Красноречивые метаболиты

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Постгеномная история-
N4. -0
Вряд ли сегодня найдется человек, не знающий, что геном — это совокупность всех генов организма определенного биологического вида. Сегодня уже расшифрованы геномы многих простых и сложных организмов — от бактерий до животных и растений, а международный проект «Геном человека» по идентификации и секвенированию полного набора человеческих генов многими учеными признан триумфом биологии XX века. Не умаляя этих действительно выдающихся достижений, следует заметить, что хранящаяся в наших ДНК наследственная информация все
же является лишь «чертежами» сложнейшей живой «машины». Геном организма в течение жизни постоянен и неизменен, причем в каждый момент времени для жизнедеятельности требуется информация, заключенная лишь в небольшой его части.
Как известно, в каждом гене зашифровано строение одного из белков — важнейших функциональных и структурных биомолекул. Избирательная активация тех или иных генов в течение жизни приводит к тому, что количественный и качественный состав белков постоянно меняется, являясь чутким
Каждый
человек
отличается от другого, и с каждым днем отличается сам от себя.
А. Пап
в жизнь
МЕТАБОЛИТЫ У человека-2.4 тыс. типов молекул
РНК
У человека-100 тыс. различных транскриптов
БЕЛКИ
У человека-1 млн типов белков и их вариантов
Новые науки, изучающие совокупности белков и малых биомолекул, хорошо вписываются в центральную догму молекулярной биологии — правило реализации наследственной информации в живом организме: от ДНК к РНК, от РНК — к белку. Они дополнили существававшую иерархию дисциплин — геномики и транскриптомики — наук, изучающих геном и гены, синтез и распределение транскриптов (молекул РНК) в организмах
ДНК У человека-28 тыс. генов
индикатором состояния организма. Этот же принцип распространяется и на малые, более простые органические молекулы, которые образуются в организме в результате протекания различных биохимических процессов, а также попадают в него из внешней среды. Это означает, что наши белковые и метаболические профили в каждый момент времени будут уникальны, а значит, — информативны. Их изучением занимаются новые биологические дисциплины, цель которых не только выявить молекулярные основы заболеваний, но и разработать средства их лечения и профилактики
O.e. ФЕДОРОВА, B.B. КОВАЛЬ
Протеомика-
высокотехнологичная
«РЫБАЛКА»
Мы живем в эпоху, которая регулярно обогащает язык массой новых слов, терминов и понятий. Области знания и информация, наполняющая их, множатся быстрее, чем возможности человека позволяют осознать этот процесс. «Протеомика» -новое направление науки, появившееся совсем недавно. Объектом ее изучения являются белки — «рабочие лошадки» любой клетки. Интерес к этим соединениям вызван не только их огромной ролью в функционировании живых организмов, но и тем, что они могут служить мишенями при создании новых лекарств
Слово «протеин», которым в научной литературе принято обозначать белок (высокомолекулярное органическое соединение, представляющее собой цепочку аминокислот), является производным от греческого prot. eios — «первоначальный». Его этимология точно описывает роль белков в поддержании жизни клетки любого организма — от бактерии до человека.
А вот термин «протеом» знаком, пожалуй, только специалистам. Интересно, что его придумал в 1994 г. австралийский студент М. Уилкинс, пытаясь в своей 0. дипломной работе найти короткое название полному набору человеческих белков вместо неуклюжего словосочетания «все белки, экспрессируемые геномом». Уже на следующий год в научной печати появился термин «proteomics» (протеомика), обозначивший новое направление в молекулярной биологии (Wasinger et al., 1995).
Следует отметить, что само предложение «создать молекулярный белковый атлас человека» было озвучено еще около тридцати лет назад (Anderson, 1985). Но в то время оно было, скорее, пожеланием, технологически невыполнимым. Что же изменилось
за прошедшие десятилетия? Во-первых, была успешно реализована программа по геномике, включающая разработку технологий быстрого секвенирования ДНК, создание баз данных нуклеотидных последовательностей. Вторая предпосылка связана со взрывным развитием инструментальных методов: масс-спектрометрии белков и пептидов (небольших цепочек аминокислот), а также электрофореза и хроматографии, использующихся для разделения органических молекул.
Эти факторы сделали возможным появление новой «высокотехнологичной» биологической дисциплины.
Белковое изобилие
В отличие от геномов, протеомы, т. е. полные наборы белков клетки, представлены активным набором молекул, которые постоянно модифицируются. При этом, если биохимия имеет дело с отдельными выделенными молекулами, то в случае с протеомом мы имеем дело с огромным молекулярным пулом (уместно провести аналогию с рыбой, пойманной на удочку, и рыбным изобилием принесенным неводом).
Из этих положений вытекают цели и задачи науки протеомики. Прежде всего, эта дисциплина отвечает за белковую «систематику» — инвентаризацию всех белков, закодированных в геноме определенного организма, которая предполагает также и построение молекулярных белковых атласов отдельных клеток, органов и тканей.
Однако более интересна и намного более существенна задача (назовем ее «физиологической»), которая заключается в определении принципов взаимодействия между белками, а также в установлении закономерностей регуляции их работы при так называемой пост-
Функциональная, структурная и медицинская
Протеомика — наука молодая, но исследования в этой области уже имеют хорошую организационную поддержку. В 2001 г. была основана «Human Proteome Organisation» (HUPO) — международная организация, которая объединяет и направляет усилия ученых.
На официальной странице HUPO подробно изложены основные направления исследований, перечень которых может многое сказать даже неспециалисту: протеом человека, протеомика мозга, изучение антител, болезни, вызванные нарушениями метаболизма Сахаров, про-
Ключевые слова: белки, нуклеиновые кислоты, ферменты репарации, конформационная динамика, протеомика, метаболомика. Key words: proteins, nucleic acids, repair enzymes, conformational dynamics, proteomics, metabolomics
85
трансляционной модификации (изменении) белков. Это важно для поиска новых маркеров патологических процессов (болезней) в организме человека.
Дело в том, что пост-трансляци-онная модификация белков происходит в клетке уже после их синтеза в ответ на какое-либо внешнее возмущение или болезнь. В результате свойства белков могут быстро измениться, что влияет на скорость их синтеза и деградации. В итоге результат таких процессов отразится на общем профиле белков. Изучая его, можно обнаружить белки, «производство» которых в состоянии болезни отличается от «здоровой нормы». Такие белки могут использоваться в диагностических целях в качестве биомаркеров того или иного заболевания.
Протеомика является классическим образцом междисциплинарной науки: она объединяет биологию, химию, компьютерное моделирование, сложную инструментальную технику
теомика сердечно-сосудистых заболеваний, протеомика стволовых клеток, определение биомаркеров заболеваний, изучение заболеваний человека на мышиных моделях и т. д.
Методологически в протеомике выделяют несколько направлений, главными среди которых являются функциональная, структурная и медицинская (клиническая) протеомика.
О целях функциональной протеомики уже упоминалось выше. Это получение информации о межбелковых взаимодействиях и их влиянии на экспрессию и модуляцию активности генов, а также пост-трансляцион-ную модификацию белков в составе белковых комплексов.
Структурная протеомика, несмотря на то что является классическим направлением исследования белков, тем не менее, продолжает активно развиваться вследствие усовершенствования аналитических методов, таких как новые варианты ЯМР-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и масс-спектрометрии.
Медицинская протеомика — новая и перспективная область биомедицинских исследований, позволяющая адаптировать достижения функциональной протеомики, геномики и биоинформатики в буквальном смысле непосредственно «к жизни», т. е. использовать имеющиеся знания для клинического анализа биологических образцов, взятых у пациентов.
ФЕДОРОВА Ольга Семеновна -доктор химических наук, профессор, заведующая лабораторией исследования модификации биополимеров Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Профессор кафедры молекулярной биологии Новосибирского государственного университета. Автор и соавтор 3 патентов РФ и 118 печатных научных работ
КОВАЛЬ Владимир Васильевич -кандидат химических наук, доцент, старший научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск), старший преподаватель кафедры молекулярной биологии Новосибирского государственного университета. Автор и соавтор 3 патентов РФ и 44 печатных научных работ
-ХЕМА ПРОТЕОМНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
— •
¦ л ¦ ¦

И
Биологический образец

: Щ — в —
щ С
— ПЩ
Ш ЙЙ
Двумерный гель-электрофорез (разделение по массам и заряду)
Обычный гель-электрофорез в одном направлении (разделение по массам)

Вырезание белковых пятен и расщепление белков на фрагменты (пептиды) с помощью фермента трипсина
МАШ1 масс-спектрометрия экстрагированных пептидов
ЕЭ1 масс-спектрометрия пептидов с предварительной хроматографией
Достоинства метода: высокая разрешающая способность- возможность определения мутаций и модификаций в белках- высокая чувствительность анализа, доступность, относительно простая обработка результатов. Недостатки: необходим подбор условий разделения белков, нет автоматизации процесса
Достоинства метода: высокая чувствительность анализа, возможность автоматизации работы, стандартные условия разделения белков. Недостатки: количественный анализ требует использования изотопно-богатых меток
Типичное протеомное исследование проводится в несколько стадий. В настоящее время существуют две почти равные по значимости и частоте использования протеомных методик (А и Б) с использованием разных методов масс-спектрометрии. Выбор зависит от предпочтений исследователя и конкретной задачи, при этом зачастую используют комбинацию обоих подходов.
С помощью масс-спектрометрии определяют массу фрагментов исследуемого белка. Затем по специальной базе данных проводится поиск белка, аминокислотная последовательность которого соответствует полученным результатом. После того как белок определен, уточняются его строение, функции, функционально-важные модификации в молекуле и другие существенные характеристики.
КАК МОЛЕКУЛЫ НАУЧИЛИСЬ «ЛЕТАТЬ»
Современные масс-спектрометрические методы — инструментальная основа протеомики, метаболомики, фар-макокинетики и других «-омик». Что же измеряет масс-спектрометр? Строго говоря, он детектирует не массу молекулы, а соотношение т/г (соотношение массы иона к его заряду). В масс-спект-рометре зачастую одни и те же молекулы могут иметь различные заряды и, соответственно, детектироваться в разное время. Понятно, что не имеющие заряда молекулы (нейтральные) не взаимодействуют с электрическим и (или) магнитным полем и для масс-спектрометра невидимы.
Вся история этой молодой науки пестрит именами Нобелевских лауреатов. Создателем первого масс-спектро-метра заслуженно считают профессора Кембриджского университета Дж. Томпсона (Нобелевская премия по физике 1906 г.), который еще в самом начале XX в. века наблюдал изменения в движении ионов под действием электромагнитного поля. Основываясь на этих наблюдениях, он создал «параболический спектрограф», в котором молекулярные ионы двигались в электрическом поле по параболическим траекториям и детектировались по свечению люминесцентного экрана. Эта работа была развита и усовершенствована коллегой Томпсона профессором Ф. Астоном, который за создание масс-спектрографа был удостоен Нобелевской премии по химии в 1922 г.
Анод
Запирающие пластины
Экран
Катод
Отклоняющие катушки& quot-
Схема первого масс-спектрометра (параболического спектрографа), созданного нобелевским лауреатом Д. Томпсоном. В спектрографе под действием электромагнитного поля ионы двигались по параболическим траекториям и детектировались по свечению люминесцентного экрана. Строго говоря, на этом принципе основана и работа всех электронно-лучевых трубок, которые до недавнего времени использовались во всех экранах телевизоров и мониторов
В это же время профессор Чикагского университета А. Демпстер работал над повышением эффективности ионизации молекул в масс-спектрометре. В 1918 г. он создал масс-спектрометр, в котором молекулы ионизировались под действием направленного потока электронов. Этот метод до настоящего времени является основным для ионизации небольших, легко летучих молекул. Сам же автор использовал прибор для определения изотопного состава элементов. Став полноправным участником «ядерной гонки», он в 1935 г. открыл изотоп урана 235U. Его последователь — профессор Университета Миннесоты А. Ниер стал одним из ключевых участников Манхэттенского проекта: первая атомная бомба была создана из 235U, выделенного Ниером с использованием масс-спектрометра.
Развитие и совершенствование методов разделения-идентификации молекулярных ионов велось в направлении создания физических моделей, позволяющих дискриминировать ионы по их характеристикам. Самый очевидный способ — позволить ионам лететь в вакууме и разделяться по скоростям, как производные массы молекулы. Так, в 1946 г. профессор Университета Пенсильвании У. Стефенс предложил время-пролетную масс-спектрометрию. Этот метод основан на том, что все ионы ускоряются электрическим полем и получают одинаковую кинетическую энергию. Скорость же каждого из них зависит от соотношения т/г, что позволяет легко их определять.
Нобелевский лауреат Ф. Астон работает над усовершенствованием своего масс-спектрометра. 1937 г. © Photographic Archives of the Cavendish Laboratory
Серия пс упарива! микрока
Биополимеры для масс-спектрометрии невозможно ионизовать обычным способом -нагреванием или облучением пучков электронов. При методе ионизации электроспреем образование ионов достигается путем распыления раствора образца через капилляр, находящийся под высоким напряжением (2.5 — 4 кВ). На выходе из капилляра в вакуумную часть масс-спектрометра образуется пучок микрокапель с высоким поверхностным зарядом. Уменьшаясь в размере за счет испарения растворителя, капли движутся в электрическом поле. В какой-то момент, за счет достижения предела Релея, они «взрываются» с образованием более мелких капель. (Предел Релея описывает размер капли, при котором сила отталкивания одноименно заряженных частиц уравновешивается силой поверхностного натяжения жидкости.) В итоге после нескольких серий фрагментации возникают многозарядные ионы.
На фото справа — ионная ловушка для ESI масс-спектрометрии
Альтернативный метод разделения молекулярных ионов в середине 1950-х гг. был предложен профессором Боннского университета В. Паулем. Он разработал метод разделения ионов в переменном электрическом поле, положив начало другому типу масс-спектрометров — ионной ловушке. Квадрупольная ловушка Пауля использует для удержания (разделения) ионов постоянные и переменные (радиочастотные) электрические поля. Хотя точность такого метода по сравнению с время-пролетным масс-спектрометром существенно ниже, он выигрывает в скорости сканирования и ширине динамического диа-
пазона. Поэтому ионные ловушки являются идеальными детекторами для анализа в метаболомике, фармакологии, экологических исследованиях, а их создатель также удостоен Нобелевской премии по физике в 1989 г.
(совместно с X. Демельтом).
***
Масс-спектромер, основы конструкции которого были заложены в 20-х годах прошлого века, успешно используется и в настоящее время. Этот прекрасный лабораторный инструмент, способный очень точно характеризовать как химические элементы, так и небольшие органические молекулы, был и остается неизменным и безотказным помощником химиков-синтетиков. С другой стороны, с помощью традиционных масс-спек-трометров оказалось невозможным проводить анализ биологических макромолекул, поскольку биополимеры невозможно ионизовать и перевести в газообразное состояние нагреванием либо облучением пучков электронов. (Почти каждый из нас убедился в справедливости этого утверждения на своем опыте: яичница, забытая на плите, пригорает к сковородке, а не испаряется.) Широкое использование масс-спектрометрии в изучении структуры и функций белков и пептидов стало возможным лишь благодаря технологическому прорыву, случившемуся в 1980-х гг., когда были разработаны новые, подходящие для биомолекул методы ионизации. В 1983 г. команда профессора Йельского университета Дж. Фенна предложила метод ионизации электроспреем, в котором образование ионов достигалось путем распыления раствора образца при прохождении его через капилляр, на который подается высокое напряжение. В это же время немецкая команда Ф. Хиленкампа пред-
If
I| Щ
ложила метод ионизации органических молекул путем облучения их высушенных образцов ультрафиолетовым лазером. При этом молекулы испарялись и ионизировались вместе с твердым летучим органическим веществом — матрицей. Это было рождение, пожалуй, самого популярного и востребованного в настоящее время метода биологической масс-спектрометрии — MALDI («Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization»). Выбор вещества матрицы и подбор оптимального соотношения вещество/матрица обусловливает чувствительность метода за счет максимально эффективного перевода исследуемого вещества в газообразную фазу. Уже через три года после публикации Хиленкампа сотрудник японской компании «Shimadzu» К. Танака предложил готовое решение для масс-спектрометрии белков массой до 100 кДа — время-пролетный MALDI масс-спектрометр. Справедливости ради нужно отметить, что используемые в нем матрицы были жидкими: белки растворялись в глицерине, в котором были взвешены микрочастицы металлического кобальта. Эти работы отмечены Нобелевским комитетом в 2002 г.: Фенн и Танака разделили премию по химии за развитие мягких методов ионизации биомолекул в масс-спект-рометрии.
***
В современных спектрометрах распространенным анализатором для MALDI является время-пролетный масс-спектрометр. Молекулярные ионы движутся в вакуумированной трубе, и детектора они достигают в порядке увеличения своей массы. Эффективность получения (регистрации) ионов в MALDI масс-спектрометрии зависит от многих параметров:
способа приготовления и очистки образца- количественного соотношения матрицы к анализируемому веществу и правильного выбора материала подложки. Важными условиями получения устойчивого сигнала являются мощность лазерного излучения, выбор «горячей точки» на образце, давление в области ионизации. Для масс-спектрометров с электроспрейным ионным источником в качестве анализаторов наиболее часто используют ионные ловушки. В настоящее время сочетание квадруполя с электроспрейным источником ионов — один из наиболее часто применяемых инструментов в биохимии и метаболомике. Оба масс-спектроскопических метода имеют свои достоинства и недостатки. Во-первых, для них требуется высокая химическая чистота анализируемого вещества. ESI является более «мягким» способом ионизации, чем MALDI. При ESI образуется непрерывный поток ионов, при MALDI — очень ограниченный во времени (до 10 не) пакет ионов- при этом ESI-анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества, MALDI — в 10 раз меньше. Но все эти замечания чисто технические и свидетельствуют лишь о том, что методы масс-спектрометрии биологических молекул сегодня стали доступны и широко используются в научных экспериментах и клинических исследованиях. Кроме того, сильные стороны этих методов хорошо дополняют друг друга, исполняя роль поистине мощного аналитического инструмента. …К настоящему моменту история развития масс-спек-трометрии насчитывает вторую сотню лет. Но лишь совсем недавно, как сказал Джон Фенн в своей Нобелевской лекции, «…молекулярные слоны смогли летать на ионных крыльях».
Лазерный импульс / Ионная оптика: пластины с / ускорящим напряжением
Принцип МАЮ1 масс-спектрометрии основан на десорбции (испарении-ионизации) белковых молекул вместе с твердым летучим органическим веществом — матрицей — под действием коротких лазерных импульсов. Если большие нелетучие молекулы изолированы друг от друга в матрице, то их можно, не разрушив, выбить лазерным импульсом из этого окружения в виде ионов, частично с захватом молекул матрицы, то есть с образованием квазимолекулярных ионов. Сегодня в качестве матрицы используется ряд низкомолекулярных, полярных, легко поддающихся ионизации органических веществ, способных образовывать кристаллы (кристаллоиды) в присутствии белков (пептидов) и инертных по отношению к ним
-Uli
MALDI масс-спектрометр — рабочая лошадка в протеомных исследованиях
Современные достижения
Над поиском протеомных маркеров значимых заболеваний интенсивно работают исследователи всего мира — не только ученые из академических институтов, но и специалисты из исследовательских подразделений крупных и средних фармацевтических компаний.
Уже достигнуты определенные успехи в одной из самых проблемных областей медицины — ранней диагностике тяжелых заболеваний. В первую очередь это относится к раку предстательной железы (Боупе5 еТ а1., 2007- Ьагкт еТ а1., 2010). Диагностика этого широко распространенного заболевания, проводящаяся по наличию в моче пациента белка простатспецифи-ческого антигена, — на сегодняшний день одна из самых ранних и точных.
К настоящему времени достигнуты неплохие результаты и в выявлении маркеров рака молочной железы (МаШеИп еТ а1., 2006- СавТ еТ а1., 2009). Из-за широкой клинической вариабельности этого заболевания в качестве маркеров предлагается использовать набор из 40 белков. Такой белковый профиль позволяет не только с высокой точностью диагностировать заболевание, но и прогнозировать эффективность лечения. Основные диагностические белки этого набора — гаптоглобин, трансферрин, аполипопротеины А-1 и С-1 — уже сегодня используются при диагностике рака молочной железы.
Ведутся исследования и по обнаружению маркеров нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, склерозов различной этиологии и т. д. (Cedazo-Minguez, Winblad, 2010). В этой области основными прогностическими маркерами являются ан-гиогенин (фермент, обеспечивающий рост кровеносных сосудов), креатининкиназа, фибриноген, аполипопро-теин Е (Bowser, Lacomis, 2009)
В Сибири проблемами структурной и функциональной протеомики интенсивно занимаются в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. В результате совместной работы с НИИ Психического здоровья ТНЦ СО РАМН проведена большая работа по поиску белков-маркеров шизофрении.
Этиология и патогенез этой тяжелейшей психической болезни неизвестны. Согласно одной из теорий возникновения шизофрении, в основе заболевания лежит нарушение белкового обмена. Сравнение протеомных профилей статистически достоверной выборки людей, страдающих шизофренией, и протеомных профилей здоровых добровольцев уже позволило исследователям выявить опредленный набор белков в качестве маркеров: аполипопротеин A-II, фосфомевалонат киназу и сериновую (треониновую) киназу. Дальнейшие усилия ученых будут направлены на уточнение роли этих белков в патогенезе болезни и внедрение этих маркеров в клиническую биохимию.
У работы исследователей-протеомщиков огромный потенциал и перспективы. Учитывая то, что в организме человека число различных белковых молекул и их вариантов может составлять миллионы, ученые уверены, что их высокотехнологичная белковая «рыбалка» будет и в дальнейшем гарантированно приносить богатый улов. Успехи последних лет в этой новой биомедицинской области внушают обоснованный оптимизм.
JIumepamypa
Cox J., Mann M. Is proteomics the new genomics? // Cell. 2007. V. 130(3). P. 395−398.
Capelo J.L., Carreira R., Diniz M. et al. Overview on modem approaches to speed up protein identification workflows relying on enzymatic cleavage and mass spectrometry-based techniques //Anal. Chim. Acta. 2009. V. 650. N2. P. 151−159.
Ulrich-Merzenich G., Panek D., Zeitler H. et al. New perspectives for synergy research with the & lt-<-. omic"-technologies //Phytomedicine. 2009. N. 6−7. P. 495−508.
Feng X., Liu X., Luo Q., Liu B.F. Mass spectrometry in systems biology: an overview // Mass Spectrom. Rev. 2008. V. 6. P. 635−660.
А. А. ЧЕРНОНОСОВ
Красноречивые
метаболиты
Примелькавшееся выражение «болезнь легче предупредить, чем лечить» наполняется новым смыслом, когда человек, обратившийся к врачу с запущенной болезнью, вынужден тратить средства, время и нервы на лечение. Задача раннего обнаружения и диагностики заболеваний появилась одновременно с самой медициной. Однако долгое время основными инструментами анализа для врачей были их органы восприятия, а параметрами служили цвет и запах выделяемых жидкостей и общее состояние больного. Сегодня на помощь медицине приходит наука. В данном случае речь идет о метаболомике, занимающейся изучением небольших молекул, являющихся результатом различных биохимических процессов в организме,
в том числе патологических
м
I Ў Шм
етаболомика — область биологии, изучающая так называемый мепшболом, т. е. всю совокупность относительно небольших олекул-метаболитов, функционирующих в живом организме. Очевидно, что состав такого мета-болома тесно связан с геномом и протеомом организма, с составом поступающей пищи, а также с условиями окружающей среды.
Метаболомика органично встраивается в иерархию наук, изучающих геном и гены живых организмов, синтез и распределение транскриптов (молекул РНК), белки и их взаимодействия в живых организмах.
Однако спускаясь вниз по этой иерархической лестнице, мы приходим к парадоксальному открытию: если в связке геном-транскриптом-протеом наблюдается увеличение количества молекул различной структуры, то метаболом (набор всех метаболитов) оценивается гораздо меньшим числом составных частей. Например, если геном человека состоит примерно из 28 тыс. генов, протеом — более чем из 1 млн белков, то метаболом содержит примерно 2400 метаболитов.
Ключевые слова: метаболомика, масс-спектрометрия, маркеры заболеваний. Key words: metabolomics, mass spectrometry, disease markers
ЧЕРНОНОСОВ Александр Анатольевич — кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории исследования модификации биополимеров Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) и старший научный сотрудник лаборатории иммуннобиотехнологии Института экологии человека СО РАН (Кемерово). Автор и соавтор 10 научных работ
Генетика — образ жизни — среда
Почему же количество метаболитов, образующихся в результате биохимических реакций, намного меньше, чем число молекул, ответственных за протекание этих реакций?
Во-первых, метаболиты — это молекулы небольшого размера, уже претерпевшие каскад биохимических превращений, и потому сами по себе достаточно устойчивы к дальнейшим преобразованиям.
Во-вторых, в человеческом геноме, при всех его различиях у разных людей, закодированы одни и те же или очень схожие биохимические процессы, необходимые для жизнедеятельности. Поэтому индивидуальные особенности строения ферментов или других важных составляющих биохимических процессов не должны оказывать существенного влияния на конечные метаболиты, но лишь при том условии, что речь идет о норме.
91
На текущий профиль метаболитов в живом организме оказывает влияние целый ряд факторов -от внутренних (генетических) до внешних (окружающая среда). Эти влияния в совокупности и определяют состояние здоровья человека, информацию о котором можно получить по анализу конечных звеньев метаболических процессов
92
В противном случае такое влияние может приводить к серьезным патологиям или даже нежизнеспособности организма.
При знакомстве с объектами новой науки возникает закономерный вопрос: если число метаболитов относительно невелико, как же их можно использовать для выявления патологий? Ведь если предположить, что каждый метаболит может служить биомаркером, то в этом случае можно идентифицировать не более двух с половиной тысяч болезней, хотя реально их много больше. И это при том, что маркерами могут служить далеко не все метаболиты.
Более того, выделение, идентификация и даже количественное определение отдельных метаболитов, как правило, не позволяют однозначно судить о наличии или отсутствии того или иного заболевания. Но это затруднение преодолимо — метаболиты следует рассматривать не по отдельности, а в комплексе и следить за изменением в составе всего комплекса. При таком подходе любые отклонения от нормы могут служить биомаркерами болезней или неблагоприятных изменений в организме пациента.
Кроме генетической предрасположенности к определенным заболеваниям на здоровье человека влияют его образ жизни, в том числе диета, и окружающая среда. Поэтому последние факторы имеют огромное влияние на текущий уровень метаболитов. При этом в течение жизни их роль возрастает, поскольку со временем они оказывают воздействие уже на всю цепочку биохимических преобразований в организме.
В связи с этим главной целью метаболомики является поиск и характеризация значимых различий в составе
метаболитов между здоровым и любым патологическим состоянием человека, вызванных именно заболеванием.
Для успешного использования различий в составе метаболитов в качестве биомаркеров нужно решить еще одну важнейшую проблему, связанную со статистической достоверностью таких отклонений. Ведь изменения, достаточные для детектирования заболевания у одного пациента, могут быть недостаточными для определения патологии у другого.
Возможна и обратная ситуация: благодаря индивидуальным особенностям состава метаболитов здоровый человек может быть, наоборот, признан больным. Цель метаболомики как раз и состоит в том, чтобы разработать подходы, применение которых корректно не только по отношению к определенному индивидууму, но и для группы, популяции и даже всего вида в целом. Рациональное решение этой проблемы — анализ всего набора метаболитов, но сама по себе эта задача достаточно сложная.
По ступеням анализа
Пациенты, у которых патологические изменения в составе метаболитов детектируются легко и однозначно, обычно являются тяжелобольными и имеют значительные нарушения в обмене веществ.
Большинство же нарушений не так явны. Они обусловлены косвенными эффектами патологического процесса или попытками организма компенсировать изменения в обмене веществ, вызываемые первоначальной патологией. В связи с этим поиск биомаркера
I Обнаружение биомаркера

II Оценка:
Определение структуры маркера.
Проверка правильности анализа.
Подтверждение работы маркера на новом объекте
Практическое применение
III Проверка: Определение точности
Определение устойчивости
анализа к ошибкам.
Опредление ограничений
применения.
Подтверждение
статистической
достоверности
Поиск метаболита-маркера заболевания длителен и сложен.
В ходе предварительного исследования определяют изменения в составе метаболитов при различных состояниях организма: в норме и при патологии, до и после внешнего воздействия окружающей среды или приема лекарств, и проводят сравнительный анализ. В более сложных случаях проводят дополнительные исследования: изучают выборку образцов из разных тканей, определяют состав метаболитов в зависимости от стадии болезни или концентрации применяемых лекарств. В результате выявляют метаболиты-указатели, уровень которых либо понижается, либо повышается при патологических изменениях в организме.
После установления метаболитов-указателей проводится анализ их соответствия основной патологии, а не побочным проявлениям. Только после этого выявленные метаболиты можно считать кандидатами в биомаркеры. Следующий этап — подтверждение правильности и точности работы метаболитов в качестве биомаркеров, определение возможных ограничений для их использования. Подтвердив статистическую достоверность анализа при использовании таких метаболитов, их можно считать доказанными биомаркерами и использовать для решения прикладных задач профилактики и ранней диагностики заболевания
какого-либо заболевания, как правило, длительный и многоступенчатый процесс.
Оборудование и протоколы для определения метаболитов, используемые в подобных исследованиях, должны отвечать ряду требований. Ведь анализируемые метаболиты могут, например, очень сильно различаться по своим физическим свойствам, таким как масса, гидрофобность и т. п.
Не менее сложной является и задача извлечения, идентификации и количественного определения всех метаболитов в биологическом образце. Поскольку результаты должны быть воспроизводимыми даже в том случае, когда сам исследователь еще не знает, ни что это за соединение, ни что оно вообще присутствует в образце. Поэтому, как правило, используется комбинация различных методов выделения и анализа.
Другая существенная проблема в анализе метаболитов — широкий диапазон их концентраций в биологических жидкостях и тканях. Например, концентрация аминокислот в крови составляет от 50 до 500 микромолей, а в спинно-мозговой жидкости она в 100 раз меньше. Впечатляет и сам диапазон концентраций
у отдельных метаболитов: от нано- до миллимолярных (т.е. в 1000 раз больше)!
Существенно упростить методику анализа метаболитов как биомаркеров заболевания позволяет использование масс-спектрометрического оборудования. Особый интерес представляет тандемный масс-спектрометр с электро-спрей системой ввода образца в анализатор (Е8-М8/М8), с помощью которого можно провести анализ в течение нескольких минут.
Детекция небольших, но достоверных изменений состава метаболитов этим методом позволяет определять болезни на самых ранних стадиях, что особенно важно при неонатальном скрининге — обследовании новорожденных детей для выявления наиболее распространенных врожденных и наследственных заболеваний. Метаболомика находит применение при разработке анализов индивидуальной восприимчивости к лекарственным средствам, например, варфарину, при определении уровня проканцерогенов — полиароматических углеводородов и т. д.
Безусловно, разработка и внедрение метаболомных методов анализа в первую очередь происходит для
В исследованиях по метаболомике эффективно используется тандемный масс-спектрометр с электро-спрей системой ввода образца в анализатор (ЕЭ-МЭ/ МЭ) — прибор позволяет провести анализ в течение нескольких минут. Суть методики заключается в объединении процессов очистки раствора образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа. После хроматографии очищенный раствор с исследуемыми метаболитами сразу попадает в масс-спектрометр. Все вещества, находящиеся в растворе, ионизируются и под действием электромагнитного поля попадают на детектор. Соотношение массы и заряда для каждого метаболита уникально, за счет чего происходит дальнейшее разделение молекул во время их движения к детектору. На основании массы молекул можно делать предположение относительно их строения, что позволяет идентифицировать метаболиты
наиболее распространенных заболеваний. К сожалению, пока еще рано говорить, что в распоряжении врачей имеются полностью «готовые» методы анализа метаболитов, прошедших испытание временем и применением в клинике. Поэтому развитие метаболомики как науки, нацеленной на практическое применение в медицине, является актуальной задачей во всем мире.
Разработкой и оптимизацией методов анализа метаболитов занимаются в России. В новосибирском Академгородке на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН совместно с Центром новых медицинских технологий и Институтом экологии человека СО РАН (Кемерово) проводятся исследования, позволяющие упростить анализ и увеличить точность определения врожденных и наследственных заболеваний.
Область возможного применения анализа метаболитов и использования их в качестве биомаркеров практически не ограничена. Развитие метаболомики как науки и успешное внедрение анализа метаболитов в практическую медицину в будущем позволит последней эффективно работать в направлении профилактики заболеваний. Теперь основные усилия по защите здоровья пациентов сосредоточились в рамках совместной работы науки и медицины — тандеме, основанном на инструментальной базе самого высочайшего уровня.
Литература
Hollywood К., Brison D.R., Goodacre R. Metabolomics: current technologies and future trends // Proteomics. 2006. N6(17). P. 4716−4723.
Ellis D.I., Dunn W.B., Griffin J.L. et al. Review etabolic fingerprinting as a diagnostic tool // Phannacogenomics. 2007. N8. P. 1243−1266.
Koulman A., Lane G.A., Harrison S.J., Volmer D. A. From dif ferentiating metabolites to biomarkers // Anal. Bioanal. Chem. 2009. N 394. P. 663−670.
И. В. АЛЕКСЕЕВА
От самого
рождения
Неонатальный скрининг начинается прямо в родильном доме: у каждого новорожденного берется капля крови на специальный тест-бланк, который направляется в медико-генетическую консультацию для проведения исследования. В том случае, если в крови обнаружен маркер заболевания, родители с новорожденным приглашаются в медико-генетическую консультацию для проведения повторного исследования крови с целью подтверждения диагноза и назначения лечения. В дальнейшем ведется постоянное наблюдение за ребенком.
Неонатальный скрининг — это массовое обследование новорожденных детей, один из эффективных способов выявления наиболее распространенных врожденных и наследственных заболеваний. Неоценимый вклад неонатального скрининга в охрану здоровья нации состоит в том, что он позволяет обеспечить раннее выявление заболеваний и их своевременное лечение, а это в свою очередь позволяет предотвратить не только физическое и умственное отставание в развитии, но в некоторых случаях даже смерть
Здоровье будущих поколений
Скрининг новорожденных, призванный выявлять генетические заболевания, берет свое начало с 1962 г., когда Р. Мак-Криди, директор диагностической лаборатории в отделе здравоохранения штата Массачусетс (США), совместно с врачом Р. Гатри организовали сбор бланков из фильтровальной бумаги с сухими пятнами крови, полученной от каждого новорожденного в своем штате. Используя разработанный Гатри микробиологический метод исследования фенилаланина, они проводили тестирование детей на наличие фенилкетонурии. В конце 1960-х гг. подобное тестирование новорожденных стало проводиться почти во всех американских штатах и некоторых странах Европы.
Тогда же началось тестирование и на другие наследственные болезни. Сегодня неонатальный скрининг широко распространен в мире, однако программа, включающая тестирование новорожденных на наличие более десяти заболеваний, была принята только в Японии.
В России с начала 1990-х гг. в обязательном порядке проводится скри-нинг-тест на фенилкетонурию и врожденный гипотиреоз. С 2006 г. перечень диагностируемых заболеваний пополнили адреногенитальный синдром, галактоземия и муковисцидоз.
Ключевые слова: метаболомика, неонатальный скрининг, фенилкетонурия.
Key words: metabolomics, neonatal screening, phenylketonuria
АЛЕКСЕЕВА Ирина Владимировна -младший научный сотрудник лаборатории исследования модификации биополимеров Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор 4 научных работ
Самый быстрый
В основе классического теста Гатри на фенилкетонурию лежит микробиологическая методика: обследуемую кровь добавляют к бактериальной культуре, рост которой тормозят специальным ингибитором. Влияние последнего устраняется, если в крови обследуемого повышена концентрация фенилаланина. Эти концентрации можно оценить путем измерения зон роста микроорганизмов и сравнения их с соответствующими стан-
Gly
Pro
Gin
Ser
Leu
Gin
Val
Glu
Phe
His
Туг
Asp
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
Phe
Pro
Leu
Gly Ala
Ser
Gin
Val
I Met
Tyr
Glu
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
Фенилкетонурия представляет собой генетическое заболевание, связанное с дефицитом фермента фенилаланингидроксилазы (ФАГ), ведущим к накоплению аминокислоты фенилаланина в крови и ее метаболитов в моче. Токсическое воздействие этих продуктов на мозг приводит к серьезным неврологическим нарушениям и умственной отсталости у детей. Основное лечение заключается в назначении специального питания, в котором отсутствует фенилаланин. В зависимости от тяжести заболевания на специальном питании больные должны находиться первые 10 лет, а иногда и более. При своевременно начатом лечении уровень интеллекта таких детей не отличается от уровня у здоровых сверстников.
Средняя частота заболевания составляет примерно один случай на 10 ООО новорожденных. На графике — масс-спектры бутиловых эфиров аминокислот: А — при анализе пятна крови здорового новорожденного- Б — при анализе пятна крови новорожденного с фенилкетонурией. Из анализа данных отчетливо виден не только рост концентрации фенилаланина, но и увеличение соотношения РИеЯуг, что свидетельствует о наличии метаболических нарушений
дартами. Этот достаточно трудоемкий метод широко 96 применялся в 1970—1980-х гг.
Позже для проведения неонатального скрининга стали повсеместно использовать иммуноферментный анализ (иммунологический метод определения и количественного измерения антигенов и антител), а также флуориметрия (хроматография на ионно-обменных смолах с помощью автоматических флуориметров).
Сегодня на смену этим методам приходит более эффективный и быстрый метод тандемной масс-спектрометрии, входящий в арсенал современной метаболомики. Пока масс-спектрометрия является
самым высокочувствительным физико-химическим методом анализа широчайшего спектра соединений. Это позволяет проводить анализ метаболитов в организме младенца уже на вторые-третьи сутки с момента рождения (при традиционных методах анализ проводится на пятые-седьмые сутки) и в случае обнаружения отклонений от нормы назначить необходимое лечение в кратчайшие сроки.
Еще одним немаловажным преимуществом этого метода для неонатального скрининга является быстрота проведения анализа (около 2 мин.) и отсутствие необходимости хроматографичекого разделения анализируемого образца.
H сегодняшний день во многих областях ме-ицины отмечается все более возрастающий нтерес к возможности описания болезней на олекулярном уровне.
Метаболомика — та самая дисциплина, которая обещает добиться прогресса в характеристике различных подтипов болезни и идентификации личных метаболических особенностей и даже предсказать ответ организма на методы лечения. Используя ее подходы, врачи могут не бояться прослыть докторами, которые, по мнению Вольтера, «прописывают лекарства, о которых мало знают, чтобы лечить болезни, о которых знают еще меньше, людям о которых они не знают вообще ничего».
Литература
LukacsZ., Sanier R. Evaluation of electrospray-tandem mass spectrometry for the detection of phenylketonuria and other rare disorders //Mol. Nutr. Food Res. 2006. V. 50. P. 443−450.
Idle J. R., Gonzalez F. J. Metabolomics // Cell Metab. 2007. V. 6(5). P. 348−351.
Baraldi E., Cairaro S., Giordano G. et al. Metabolomics: moving towards personalized medicine // Italian J. Pediatrics. 2009. V. 35(1). P. 30.
Г. И. ЛИФШИЦ, Я. В. НОВИКОВА
Терапия:
персональная доза
¦Ш
I ШШ I
mxrnjjmA? к h
Большинство препаратов, попадая в наш организм, претерпевают ряд сложных химических преобразований, в результате чего реализуется их лечебный эффект. Затем лекарство переходит в неактивную форму и выводится из организма. Понимание механизмов влияния генетических, внешних и индивидуальных факторов на систему биотрансформации лекарств позволит индивидуально подходить к назначению препаратов, что уменьшит количество побочных воздействий, и добиться максимального эффекта от медикаментозной терапии
ЛИФШИЦ Галина Израилевна -доктор медицинских наук, заведующая лабораторией персонализированной медицины Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск), професор Новосибирского государственного университета
Поцесс биотрансформации и выведения лекарс-венных средств из организма осуществляется ерез сложную систему механизмов, тесно свя-анных между собой. Он проходит в несколько стадий: всасывание в кишечнике, изменение структуры препаратов, образование конъюгатов с веществами эндогенного (внутреннего) происхождения и, наконец, сама экскреция — выведение.
Эффективность и безопасность лекарственных средств зависит от характера функционирования участников всех этапов биотрансформации, которыми являются белковые образования, служащие различными ферментами и модуляторами. И если в структуре гена, кодирующего определенный белок, который принимает участие в метаболизме лекарства, имеется мутация, то строение и функция этого белка могут также изме-
Ключевые слова: метаболомика, фармакогенетика, варфарин. Key words: metabolomics, pharmacogenetics, warfarin
НОВИКОВА Яна Владимировна — кандидат медицинских наук, сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Член Ассоциации флебологов России. Автор и соавтор около 50 научных работ
ниться. Соответственно, изменения могу коснуться и активности процессов биотрансформации лекарственного средства на той или иной стадии.
Такие «измененные» гены называют полиморфными. Полиморфный ген представлен в популяции несколькими разновидностями (аллелями), что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. Медикам важно учитывать то, что различия в строении ферментов, участвующих в биотрансформации препарата, а также белков-мишеней могут стать причиной значительных различий в реакции разных пациентов на один и тот же препарат, включая развитие осложнений.
Фармакогенетика — наука, изучающая влияние наследственности на индивидуальную чувствительность к лекарственным средстам. Эта дисциплина позволяет выявить определенные гены, кодирующие белки, которые участвуют в метаболическом пути лекарства. Однако изучение одних лишь генетических особенностей метаболизма не может дать полного представления о процессах биотрансформации лекарственного средства в организме.
В решении этой проблемы способна помочь мета-боломика, целью которой в данном случае является систематизация, идентификация и количественное определение всех метаболитов лекарственного препарата в отдельно взятом организме или биологическом образце. Этих данные позволяют выявить взаимосвязи между различными генетическими вариантами (полиморфизмами) и скоростью метаболизма лекарства. При этом значимые генетические полиморфизмы становятся маркерами, которые уже могут использовать клиницисты для подбора лекарственной терапии при различных заболеваниях.
Все дело в дозе
Наиболее активно технологии фармакогенетики и ме-таболомики применяют для изучения биотрансформации непрямых антикоагулянтов — группы лекарственных препаратов, которые понижают свертываемость крови и препятствуют тромбообразованию. Важный представитель этой фармакологической группы — варфарин, антагонист витамина К — необходимого звена в процессе свертывания крови. Этот препарат жизненно необходим пациентам с нарушениями сердечного ритма, с венозными тромбозами, тромбоэмболиями различной локализации, а также после кардиохирур-гических операций.
Варфарин назначают на длительный срок, иногда пожизненно, при этом прием лекарства чреват развитием различных осложнений, в первую очередь малых и больших кровотечений. Кроме того, в некоторых случаях эффект от лечения варфарином отсутствует, несмотря на увеличение дозы препарата.
Известен ряд факторов, влияющих на степень безопасности и эффективность лечения данным препаратом. К факторам первой группы относятся пол, возраст, масса тела пациента, особенности его питания (например, вегетарианство), сопутствующие заболевания, прием других лекарственных препаратов и т. п. Однако по имеющимся на сегодня данным, эти факторы лишь на 17% объясняют взаимосвязь вариабельности терапевтической дозы варфарина и индивидуального ответа пациента (Caldwell et al., 2008). Что касается роли факторов второй группы — генетических, то оценить ее не так-то просто: для этого нужны данные о метаболизме варфарина в организме пациента.
Под угрозой осложнений
Как и многие другие лекарственные средства, варфарин метаболизируется в печени. В виде неактивных метаболитов он выводится вместе с желчью и попадает в желудочно-кишечный тракт, где всасывается в кровь и затем выводится с мочой.
Варфарин состоит из двух изомеров, отличающихся пространственным расположением атомов и метаболизирующихся разными печеночными ферментами. Терапевтически более активным является в-варфарин (слева)
Основными белками-ферментами, участвующими в процессе метаболизма варфарина, являются печеночные цитохромы системы Р 450 (СУР). Сам препарат состоит из двух изомеров (молекул одинакового химического состава, но отличающихся пространственным расположением атомов), при этом терапевтическая активность з-варфарина намного выше. Основным катализатором метаболизма для него является цитохром С УР2С9: изменение в его активности может значительно влиять на чувствительность пациента к лечению варфарином.
Кроме того, индивидуальная чувствительность к вар-фарину зависит еще от одного небольшого белка, локализованного внутри печеночных клеток — витамин-К эпоксидредуктазного комплекса УКОИС1. Его функция заключается в реактивации витамина К, и именно этот белок и является мишенью для варфарина при осуществлении последним лекарственного воздействия.
Для генов, кодирующих данные белки, известны полиморфизмы, влияющие на скорость метаболизма варфарина и степень чувствительности к нему пациентов. Как правило, изменения в этих генах сопровождаются снижением скорости утилизации лекарства из организма, следовательно, соответствующий рост его концентрации в плазме крови может приводить к возникновению кровотечений.
CYP2C9*2 CYP2C9& quot-
§ f JL VK0RC1: d -в-
cc CT CC TT CC CT CT TT CC CC CT CT TT CC CT CC CC CC
: AA AA AA AA AC AA AC AA AC AA AA AC AA AC AC CC CC CC
CC CC CT CC CC CT CC CT CT TT TT CT TT TT TT CC CT TT
Генотип Дозы варфарина, которые рекомендуют пациентам, зависят от их
генотипических особенностей. По данным литературных источников
Рецепт для генов
В Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Центре новых медицинских технологий в Академгородке с 2008 г. проводится широкое изучение фармакогенетики и фармакокинетики варфарина у пациентов, вынужденных длительное время принимать антикоагулянты. Из лейкоцитов пациентов выделяют ДНК, в которой определяют полиморфные варианты генов СУР2С9 и УКСЖС1. На основании полученных данных можно с уверенностью утверждать, что более половины обследованных являются носителями измененных генов. Это означает, что дозу варфарина для таких пациентов необходимо корректировать относительно стандартно рекомендуемой. Здесь возникает проблема дозировки.
Чтобы точно определить необходимую дозу препарата для конкретного пациента, сначала нужно с помощью масс-спектрометрии определить уровни метаболитов лекарства в организме через равные промежутки времени после приема, а затем построить фармакокинетиче-скую кривую. Однако подобное исследование — сложная и трудоемкая задача, выполняемая обычно только в научно-исследовательских целях.
Доступными методами для использования в повседневной медицинской практике могут служить генетические тесты. Для этого необходимо изучить количественные взаимоотношения между генетическими полиморфизмами и скоростью метаболизма варфарина на группе пациентов с различными генетическими вариациями нужного гена. Подобные исследования проводились ранее среди европейской популяции, но в Сибири они проводятся впервые.
Результаты работы по варфарину с привлечением методов метаболомики и генетики служат примером наиболее эффективного и перспективного подхода в медицине — персонализированного. Подобные исследования помогают подобрать дозу лекарства пациенту с учетом его генетических особенностей, что дает возможность сократить количество побочных эффектов, оптимизировать и минимизировать фармакотерапию и снизить расходы на лечение, а значит, существенно улучшить качество жизни людей.
Литература
Семиголовский Н. Ю. Непрямые антикоагулянты в кардиологии (впечатления о применении варфарина) // Трудный пациент. 2007. № 3. С. 31−37.
Сироткина О. В., Вавилова Т. В., Кадинская М. И. и др. Определение индивидуальной чувствительности к варфарину методоммолекулярно-генетического анализа гена цитохро-ма Р4502С9: Руководство для врачей. СПб.: Издательство СПбГМУ, 2006.
Сычев Д. А. Лечить не болезнь, а больного, или фармако-генетика в действии//Вестн. Моск. городского науч. о-ва терапевтов. 2007. № 14.
Gardiner S.J., BeggE.J. Phannacogenetics, drug-metabolizing enzymes, and clinical practice // Phannacol. Rev. 2006. V. 58. P. 521−590.
Wysowski D. K., Nourjah P., Swartz L. Bleeding complications with warfarin use: a prevalent adverse effect resulting in regulatory action // Arch. Intern. Med. 2007. V. 167. P. 1414−1419.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой