Пролиферативные и иммунологические характеристики молекулярно-биологических подтипов рака молочной железы

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 616−006. 04:577. 2
ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДТИПОВ РАКА МОЛОЧНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ
Новикова И. А., Шатова Ю. С., Златник Е. Ю., Пржедецкий Ю. В., Ульянова Е. П., Черникова Е. Н.
ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону, e-mail: rnioi@list. ru, novikovainna@yahoo. com
Биологическое поведение опухоли, в частности, рака молочной железы (РМЖ), зависит от характеристик ее клеток и от микроокружения. Нами впервые проведено исследование пролиферативных свойств опухолевых клеток и тканевого состава лимфоцитарных субпопуляций в зависимости от молекулярно-био-логического подтипа РМЖ. Показано, что люминальный, А подтип по данным критериям является наиболее благоприятным (минимальное содержание анеуплоидных опухолевых клеток- высокое содержание NK-лимфоцитов). РМЖ Her2+neu подтипа демонстрирует высокое содержание NK-лимфоцитов в периту-маральной зоне, но не в опухоли. Высокое количество анеуплоидных клеток найдено при люминальном В подтипе, клеток в S-фазе — при ТНР. Описанные различия позволяют оценить молекулярно-биологиче-ские подтипы рака молочной железы с ранее не исследованных позиций и ставят задачу изучения возможности прогнозирования течения заболевания с помощью полученных данных.
Ключевые слова: рак молочной железы, молекулярно-биологические подтипы, тканевые лимфоциты, ДНК-цитометрия, пролиферация
PROLIFERATIVE AND IMMUNOLOGIC CHARACTERISTICS OF DIFFERENT BREAST CANCER BIOMOLECULAR SUBTYPES
Novikova I.A., Shatova Y.S., Zlatnik E.Y., Przhedetsky Y.V., Ulianova E.P., Chernikova E.N.
FSBI «Rostov Research Oncological Institute» MHRF, Rostov-on-Don, e-mail: rnioi@list. ru, novikovainna@yahoo. com
Biologic behaviour of malignant tumor (for example, breast carcinoma), depends upon peculiarities of its cells'- properties and microenvironment. Well-known biomolecular subtypes, different in clinical course of the disease, were established on the basis of 4 receptors detected by immunohistochemical test. We carried out complex study of proliferative activity and lymphocytes'- subsets in tumor and peritumoral tissue- comparative characteristics of breast carcinoma subtypes was given according to the studied criteria. Luminal A subtype was shown to be the most favourable having minimal per cent of aneuploid cells while NK-lymphocytes'- content in tumor was the highest. In Her2+/neu carcinoma NK-lymphocytes'- level was high in peritumoral tissue but not in tumor. High proportion of aneuploid cells was found in luminal B subtype and high content of cells in S-phase — in TNR tumors. The described difference may allow to assess breast carcinoma'-s biomolecular subtypes from the new point and to set the task to use the obtained data for its prognosis.
Keywords: breast carcinoma biomolecular subtypes, DNA-cytometry, tissue lymphocytes tumor cells'- proliferation
Биологическое поведение злокачественной опухоли, которое характеризует скорость ее роста, способность к инвазии и распространению, а, в конечном итоге, и прогноз заболевания, зависит от многих причин, связанных как с ее особенностями, так и с эффективностью или неэффективностью системных защитных механизмов, среди которых важное место занимают иммунные. По-видимому, свойства опухоли и реакции иммунной системы организма на нее тесно взаимосвязаны. С учетом значения иммунокомпетентных клеток в процессах апоптоза, пролиферации, неоан-гиогенеза (в частности, через продукцию цитокинов), их роль в микроокружении опухоли представляется существенной, однако, не полностью проясненной.
Рак молочной железы (РМЖ) является самой распространенной злокачественной
опухолью среди женского населения планеты, и, несмотря на то, что его патогенезу, ранней диагностике и разработке новых методов лечения посвящено множество работ, продолжает оставаться актуальнейшей проблемой онкологии и медицины в целом.
Серьезный прорыв в изучении этого заболевания был сделан с появлением новых методов характеристики опухолевых клеток, в частности, иммуногистохимического (ИГХ)-типирования и ДНК-цитометрии. На основании их результатов были выделены молекулярно-биологические подтипы РМЖ и установлено, что они отличаются различным характером течения, по-разному поддаются химиотерапии и имеют неодинаковый прогноз. Молекулярно-генетическая классификация РМЖ, разработанная на основе иммуногистохимического определения четырех маркеров, была одобрена эксперта-
ми Сент-Галленской конференции в 2011 г и уточнена в 2013 г. Эти маркеры (рецепторы эстрогена, прогестерона, Her2+/neu, Ki-67) оцениваются в большинстве работ для решения вопроса о целесообразности назначения гормональной и химиотерапии [6, 7, 8]. Представляется возможной связь подтипов РМЖ с экспрессией опухолевыми клетками рецепторов, характеризующих апоптоз [1]. Согласно данным современной литературы, признаком агрессивного биологического поведения опухоли является анеуплоидия, при которой частота лимфогенного метастази-рования различных опухолей существенно повышается- у больных с анеуплоидными опухолями выше частота рецидивов и короче продолжительность клинической ремиссии. ДНК-цитометрические характеристики опухолевых клеток могут прогнозировать их биологические свойства поведение опухоли в будущем [3, 4]. В немногочисленных сообщениях описана лимфоцитарная инфильтрация при РМЖ [2, 5], но не найдено работ, сопоставляющих молекулярно-биоло-гические подтипы РМЖ с пролиферативны-ми свойствами опухоли и особенностями ее лимфоцитарного микроокружения.
Целью работы является характеристика иммунологического микроокружения и пролиферативных свойств опухоли при различных молекулярно-биологических подтипах РМЖ.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили кровь и ткани опухоли и перитуморальной зоны 49 пациенток различными молекулярно-биологическими подтипами РМЖ- у 16 (32,7%) был определен люминальный, А подтип, у 22 (44,9%) — люминальный В, у 5 — Her2+/ neu (10,2%о), у 6 — ТНР (12,2%о). Гомогенизацию тканей осуществляли с использованием BD Med^a^ine. Анализ экспрессии (не менее 20 000 клеток) проводили на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, USA). Для тестирования и подтверждения оптимальной работы проточного цитометра использовали универсальные биологические частицы DNA QC Particles (BD). Для анализа ДНК в ткани опухоли использовали CycleTEST™PLUS DNA Reagent Kit. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы ModFit LT, позволяющей ана-
лизировать плоидность и распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла и детализировать число клеток в фазах S и G2 + М. Долю клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме вычисляли как процент от общего числа исследованных клеток. Опухоль считали диплоидной, если выявлялся один пик, который соответствовал нормальному содержанию ДНК в ядрах клеток. При наличии пиков, отличающихся от диплоидного, опухоль расценивалась как анеу-плоидная. Для характеристики степени анеуплоидии клеток опухоли вычисляли индекс ДНК (ИДНК), который характеризует отношение интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток (номер канала) к диплоидному. Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали по индексу пролиферации (ИП) — сумме клеток, находящихся в синтетической, постсинтетической фазах цикла и в митозе (S+G2+M).
Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови, ткани опухоли и перитуморальной зоны (ПЗ) оценивали с использованием моноклональных антител панели Т-В-NK (CD3, CD4, CD8, CD19, CD16/56) и CD45. Доля лимфоцитов, положительных по данным маркерам, вычислялась в процентах от общего числа CD45-положительных лимфоцитов. В случае ткани исследовалось не менее 1000 тыс. событий, крови — не менее 30 тыс. событий.
Статистическую обработку результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами (t-критерий Стьюдента, критерий Уилкоксона).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования субпопуляций лимфоцитов в крови и в тканевых образцах представлены в табл. 1, 2. Как видно из табл. 1, ткань опухоли характеризовалась статистически достоверно более высоким содержанием Т-лимфоцитов, преимущественно за счет CD3+CD8+ клеток- при этом процент В- и ПК-клеток в ней был ниже, чем в крови. В ткани ПЗ наблюдались отличия как от крови, так и от опухоли: в ней отмечено более высокое количество CD3+ и CD3+CD8+ клеток и более низкое CD19+ лимфоцитов, чем в крови- процент CD3+CD4+ лимфоцитов был ниже, а уровень CD3+CD16/56+ выше, чем в опухоли.
В табл. 2 приведено сопоставление суб-популяционного состава тканевых лимфоцитов больных при различных молекуляр-но-биологических подтипах РМЖ.
Таблица 1
Субпопуляционный состав лимфоцитов в крови и в тканях больных РМЖ
Исследуемые образцы Субпопуляции лимфоцитов, %
CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD19+ CD16+/56+
Кровь 60,1 ± 4,5 43,3 ± 6,1 20,3 ± 5,36 13,3 ± 4,74 17,5 ± 3,54
Опухоль 85,9 ± 2,36* 42,5 ± 1,98** 34,0 ± 1,9* 2,56 ± 0,5* 8,76 ± 0,83* **
ПЗ 76,0 ± 3,65* 34,7 ± 1,97 39,4 ± 2,76* 3,05 ± 1,17* 15,1 ± 2,9
Примечание: * - статистически достоверные отличия от показателей периферической крови- ** - статистически достоверные отличия от показателя ПЗ (Р & lt- 0,05).
Таблица 2
Субпопуляционный состав лимфоцитов опухоли при различных молекулярно-биологических подтипах РМЖ
Подтипы РМЖ Субпопуляции лимфоцитов, %
CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD19+ CD16+/56+
Люминальный, А 85,5 ± 2,55 45,1 ± 4,0 40,1 ± 3,95 1,82 ± 0,64 10,6 ± 1,73
Люминальный В 88,48 ± 2,16 46,66 ± 3,3 43,9 ± 3,4 3,25 ± 1,1 4,34 ± 1,27*
ТНР 92,2 ± 1,4* 45,0 ± 6,0 40,6 ± 8,33 2,28 ± 0,98 4,13 ± 1,63*
Her2+/neu 88,6 ± 6,5 47,4 ± 3,5 39,8 ± 10,0 1,23 ± 0,5 7,13 ± 4,0
Примечание: * - статистически достоверные отличия от люминального, А подтипа (Р & lt- 0,05).
Как видно из табл. 2, отмечаются некоторые различия по составу субпопуляций лимфоцитов, присутствующих в образцах тканей опухоли в зависимости от молеку-лярно-биологического подтипа РМЖ. Так, в опухолевой ткани максимальное количество СБ3+ клеток оказалось при ТНР, хотя статистически достоверные различия установлены только от люминального, А РМЖ. (Р & lt- 0,05). При люминальном, А РМЖ обнаружен наибольший уровень ПК-клеток в опухолевой ткани, статистически значимо превышающий показатели люминального В и ТНР РМЖ (в обоих случаях Р & lt- 0,05).
При изучении ткани ПЗ обнаружен наиболее высокий уровень ПК-клеток при Нег2+/пеи+ РМЖ по сравнению с другими вариантами заболевания (23,1 ± 4,75%) — кроме того, он был в 3 раза выше, чем в опухолевой ткани этих же больных. В тех же образцах ткани ПЗ количество СБ3+ и СБ3+СБ4+ оказалось ниже, чем в ткани опухоли (70,4 ± 2,6 и 88,6 ± 6,5% для СБ3± 33,1 ± 5,2 и 47,4 ± 3,5% для СБ3+СБ4+ соответственно- в обоих случаях Р & lt- 0,05). Сходные различия между лимфоцитарным составом ткани опухоли и ПЗ отмечены и при люминальном В РМЖ: уровень СБ3+СБ4+ в ткани ПЗ составлял 34,4 ± 4,2%, что статистически достоверно ниже показателя в ткани опухоли (46,66 ± 3,3%) — Р & lt- 0,05.
Результаты исследования ДНК-цитометрических параметров опухолей представлены в табл. 3. Минимальная доля анеуплоидных опухолей выявлена при лю-минальном А, средняя при люминальном В и максимальная при ТНР. Результаты ДНК-цитометрического анализа Нег2+/пеи РМЖ в данную работу не включены. При РМЖ люминального, А подтипа доля анеу-плоидных опухолей составила 12,5%, где 2 из 16 образцов характеризовались уровнем ДНК, отличным от 1,0, тогда как в группе опухолей люминального В подтипа их доля составила 45,5% (10 из 22 опухолей), а в группе ТНР — 50% (3 из 6).
Опухоли с ИДНК менее 1,0 не встретились ни в одном из подтипов анеуплоидно-го РМЖ (люминального А, люминального В, ТНР). В РМЖ люминального, А подтипа ИДНК в среднем составил 1,67 ± 0,2- при люминальном В подтипе ИДНК — от 1,1 до 2,0, в среднем 1,67 ± 0,1- при ТНР подтипе — от 1,49 до 1,76, в среднем 1,63 ± 0,07. Статистически достоверных различий в средних показателях ИНДК между опухолями различных молекулярных подтипов не получено. В опухолях с люминальным, А подтипом в 50% (1 из 2 анеуплоидных опухолей) ИДНК находился в пределах до 1,5- в 50% превышал 1,5. Практически с одинаковой частотой в 30% (3 из 10 ане-уплоидных опухолей) и 33,3% (1 из 3), со-ответственно при РМЖ люминального В и ТНР подтипов отмечено наличие опухолей с ИНДК до 1,5, где превалировали опухоли с индексом ДНК свыше 1,5.
Злокачественные опухоли, как правило, являются гетерогенными, т. е. в одной опухоли могут сочетаться диплоидные и анеуплоидные клетки, и одним из определяющих биологическое поведение опухоли может быть характеристика среднего содержания в ней анеуплоидных клеток. Проведенный анализ выявил, что среднее содержание анеуплоидных клеток в опухолях люминального, А подтипа составило 8,49 ± 0,9%, а в ТНР — 17,6 ± 3,2%. Максимальное содержание анеуплоидных клеток (26,5 ± 2,8%) отмечено в опухолях лю-минального В подтипа, что в 3,1 и 1,5 раза выше, чем в опухолях люминального, А и ТНР подтипов соответственно (Р & lt- 0,05).
Распределение клеток по фазам клеточного цикла опухолей молочной железы лю-минального А, люминального В и ТНР подтипов представлено в табл. 3.
Как видно из табл. 3, в опухолях исследуемых подтипов основная масса клеток находилась в 00/1-фазе клеточного цикла. Статистически достоверной разницы в показателях доли клеток в 00/01- и 02+М-фазах клеточного цикла между различными
молекулярными подтипами не получено. Темпы пролиферации опухолей ТНР молекулярного подтипа, определяемые по доле клеток в S-фазе клеточного цикла, статистически значимо превосходили аналогичный показатель опухолей люминального В подтипа (Р & lt- 0,05). Статистически достоверных различий в темпах пролиферации опухолей люминального, А и люминального В подтипа, а также люминального, А и ТНР молекулярных подтипов не получено, хотя отмечена тенденция к повышению доли клеток в S-фазе опухолей люминального, А подтипа по сравнению с люминальным В.
Таблица 3
Распределение клеток по фазам клеточного цикла при различных молекулярно-биологических подтипах РМЖ (%)
Молекулярно- биологические подтипы Фазы клеточного цикла
G0/G1 G2+M S
Люминальный, А 83,5 ± 5,6 1,18 ± 0,2 15,4 ± 2,4
Люминальный В 88,2 ± 1,9 1,5 ± 0,4 10,8 ± 1,9
ТНР 81,7 ± 5,5 0,9 ± 0,07 18,4 ± 3,3*
Примечание: * - отличия показателей статистически достоверны по отношению к люминальному В подтипу (Р & lt- 0,05).
Пролиферативная активность является одним из ведущих факторов биологического поведения опухоли. При сравнении ИП статистически достоверной разницы при люми-нальном А, люминальном В и ТНР подтипах РМЖ не выявлено, хотя в опухолях ТНР подтипа отмечена тенденция к его повышению в сравнении с люминальными, А и В.
Итак, статистически значимые различия пролиферативных характеристик исследованных молекулярно-биологических подтипов РМЖ были получены только по частоте ане-уплоидии и проценту анеуплоидных опухолевых клеток, а также по количеству клеток в S-фазе клеточного цикла. Данные показатели были минимальны при люминальном, А подтипе. При сравнении люминального В и ТНР подтипов их характеристики анеу-плоидии не различались, но процент клеток в S-фазе был наибольшим в ТНР опухолях, что, по-видимому, и обуславливает их более злокачественное течение.
Лимфоцитарная инфильтрация РМЖ может быть различной, т.к. антигенный его состав неоднороден: наличие или отсутствие экспрессии опухолевыми клетками РЭА, МиС-1, НЬА I и II класса ассоциировано с различной степенью вовлеченности имму-нокомпетентных клеток в противоопухоле-
вый ответ [2]. Нами показаны различия содержания NK-лимфоцитов — эффекторных клеток врожденного иммунитета, участвующих в антиген-независимом лизисе мишеней, в опухолях изученных молекулярно-биологических подтипов РМЖ. Количество этих клеток при люминальном, А подтипе было выше, чем при других. Учитывая, что опухолевые клетки нередко являются HLA-негативными [2], и, следовательно, представляют возможную мишень не для цитотоксических (CD8+) Т -лимфоцитов, прогностическая роль которых описана для HLA-DR позитивных опухолей [5], а именно для натуральных киллеров, мы считаем, что полученные нами данные характеризуют люминальный, А подтип РМЖ как наиболее благоприятный по особенностям его лимфоцитарного окружения. Этот же подтип РМЖ отличается минимальным среди всех содержанием анеуплоидных опухолевых клеток. Люминальный В подтип при наименьшем количестве опухолевых клеток в S-фазе демонстрирует высокую частоту анеуплоидных клеток и опухолей- микроокружение характеризуется низким уровнем NK-клеток и повышением содержания CD3+CD4+ клеток в опухоли по сравнению с ПЗ. ТНР подтип содержит высокое количество опухолевых клеток в S-фазе при высоком содержании анеуплоидных клеток- в окружении находится наибольшее количество T (CD3+) — и низкое — NK-лимфоцитов. РМЖ Her2+/neu подтипа отличается высоким содержанием NK-клеток в перитуморальной зоне, но не в опухоли.
Список литературы
1. Кит О. И., Шатова Ю. С., Новикова И. А., Владимирова Л. Ю., Ульянова Е. П., Комова Е. А., Кечеджиева Э. Э. Экспрессия p53 и BCL2 при различных подтипах рака молочной железы // Фундаментальные исследования. — 2014. — № 10. — С. 85−88.
2. Летягин В. П. Варианты иммунофенотипа рака молочной железы и их клиническое значение для прогноза / В. П. Летягин, Н. Н. Тупицын, Е. В. Артамонова // VII российская онкологическая конференция: матер. конф. — М., 2003. — С. 50−53.
3. Новоселова К. А. Проточная ДНК-цитометрия в прогнозировании течения злокачественных лимфом / К. А. Новоселова, И. Б. Лысенко, И. А. Новикова // Сибирский онкологический журнал. — 2012. — Прилож. № 1. — С. 114.
4. Опыт применения проточной ДНК-цитометрии для прогнозирования течения злокачественных новообразований / Т. Г. Николаева, Я. В. Добрынин, В. П. Летягин и др. // Вестник Российской Академии медицинских наук: ежемесячный научно-теоретический журнал. — 2002. — № 1. — С. 45−49.
5. Шамилов Ф. А. Субпопуляции интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы // Онкология. -2012. — № 2. — С. 60−65.
6. Ki 67 index, HER-2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer / M.C.U. Cheang, S.K. Chia, D. Voduc, D. Gao, S. Leung, J. Snider et al. //. Journal of the National Cancer Institute. — 2009. — № 101. — P. 736−750.
7. Molecular portraits of human breast tumors / C.M. Perou, T. Sorlie, M.B. Eisen, M. Rijn, S.S. Jeffrey, C.A. Rees et al. // Nature. — 2000. — № 406. — P. 747−752.
8. Subtyping of breast cancer by immnohistochemistry to investigate a relationship between subtype and short and long term survival: a collaborative analysis of data for 10,159 cases from 12 studies / F.M. Blows, K.E. Driver, M.K. Schmidt, A. Broeks, F.E. Leeuwen, J. Wesselling et al. // PLos Med. -2010. — № 7. — Р. 279.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой