозидных ингибиторов» [9, 10]. Однако соединения (1)-(20), ин-гибирующие рост M. tuberculosis, не обладали способностью ингибировать обратную транскриптазу ВИЧ-1 (К. & gt->- 200 мкМ). Единственным исключением стало соединение (15) (К. = 119 мкМ), относящееся к классу 5'--норкарбоциклических аналогов уридина.
С целью повышения анти-ВИЧ-активности представителей данного класса путем увеличения их гидрофобности были синтезированы N3-бензилпроизводные (21) и (22) (рис. 2). Эти соединения были получены с приемлемыми выходами (61−69%) реакцией исходных карбоциклических аналогов (11) и (12) с бензилбромидом в присутствии поташа. Структуры и чистота синтезированных соединений были подтверждены методами: Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии и ТСХ. Ингибиторная активность производного (22) в отношении обратной транскриптазы ВИЧ-1 оказалась несколько выше, чем у (21) (К. = 60 и & gt-100 мкМ соответственно) и исходных соединений (11) и (12).
(11): R = H
(12): R = Me
Рисунок 2.
(21): R = H
(22): R = Me
Ранее мы оценили цитотоксичность синтезированных соединений на культурах клеток Vero, A549, Huh7 и показали, что они нетоксичны вплоть до концентрации 50 мкг/мл (CD50 & gt->- 100 мкМ). Токсичность соединений (6), (7) и (19), проявивших наиболее выраженные противотуберкулезные свойства, мы дополнительно исследовали in vitro на культуре клеток МТ-4 и ex vivo на системе ткани миндалин человека.
На клетках МТ-4 соединения не проявили ни цито-токсических, ни цитостатических свойств в концентрациях вплоть до максимальных: 66 мкМ для (19), 33 мкМ для (6) и (7).
Оценка цитотоксичности соединений (20 мкг/мл для (19) и 5 мкг/мл для (6) и (7)) на разных типах клеток в тканевой системе показала отсутствие существенной гибели T-клеток (CD3 +), B-клеток (CD3-), CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, а также подгрупп CD4+ лимфоцитов: наивных (CD45RA+/ CCR7 +), центральных клеток памяти (CD45RA-/ CCR7+), эффекторных клеток памяти (CD45RA-/ CCR7-), дифференцированных эффекторных клеток памяти (Temra, CD45RA+/CCR7-), а также актированных CD4+ Т-лимфоцитов. Последние определяли как CD4+/CD25+, CD4+/CD38+ Т-клетки или CD4+/HLA-DR+. Во всех этих группах число клеток в обработанных препаратами и контрольных тканях не различалось.
Таким образом, хотя новые производные 5-ари-ламиноурацила и не показали значительной анти-ВИЧ-активности, однако, даже слабая активность соединений (15) и (22) говорит о наличии их сродства к обратной транскриптазе ВИЧ-1. Структурное подобие соединений такого типа многим высокоактивным противовирусным агентам ненуклеозидной природы, применяемым при ВИЧ-инфекции в качестве компонентов комплексной высокоинтенсивной антире-тровирусной терапии [11], в сочетании с выраженной противотуберкулезной активностью делает их интересными для дальнейших модификаций. •
Работа поддержана в рамках проекта № 13−04−91 441 НИЗ совместной программы РФФИ — Национальные институты здоровья (США) и проекта РФФИ № 13−04−742.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Global tuberculosis report 2014. WHO. http: //www. who. int/ tb/publications/global_report/gtbr14_executive_summary. pdf? ua=1
2. Global HIV report 2014. WHO. http: //www. who. int/hiv/data/ epi_core_dec2014. png? ua=1.
3. Nahid P., Gonzalez L.C., Rudoy I., de Jong B.C., Unger A., Kawamura L.M., Osmond D.H., Hopewell P.C., Daley C.L. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007. V. 175. P. 1199−1206.
4. Matyugina E.S., Novikov M.S., Babkov D.A., Ozerov A.A., Chernousova L.N., Andreevskaya S.A., Smirnova T.G., Karpenko I.L., Chizhov A.O., Muthu P., et al. // Chem. Biol. Drug Design. 2015. Accepted article: DOI: 10. 1111/cbdd. 12 603.
5. Novikov M.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Paramonova M.P., Ivanov A.V., Gavryushov S.A., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Andrei G., et al. // Bioorg. Med. Chem. 2013. V. 21. P. 1150−1158.
6. Le Grice S.F., Gruninger-Leitch F.R. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 307.
7. Dixon M. // Biochem. J. 1953. V. 55. № 1. P. 170−171.
8. Grivel J. -C., Margolis L. // Nature Protocols. 2009. V. 4. P. 256−269.
9. Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Novikov M.S., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Balzarini J., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Med. Chem. Commun. 2013. V. 4. P. 741−748.
10. Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Geisman A.N., Novikov M.S., Chizhov A.O., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Med. Chem. Commun. 2013. V. 4.
P. 1443−1451.
11. Tanaka H., Baba M., Saito S., Miyasaka T., Takashima H., Sekiya K., Ubasawa M., Nitta I., Walker R.T., Nakashima H., et al. // J. Med. Chem. 1991. V. 34. № 4. P. 1508−1511.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой